專利名稱:糖肽抗生素的制備方法
本發(fā)明涉及萬古霉素族中一類新型的糖肽抗生素，尤其是抗生素A82846，及其個(gè)別的組份A82846A，A82846B，A82846C，以及通過微生物新菌株的培養(yǎng)來制備該類抗生素的方法。
雖然在今天去獲得許多有用抗生素已不成問題，但是為人類醫(yī)藥事業(yè)而尋找更有效的抗生素仍有必要。例如萬古霉素就是一個(gè)十分成功且商品化了的抗生素，它已拯救了無數(shù)的生命，但是萬古霉素也存在一些問題，例如它可以引起耳毒性和腎毒性。于是迫切需要尋找一種具有像萬古霉素那樣的活性，但其藥效有所改善或者副作用較小的抗生素。
依照本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)具有很大價(jià)值的糖肽抗生素可以通過東方諾卡氏菌NRRL 18098，NRRL 18099或NRRL 18100在液面下進(jìn)行需氧發(fā)酵來生產(chǎn)，培養(yǎng)基含有可吸收的碳，氮?dú)夂蜔o機(jī)鹽源。我們已經(jīng)任意地設(shè)計(jì)了一些象A82846的糖肽抗生素及其組分。
抗生素A82846在結(jié)構(gòu)上同萬古霉素相似，但其體內(nèi)、體外抗革蘭氏陽性菌的活性有所改進(jìn)。此外，由于它比萬古霉素具有更長的半壽期，因此它的藥效學(xué)也得到改進(jìn)。
A82846組份應(yīng)具有如下必要的物理和光譜性質(zhì)A82846A的特性分子量1556實(shí)驗(yàn)式C73H89N10O26Cl快原子轟擊一質(zhì)譜(FAB-MS)(硫甘油)(M+1)實(shí)驗(yàn)值1557.5803;計(jì)算值C70H90N10O26Cl＝1557.5716(見圖4)
紫外光譜(H2O)λmax281nm(ε5，052)，加堿后移至300nm紅外光譜(KBr)1716，1655，1611，1586，1552，1504，1410，1340，1310，1230，1212，1132，1066，1028和1015cm(見圖1)核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖7pKa(H2O)4.7，9.5(66%DMF)5.5，6.8，7.9，9.4，12.3(表觀分子量1542)A82846B的特性分子量1590實(shí)驗(yàn)式C73H88N10O26Cl2快原子轟擊-質(zhì)譜(硫甘油)(M+1)實(shí)驗(yàn)值1591.5315;計(jì)算值C73H89N10O26Cl2＝1591.5327(見圖5)紫外光譜(HO)λmax280nm(ε5，192)，加堿后移至300nm紅外光譜(KBr)1656，1586，1562，1504，1403，1264，1230，1135，1105，1065，1023和1018cm-1(見圖2)核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖8pKa(H2O)4.65，9.5A82846C的特性分子量1522實(shí)驗(yàn)式C73H90N10O26快原子轟擊-質(zhì)譜(硫甘油)(M+Na)實(shí)驗(yàn)值1545.5998;計(jì)算值C73H90N10O26Na＝1545.5925(見圖6)紫外光譜(H2O)λmax280nm(ε5，198)，加堿后移至300nm紅外光譜(KBr)3600 3004(寬峰)，2999，2991，2950，1687 1650(寬峰)，1585，1570，1509，1503，1453，1449，1402，1212，1130，1102，1060，1032和1014cm-1(見圖3)
核磁共振〔(CD3)2SO〕見圖9pKa(H2O)4.6，9.4經(jīng)用6NHCl水解后，A82846A，A82846B，和A82846C的氨基酸分析表明，存在天冬氨酸和兩個(gè)寬峰及痕量的甘氨酸。這兩個(gè)峰代表類放線菌素的和萬古霉素的氨基酸，兩者均存在于萬古霉素類的糖肽中。
核磁共振比較研究指出，A82846A，A82846B，A82846C均含有這樣一個(gè)新的氨基糖-4-素-萬古胺(3-methyl-acosamine)
A82846A的分子式相當(dāng)于萬古霉素的分子式(C66H75N9O24Cl2)減去一個(gè)Cl原子，再加上另外的萬古胺類型(C7H14NO2)的氨基糖的成分。
A82846B的分子式相當(dāng)于A82846A，其中一個(gè)氫原子被一個(gè)氯原子所取代。
A82846C的分子式相當(dāng)于A82846A，其中一個(gè)氯原子已被一個(gè)氫原子取代。
A82846組份看來構(gòu)成了一個(gè)新的糖肽族，在總體組成上，它同萬古霉素分子相似，其不同點(diǎn)主要在于氯的含量和另外的，具有萬古胺組成的亞單位的存在。
A82846組份看來具有下列結(jié)構(gòu)式
A82846AX＝H Y＝ClA82846BX＝Cl Y＝ClA82846CX＝H Y＝H存在于A82846化合物中的糖基的絕對(duì)構(gòu)型尚未被測定。A82846以及它的個(gè)別的組份A82846A，A82846B，A82846C可以通過反應(yīng)形成各種鹽類?？股氐乃羞@些形式作為本發(fā)明的一個(gè)組成部分。A82846的鹽類是很有用的，例如，用來分離和純化A82846。另外，這些鹽可以使水溶解度得到改善。
A82846的鹽類是通過標(biāo)準(zhǔn)的鹽類制備方法制得。例如，A82846可用一個(gè)合適的酸中和形成一個(gè)酸加成鹽。
酸加成鹽是特別有用的。具有代表性的鹽類包括與下列有機(jī)和無機(jī)酸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)而生成的鹽類，例如，硫酸，鹽酸，磷酸，乙酸，琥珀酸，檸檬酸，乳酸，蘋果酸，富馬酸，膽酸，巴莫酸(pamoic acid)，粘酸，D-谷氨酸，d-樟腦酸，戊二酸，乙二酸，苯二甲酸，酒石酸，甲酸，月桂酸，硬脂酸，水楊酸，甲磺酸，苯磺酸，山梨酸，苦味酸，苯甲酸，肉桂酸以及類似的酸。
適合于藥用的酸加成鹽，尤其是本發(fā)明優(yōu)選的鹽類。
抗生素A82846可以用以下方法來生產(chǎn)，在液面下及需氧條件下，于一個(gè)合適的培養(yǎng)基中，對(duì)能產(chǎn)生A82846的東方諾卡氏菌(Nocardia orientalis)的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，直到有真實(shí)的抗菌活性產(chǎn)生。應(yīng)用各種技術(shù)上熟悉的分離和純化方法步驟，可將抗生素回收。
本發(fā)明也涉及一種微生物的經(jīng)生物學(xué)純化的培養(yǎng)物，上述微生物是從東方諾卡氏菌NRRL 18098，東方諾卡氏菌NRRL 18098，東方諾卡氏菌NRRL 18100或者是從能產(chǎn)生A82846的突變體、變異體或重組體中篩選出來的。這些微生物很有用，因?yàn)樗鼈兛梢援a(chǎn)生抗生素A82846。為了方便起見，在以下的討論中，將NRRL 18098菌株指定為培養(yǎng)物A82846，將NRRL 18099菌株指定為培養(yǎng)物A82846.1，將NRRL 18100菌株指定為培養(yǎng)物A82846.2。培養(yǎng)物A82846從Haiti土壤樣品中分離出來。培養(yǎng)物A82846.1是通過化學(xué)誘變作用從培養(yǎng)物A82846獲得，培養(yǎng)物A82846.2是一個(gè)分離自培養(yǎng)物A82846的天然的變異體。
培養(yǎng)物A82846，A82846.1，A82846.2于1986年8月8日被存放于美國農(nóng)業(yè)部中西部北區(qū)研究中心的農(nóng)業(yè)研究部(伊利諾斯州，61604，裴奧利亞，北方大學(xué)街1815號(hào))，并作為該機(jī)構(gòu)貯備培養(yǎng)物標(biāo)本的一部分。公眾可按這些培養(yǎng)物的登記號(hào)，如NRRL 18098(A82846，親本菌株)，NRRL 18099(A82846.1，突變菌株)，NRRL 18100(A82846.2變異菌株)獲得它們。
Lilly研究實(shí)驗(yàn)室的Frederick P.Mertz對(duì)培養(yǎng)物A82846，A82846.1，A82846.2進(jìn)行了分類學(xué)研究。基于這些研究，這些新的微生物被劃歸為東方諾卡氏菌族(Pittenger和Brigham，1956)。Pridham和Lyons 1969，菌株類型ATCC 19795〔R.C.Pillenger和R.B.Brigham，“東方鏈霉菌種(Streptomyces orientalis n.sp.，萬古霉素的來源”，Antibiotics and chemotherapy 6，642-647(1956)〕。這一分類結(jié)果基于已發(fā)表的直接的實(shí)驗(yàn)室比較和檢查報(bào)告〔《Bergey氏的細(xì)菌學(xué)測定手冊(cè)》，第八版，R.E.Buchanan和N.E.Gibbons編，Williams和Wilkins公司，巴爾的摩(美國)，1974;M.Goodfellow和K.P.Schaal，“諾卡氏菌(Nocardia)，馬杜拉放線菌(Actinomadura)和紅球菌(Rhodococcus)的鑒定方法”，于《微生物學(xué)家用鑒定方法》，第二版，F(xiàn).A.Skinner和D.W.LoveLock編，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，系列No.14，Academic Press，Inc.，紐約(美國)，1979，第261頁;R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan和C.H.Pang，“空腔諾卡氏菌(Nocardia coeliaca)，自營養(yǎng)東方諾卡氏菌和諾卡氏菌株，”Int.J.Syst.Bacteriol.24(1)，54-63(1974);R.E.Gordon，S.K.Mishra和D.A.Barnett，“某些另碎的諾卡氏菌屬肉色諾卡氏菌(N.carnea)越桔諾卡氏菌(N.vaccinii)，南非諾卡氏菌(N.transval-ensis)，東方諾卡氏菌和氣生菌落諾卡氏菌(N.aerocolonigenes)”，J.Gen.Microbiol.109，69-78(1978);S.J.Mishra，R.E.Gordon和D.A.Barnett，“具有醫(yī)學(xué)重要性的諾卡氏菌和鏈霉菌的鑒定”，J.Clin.Microbiot.11(6)，728-736(1980);H.Mordarska和M.Mordarski，“某些諾卡氏菌的化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)和分類”，J.Gen.Microbiology 71，77-86(1972);及R.Shinobu和M.Kawato，“關(guān)于氣生菌落鏈霉菌nov.sp.(Streptomyces aerocolonigenes nov.sp.)，在氣生菌絲體上形成第二菌落”，Bot.Mag.Tokyo 73，213-216(1960)〕。
使用的方法以下所使用的方法由國際鏈霉菌項(xiàng)目(ISP)所推薦，用來表示鏈霉菌種的特性〔E.B.Shirling和D.Gottlieb，“表示鏈霉菌種特性的方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.16313-340(1966)〕，并且推薦了Gordon，Barnett，Handerhan和Pang等人的表示諾卡氏菌種的方法，文獻(xiàn)見上。
用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究。電子掃描顯微鏡(SEM)用于對(duì)芽孢表面裝飾進(jìn)行研究。
對(duì)利福平和溶菌酶的抵抗性可以通過Gordon推薦的方法測定〔R.E.Gordon和D.A.Barnett，“以對(duì)利被平及某些分枝桿菌(Mycobacterium)種及諾卡氏菌種菌株的溶菌酶的抵抗性作為分類學(xué)工具”，Int.J.Syst.Bacteriol.27(3)，176-178(1977)〕。
ISCC-NBS矩心顏色表，標(biāo)準(zhǔn)樣品No.2106(國家標(biāo)準(zhǔn)局，1958，美國商業(yè)部，哥倫比亞特區(qū)，華盛頓)以及《顏色調(diào)和手冊(cè)》第四版(美國集裝箱公司，伊利諾斯州，芝加哥，1958)兩份材料用來確定顏色的名稱。
類黑素色素制作(生色性)用ISP NO.1(胰化胨酵母提取物液體培養(yǎng)基)，ISP NO.6(胨-酵母提取物鐵瓊脂)和ISP NO.7(酪氨酸瓊脂)等培養(yǎng)基測定。
整個(gè)細(xì)胞水解產(chǎn)物中的二氨基庚二酸(DAP)的異構(gòu)體和碳水化合物Becker等建立的色譜法〔B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon和H.A.Lechevalier，“用全細(xì)胞水解產(chǎn)物的紙色譜法快速區(qū)分諾卡氏菌屬和鏈霉菌屬”，Appl.Microbiol.12，421-423(1964)〕，以及Lechevalier的色譜法〔M.P.Lechevalier，“具有臨床重要性的需氧放線菌的鑒定”，J.Lab.Clin.Med.71，934-944(1968)〕證實(shí)。
霉菌酸的測定方法基于Minnikin描述的技術(shù)〔D.E.Minnikin，I.G.Hutchinson和A.B.Caldicott，“含有細(xì)菌的霉菌酸的甲醇解產(chǎn)物的薄層色譜法”，J.Chromatography 188，221-233(1980)〕。
磷酸酯酶及脲酶用Blazevic描述的方法測定(D.J.Blazevic和G.M.Ederer，《診斷微生物學(xué)中生化試驗(yàn)原理》，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1975，第136頁)。明膠液化作用用來測定蛋白酶活性。
對(duì)抗生素的抗性的測量，可通過填塞抗生素靈敏度圓盤，到經(jīng)過接種的ISP NO.2瓊脂平皿上的方法。
淀粉水解的測定可以在ISP NO.4(無機(jī)鹽淀粉)瓊脂平皿上，用碘測試淀粉的存在(見上述Blazevic和Ederer的文獻(xiàn))。
馬尿酸鹽的水解可用Bacto鑒別圓盤，它可快速檢測馬尿酸鹽的水解。
培養(yǎng)的特性培養(yǎng)物A82846和A82846.2在所有使用過的復(fù)合的和指定的培養(yǎng)基上生長均良好。這些培養(yǎng)物在大多數(shù)培養(yǎng)基上產(chǎn)生氣生菌絲體。氣生芽孢群的顏色是白色或灰色的，取決于所用的培養(yǎng)基。在許多培養(yǎng)基上均產(chǎn)生一種明顯的，棕色的可溶性顏料;其背面呈棕色到淺黃白色。
培養(yǎng)物A82846.1在所有使用過的培養(yǎng)基上也能生長，但其比起親株來不夠豐富。A82846.1難得產(chǎn)生氣生菌絲體，如果存在，顏色是白的。在少數(shù)培養(yǎng)基上，偶爾出現(xiàn)不明顯的淺棕色的可溶性顏料;其背面的顏色由棕色到淺黃白色。
培養(yǎng)物A82846，A82846.1和A82846.2的培養(yǎng)特性總結(jié)于表Ⅰ中。培養(yǎng)物A82846和A82846.2非常相似，其差別僅在于少數(shù)培養(yǎng)的性質(zhì)。由于它們的相似性，也因?yàn)锳82846.2是A82846天然的變異體，所以不必再作進(jìn)一步的比較了。
表ⅠA82846，A82846.1及A82846.2在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性a，b
aG＝生長;R＝背面;Am＝氣生菌絲體;Sp＝可溶性色素。
b于30℃下培養(yǎng)21天形態(tài)學(xué)特性培養(yǎng)物A82846，A82846.1和A82846.2產(chǎn)生一大批基底菌絲體。氣生菌絲形成外觀像蜘蛛網(wǎng)狀的分生孢子的長鏈，在Bergey氏細(xì)菌學(xué)測定手冊(cè)中，被歸類為非鏈霉菌的特征。
在所有的培養(yǎng)基中，芽孢表面裝飾是光滑的。芽孢呈圓柱狀，其大小范圍為，A828461.2～1.3×0.4～0.5μm，A82846.11.4～2.2×0.3～0.4μm。
當(dāng)在液面下，且在振搖條件下生長時(shí)，A82846顯示出最小碎裂，A82846.1大幅度地碎裂，A82846.2顯示出中等程度的碎裂。
生理學(xué)特性培養(yǎng)物A82846和A82846.1兩者均自以下物質(zhì)產(chǎn)生酸阿糖，纖維素二糖，葡聚糖果糖，半乳糖，葡萄糖，α-甲基-D-糖苷，甘油，肌醇，乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，甘露糖，蜜二糖，鼠李糖，核糖，蔗糖，海藻糖和木糖，但是均不從下列物質(zhì)中產(chǎn)生酸阿東糖醇，纖維素，半乳糖醇，赤蘚糖，菊粉，山梨醇和木糖醇。A82846也可從乙醇，糖原，松三糖，棉子糖和水楊苷中產(chǎn)生酸，但A82846.1卻不能。兩種培養(yǎng)物均可使用乙酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，蘋果酸鹽，草酸鹽，丙酸鹽，丙酮酸鹽和琥珀酸鹽，但不用苯甲酸鹽，粘酸鹽和酒石酸鹽。培養(yǎng)物A82846.1可使用丁酸鹽，但A82846則不用。
A82846和A82846.1可分解酪蛋白，次黃嘌呤，酪氨酸，尿素和DNA，但不分解腺瞟呤，蘋果酸鈣或黃嘌呤。兩種培養(yǎng)物均可水解淀粉，但不能水解七葉苷或馬尿酸鹽，還原硝酸鹽及液化明膠，它們可于50℃存活8小時(shí)，并產(chǎn)生催化酶H2S及磷酸酯酶。
培養(yǎng)物A82846和A82846.1具有同樣的抵抗抗生素的性質(zhì)。它們可以抵抗桿菌肽(10個(gè)單位)，頭孢菌素Ⅰ(30μg)，艮他霉素(10μg)，林肯霉素(2μg)竹桃霉素(15μg)，青霉素G(10個(gè)單位)，鏈霉素(10μg)，萬古霉素(30μg)，托普霉素(10μg)，紅霉素(15μg)，萘啶酮酸(30μg)，多粘菌素B(300個(gè)單位，三甲氧芐二氨嘧啶(5μg)和磺胺嘧啶(300μg)，并對(duì)以下抗生素敏感新霉素(30μg)，利福平(5μg)，四環(huán)素(30μg)，氯霉素(30μg)，新生霉素(30μg)，扃桃胺(3μg)。
A82846和A82846.1均可使革蘭氏陽性菌染色，但不能使耐酸菌染色。A82846可產(chǎn)生類黑素色素，而A82846.1則不能。
細(xì)胞壁分析水解后的A82846全細(xì)胞含有二氨基庚二酸的內(nèi)消旋異構(gòu)體，以及阿糖和半乳糖。根據(jù)Becker等人的工作(見上)，培養(yǎng)物具有Ⅳ型細(xì)胞壁。糖的形式是A型(Lechavalier，見上)。培養(yǎng)物不產(chǎn)生霉菌酸(LCN-A)。
A82846菌株的特性有關(guān)A82846菌株的化學(xué)分類及其一般培養(yǎng)特性與對(duì)諾卡氏菌屬Trevisan 1889的陳述是一致的〔V.B.D.Skerman，V.McGowan和P.H.A.Sneath編《經(jīng)批準(zhǔn)細(xì)菌名稱一覽表》，Int.J.Syst.Bacteriol.30，225-420(1980)〕。
Gordon，Mishra和Barnett等人(見上)發(fā)表了從十四種諾卡氏菌種的性質(zhì)中，計(jì)算得到相似系數(shù)，其中5種菌株來源自Lilly培養(yǎng)物標(biāo)本收集。并使用了Jaccard系數(shù)〔參見P.H.A.Sneath，”計(jì)算機(jī)應(yīng)用于分類學(xué)”，J.Gen.Microbiol.17，201(1957)〕和簡單匹配系數(shù)〔參見R.R.Sokal和C.D.Michener，“評(píng)價(jià)系統(tǒng)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)方法”，Kan Uinv.Sci.Bull.38，1409(1958)〕。這些比較結(jié)果總結(jié)于表Ⅱ。
表Ⅱ A82846及其它19種諾卡氏菌種的相似系數(shù)相似系數(shù)培養(yǎng)物 Ssm SjA82846 100 100氣生菌落諾卡氏菌 84 76氣生菌落諾卡氏菌(A42125)＊ 83 78東方諾卡氏菌(M43-05865) 78 72東方諾卡氏菌(A51568.1) 78 72東方諾卡氏菌 75 68東方諾卡氏菌(M5-18215) 73 66東方諾卡氏菌(M5-18260) 73 66馬杜拉諾卡氏菌(N，madurae) 73 63希蘇他諾卡氏菌(N.hirsuta) 62 60自營養(yǎng)諾卡氏菌(N.autotrophica) 62 53
達(dá)松維爾諾卡氏菌(N.dassonvillei) 62 50阿瑪諾卡氏菌(N.Amarae) 62 46巴西諾卡氏菌(N.brasiliensis) 56 43越桔諾卡氏菌 56 43南非諾卡氏菌 48 38豚鼠諾卡氏菌(N.caviae) 48 32白樂杰諾卡氏菌(N.pelletieri) 48 24星狀諾卡氏菌(N.asteroides) 46 23肉色諾卡氏菌 43 25＊括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示來源自Lilly培養(yǎng)物標(biāo)本的菌株。
因?yàn)轳R杜拉諾卡氏菌轉(zhuǎn)變到了馬杜拉放線菌屬，故不予考慮。氣生菌落諾卡氏菌和東方諾卡氏菌兩個(gè)種具有較好的相似系數(shù)。同時(shí)也對(duì)A82846和上述兩菌種作了實(shí)驗(yàn)比較。表Ⅲ給出了比較結(jié)果。
表Ⅲ A82846和東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的性質(zhì)比較培養(yǎng)物a性質(zhì) 82846 東方諾卡氏菌 氣生菌落諾卡氏菌產(chǎn)生氣生菌絲 + + +氣生顏色為白色 + + +產(chǎn)生分生孢子 + + +芽孢表面光滑 + + +芽孢呈圓柱狀 + + -產(chǎn)生可溶性色素 + - -革蘭氏染色陽性 + + +染色后耐酸 - - -顯示碎裂 + + +產(chǎn)生催化酶 + + +
水解七葉苷 - + +馬尿酸鹽 - - -淀粉 + + +蘋果酸鈣 - + +還原硝酸鹽 + + -分解腺嘌呤 - - -酪蛋白 + + +次黃嘌呤 + + +酪氨酸 + + +尿素 + + +黃嘌呤 - - -液化明膠 + + -產(chǎn)生磷酸酯酶 + + +50℃存活，8小時(shí) + + -從下列化合物產(chǎn)生酸阿東糖醇 - + -阿糖 + + +纖維素二糖 + + +赤蘚糖 - + -葡萄糖 + + +α-甲基-糖苷 + + -甘油 + + +肌醇 + + +乳糖 + + +
麥芽糖 + + +甘露糖醇 + + +甘露糖 + + +松三糖 + - -密二糖 + - +棉子糖 + - -鼠李糖 + + +山梨糖 - - -海藻糖 + + +木糖醇 + + +對(duì)照物 - - -利用苯甲酸鹽 - - -檸檬酸鹽 + + +粘酸鹽 - - -琥珀酸鹽 + + +酒石酸鹽 - - -對(duì)照物 - - -對(duì)下列抗生素的抗性桿菌肽(10單位) + - -頭孢菌素I 30μg) + + +艮他霉素(10μg) + - -林肯霉素(2μg) + + +新霉素(30μg) - - -竹桃霉素(15μg) + - -青霉素G(10單位) + + +
利福霉素(5μg) - - -鏈霉素(10μg) + + -四環(huán)素(30μg) - - -托首霉素(10μg) + + -萬古霉素(30μg) + + -氯霉素(30μg) - - -紅霉素(15μg) + - -萘啶酮酸(30μg) + + -新生霉素(30μg) - + -多粘菌素B(300單位) + + +三甲氧芐二氨嘧啶(5μg) + + +注a+＝菌株具有該性質(zhì);-＝菌株不具有該性質(zhì)。
采用大量的單位特性，重新計(jì)算了相似系數(shù)。結(jié)果總結(jié)于表Ⅳ。
表Ⅳ A82846，東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的相似系數(shù)相似系數(shù)培養(yǎng)物 Ssm SjA82846 100 100東方諾卡氏菌 81 76氣生菌落諾卡氏菌 73 65無論是東方諾卡氏菌還是氣生菌落諾卡氏菌在其細(xì)胞壁上均沒有霉菌酸、Gordon(見上)描述了三個(gè)關(guān)鍵性質(zhì)，以區(qū)別東方諾卡氏菌和氣生菌落諾卡氏菌。采用Gordon的關(guān)鍵性質(zhì)來比較A82846和諸卡氏菌種，其結(jié)果如表Ⅴ所示。
表ⅤA82846，東方諾卡氏菌及氣生菌落諾卡氏菌的關(guān)鍵性質(zhì)比較性質(zhì)從下列化合物產(chǎn)生酸 對(duì)溶菌酶培養(yǎng)物 赤蘚糖 甲基-α-糖苷 的 抗性A82846 - + +東方諾卡氏菌 + + -氣生菌落諾卡氏菌 - - +雖然A82846在關(guān)鍵性質(zhì)上不能與兩種諾卡氏菌株相符合，但它在培養(yǎng)特性上與東方諾卡氏菌關(guān)系密切，并具有較高的相似系數(shù)。它也象東方諾卡氏菌那樣，產(chǎn)生糖肽抗生素。因此，A82846被歸屬于東方諾卡氏菌株(pittenger和Brigham，1956)Pridham和Lyons 1969。由于東方諾卡氏菌可于《經(jīng)批準(zhǔn)的抗生素名稱一覽表》(見上)中找到，因此，它是一個(gè)有效的，已發(fā)表的菌種。
培養(yǎng)物A82846.1是培養(yǎng)物A82846的化學(xué)誘導(dǎo)突變體。A82846.1有別于A82846，其特征見表Ⅵ所示。
表Ⅵ A82846和A82846.1差異比較性質(zhì) A82846 A82864.1碎裂 最小量 豐富菌落大小 7mm 5mm菌落表面 硬 軟氣生菌絲 豐富 痕量背面顏色 深棕色 淺棕色可溶性色素 + -從下列化合物產(chǎn)生酸乙醇 + -糖原 + -松三糖 + -棉子糖 + -
水楊苷 + -利用α-甲基-糖苷 + -糖原 + -松三糖 + -山梨糖 + -丁酸鹽 - +類黑素色素 + -A82846.1和A82846在產(chǎn)生抗菌活性的總量上也有所不同。該兩菌株之間另一個(gè)明顯的差異是A82846.1與A82846不同，不產(chǎn)生氣生菌絲，及顯著可溶色素。
培養(yǎng)物A82846.2是培養(yǎng)物A82846的天然變異體，因此，A82846.2的鑒定特性與A82846的基本上相同。兩者的主要差異在于在振搖燒瓶中生長的條件下，培養(yǎng)物A82846.2可產(chǎn)生比培養(yǎng)物A82846更大量抗生的A82846。
象在其他微生物一樣的情況下，可使本發(fā)明中的產(chǎn)生A82846的培養(yǎng)物，東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100等的特性發(fā)生變化。因此這些菌株的后代，如重組體、突變體和變異體，可通過熟知的技術(shù)方法獲得。例如，變異體可以通過天然選擇獲得，突變體則可以通過使用各種已知的物理和化學(xué)突變方法獲得，如紫外光，X射線，γ射線以及一些化學(xué)品如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍乙啶。
重組體菌株可用熟知的技術(shù)，使東方諾卡氏菌株轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。由于諾卡氏菌和鏈霉菌的相似性，用于鏈霉菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)及所產(chǎn)生的重組體媒介物，同樣可以用來轉(zhuǎn)化諾卡氏菌株。通過使用重組體工藝學(xué)，除了這些菌株所產(chǎn)生的抗生素外，東方諾卡氏菌株還能被轉(zhuǎn)化而壓榨出種種基因產(chǎn)物。例如，人們可以用重組體媒介物來轉(zhuǎn)化菌株，該媒介物可以授與菌株對(duì)抗生素的抵抗力，而在正常的情況下，這些菌株對(duì)該抗生素是十分敏感的。這樣得到的轉(zhuǎn)化物不僅能產(chǎn)生A82846抗生素，而且還能產(chǎn)生授與抵抗力的酶，后者允許從廣泛類型細(xì)胞中作轉(zhuǎn)化菌株的選擇。此外，使用相似的技術(shù)，人們可以修飾現(xiàn)有的菌株，采用內(nèi)源的抗生素生物合成基因的復(fù)制，以便取得更高產(chǎn)量的抗生素。東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100的后代，如天然的和誘導(dǎo)的變異體，突變體及重組體等，它們均保留了A82846產(chǎn)品的特性，也是本發(fā)明的一個(gè)組成部分。
用于使東方諾卡氏菌培養(yǎng)物生長的培養(yǎng)基，可用多種培養(yǎng)基中的一種。為了生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，達(dá)到令人滿意的產(chǎn)量以及產(chǎn)品分離方便，某些培養(yǎng)基得優(yōu)先選用。因此，在大規(guī)模的發(fā)酵中。優(yōu)選的碳水化合物來源為葡萄糖和馬鈴薯糊精，盡管核糖，木糖，果糖，半乳糖，甘露糖，甘露糖醇，可溶性淀粉及其類似物也可使用。
優(yōu)選的氮源是酶-水解酪蛋白和肉胨，盡管酵母提取物，酸-水解酪蛋白，牛肉提取物，魚粉，肝粉及其類似物也可用來作氮源。
在可以并入培養(yǎng)基的營養(yǎng)性無機(jī)鹽中，慣用的有能產(chǎn)生下列離子的可溶性鹽Zn2+，Na+，Mg2+，Ca2+，NH+4，Cl-，CO2-3，SO2-4，NO-3及同類的離子。
培養(yǎng)基中還應(yīng)含有微生物生長和發(fā)育所需的，必要的痕量元素。這些痕量元素通常以雜質(zhì)形式存在于培養(yǎng)基的其它代用品中，其量足以滿足微生物生長的需要。如果發(fā)生起泡問題，可在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基中加入小量(0.2ml/L)的的抗泡沫劑，如聚丙二醇。
為了大量生產(chǎn)A82846抗生素，優(yōu)先選用在罐內(nèi)液面下需氧發(fā)酵。少量抗生素可以通過振搖燒瓶培養(yǎng)法獲得。由于抗生素生產(chǎn)的時(shí)滯與用微生物芽胞形式給大罐接種有關(guān)，因此優(yōu)先采用生長性的接種體。生長性接種體的制備，通過將微生物的芽胞形式或菌絲碎片，接種于小體積培養(yǎng)基上，得到新鮮的，活潑生長的微生物培養(yǎng)物。而后將生長性接種體轉(zhuǎn)移至大罐中。生長性接種體培養(yǎng)基與用于大規(guī)模發(fā)酵的一樣，當(dāng)然其它培養(yǎng)基也是適用的。
使產(chǎn)生A82846的微生物在約23～37℃的條件下生長，可獲得抗生素A82846。A82846生產(chǎn)最適宜溫度看來約為30～31℃。
由于培養(yǎng)過程通常在液面下需氧條件下進(jìn)行，所以在用常規(guī)的渦輪轉(zhuǎn)子葉片攪拌培養(yǎng)基的同時(shí)，將無菌空氣從底部吹入容器。迄今為止，在所采用的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)的最大氧吸收量每分鐘不超過約0.2mM/L。一般來說，通氣速度和攪拌速度應(yīng)足以使溶解氧的水平，維持在50%或以上的飽和度。
抗生素A82846的生產(chǎn)能仿效。在發(fā)酵過程中，檢驗(yàn)肉湯樣品，以測定對(duì)微生物的抗生活性，已知這些微生物對(duì)抗生素是敏感的。一個(gè)有用的供鑒定用的微生物是枯草桿菌ATCC6633，生物鑒定通常在研究的瓊脂平皿上進(jìn)行。
當(dāng)抗生素A82846經(jīng)在液面下需氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生之后，可用工藝上采用的技術(shù)方法，將其從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收得到。在產(chǎn)生A82846的微生物的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗菌活性，既存在于菌絲體中，也存在于肉湯中。
通過起始時(shí)調(diào)節(jié)pH至10.5，使A82846從菌絲體中釋放出來，并過濾培養(yǎng)基，使肉湯從菌絲體團(tuán)塊中分離出來，可達(dá)到A82846最大限定的回收目的。
A82846可通過各種技術(shù)，從過濾肉湯中使之回收。優(yōu)選的技術(shù)包括以下步驟調(diào)節(jié)過濾肉湯的pH至約7，然后將其吸附于陽離子交換樹脂上，例如，Dowex XF5-43278，Dowex-50或大網(wǎng)狀樹脂IR-120。再用合適的溶劑，如稀NH4OH溶液，將活性物質(zhì)從樹脂上洗脫下來。將活性組分在真空減壓條件下濃縮，并將其吸附在一個(gè)大網(wǎng)絡(luò)樹脂上，如DiaionHP-20和大網(wǎng)狀樹脂XAD-4上，而后用合適的溶劑，如含有1%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)洗脫，得到A82846。該活性物質(zhì)也可用含有少量酸的水∶乙酰腈或水∶甲醇混合溶劑洗脫。
A82846可用同樣的方法步驟分離得到個(gè)別組分A82846A，A82846B，A82846C，優(yōu)選的分離方法包括反相硅膠(C18或C8)層析。
另一方面，可以用培養(yǎng)基固態(tài)物質(zhì)，包括培養(yǎng)基成份及菌絲體，而無須提取或分離(但是最好除去水之后用)，以作為A82846的來源。例如，在A82846產(chǎn)生之后，整個(gè)發(fā)酵肉湯可用冷凍干燥，圓桶烘干，或共沸蒸餾并干燥等方法進(jìn)行。然后將干燥的肉湯直接混入預(yù)混飼料中。
抗生素A82846在體內(nèi)、外具有極好的抗革蘭氏陽性致病菌的活性。這類抗生素有一種特別的，出乎意料的貢獻(xiàn)，它們具有長的血清半壽期，例如，當(dāng)靜脈注射給予大鼠時(shí)，萬古霉素的血清半壽期是45分鐘，而A82846A和A82846B的半壽期均為2.2小時(shí)。
表Ⅶ和表Ⅷ給出了A82846抑制某些細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)。表Ⅶ和表Ⅷ中MIC值是用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂稀釋法鑒定而得的。
表Ⅶ A82846抗生素的體外抗菌活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)A82846A A82846B A82846C金黃色葡萄球菌 X1.1 0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus X1.1)金黃色葡萄球菌 V41a0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus V41)金黃色葡萄球菌 X400b0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus X400b)金黃色葡萄球菌 S13E 0.125 0.125 1(Staphylococcus aureus S13E)表皮葡萄球菌 270 0.25 0.25 1(Staphylococcus epidermidis 270)表皮葡萄球菌 222 0.25 0.25 1(Staphylococcus epidermidis 222)釀膿鏈球菌C203 0.125 0.125 1(Streptococcus pyogenes C203)肺類鏈球菌 Park I 0.125 0.125 2(Streptococcus pneumoniae Park I)鏈球菌D群 X66 0.25 0.25 2(Streptococcus Group D X66)鏈球菌D群 2041 0.5 0.5 4(Streptococcus Group D 2041)流感嗜血菌C.L.c(Haemophilus influenzae C.L.c)
表Ⅶ A82846抗生素的體外抗菌活性(續(xù))最小抑制濃度MIC(mcg/ml)A82846A A82846B A82846C流感嗜血菌 76d- - -(Haemophilus influenzae 76d)大腸埃希氏菌 EC14 - - -(Escherichia coli EC14)肺炎克雷伯氏菌 X26) - - -(Klebsiella pneumoniae X26)綠濃桿菌 X239(Pscudomonas aeruginosa X239a青霉素抗株b二甲氧基苯青霉素抗株cα-氨基芐青霉素敏感株dα-氨基芐青霉素抗株e-＝128mcg/mL時(shí)無活性，最高水平測試。
表Ⅷ A82846A，A82846B和萬古霉素的體外活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)被測試微生物 菌株數(shù) A82846A A82846B 萬古霉素金黃色葡萄球菌 20 0.125- 0.25- 0.5-2.0(Staphylococcus aureus) 1.0 1.0表皮葡萄球菌 20 0.25- 0.5-1.0 1.0-2.0(Staphylococcus epidermidis) 2.0釀膿鏈球菌 12 0.125- 0.125- 0.5(Streptococcus pyogenes) 0.25 0.25肺炎鏈球菌 20 ≤0.015 0.125- ≤0.015-(Streptococcus pneumoniae) -0.25 0.25 4.0鏈球菌 sp.D群 20 0.25- 0.25- 1.0-2.0(Streptococcus sp.group.D) 1.0 1.0唾液鏈球菌 1 1.0 0.25 0.5(Streptococcus salivaris)血鏈球菌 4 0.25- 0.25 0.5-1.0(Streptococcus sanguis) 0.5變異鏈球菌 2 0.125- 0.125- 0.125-(Streptococcus mutans) 0.5 1.0 2.0A82846類化合物抗微生物活性的一個(gè)重要方面，是它們對(duì)厭氧細(xì)菌有活性。這種活性在表Ⅸ加以說明，該表總結(jié)了A82846A和A82846B對(duì)各種厭氧細(xì)菌的活性，活性測定用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂稀釋鑒定法。在孵育24小時(shí)后讀出終點(diǎn)結(jié)果。
表Ⅸ A82846A，A82846B對(duì)厭氧菌的活性最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數(shù) A82846A A82846B 萬古霉素革蘭氏陽性菌株艱難梭菌 19 0.125-1 ≤0.06 0.5-4(Clostridium defficile) -0.125產(chǎn)氣莢膜梭菌 1 ≤0.25 0.5 2(Clostridium perfringens)敗毒梭菌 1 0.5 0.5 2(Clostridium septicum)產(chǎn)氣真桿菌 1 ≤0.25 0.5 2(Eubacterium aerofaciens)不解糖消化球菌 3 ≤0.25 0.06- 1(Peptococcus 0.5asaccharolyticus)普氏硝化球菌 4 1-2 1-4 1-4(Peptococcus prevoti)可變消化球菌 1 0.5 1 1(Peptococcus variabilis)星群消化球菌 1 0.25 0.25 1(Peptococcus constellatus)大型消化球菌 3 0.06- 0.125- 0.25-1(Peptococcus magnus) 0.125 0.25
表Ⅸ A82846A和A82846B對(duì)厭氧菌的活性(續(xù))最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數(shù) A82846A A82846B 萬古霉素厭氧消化鏈球菌 8 0.06-2 0.06-8 0.25-2(Peptostreptococcusanaerobius)中間型消化鏈球菌 3 ≤0.25 0.25- 0.5-1(Peptostreptococcus 0.5intermedius)瘡皰丙酸桿菌 19 ≤0.25 ≤0.25 2-16(Propionibacterium acnes)革蘭氏陰性菌株脆弱擬桿菌 3 ＞128 ＞128 32-64(Bacteroides fragilis)多形擬桿菌 1 128 128 64(Bacteroidesthetaiotaomicron)產(chǎn)黑素?cái)M桿菌 2 ＞128 ＞128 ＞128(Bacteroidesmelaninogenicus)普通擬桿菌 1 128 ＞128 64(Bacteroides vulgatis)嚙蝕擬桿菌 1 ＞128 ＞128 64(Bacteroides corrodens)
表Ⅸ A82846A和A82846B對(duì)厭氧菌的活性(續(xù))最小抑制濃度MIC(mcg/ml)厭氧菌 被測試菌株數(shù) A82846A A82846B 萬古霉素共生梭桿菌 1 128 128 4(Fusobacteriumsymbiosum)壞死梭桿菌 1 128 128 1(Fusobacterium necrophorum)A82846抗生素在用實(shí)驗(yàn)手段引起感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，已顯示出抗微生物活性。將兩種劑量的被測試化合物，給予已被待測試微生物感染的小鼠，觀察到的活性用ED50值來表示〔保護(hù)50%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有效劑量，單位為mg/kg，參見Warren Wick，et al.，J.Bacteriol.81，233-235(1961)〕。所測得的下述化合物的ED50值列于表Ⅹ。
表Ⅹ A82846抗生素的體內(nèi)活性ED50值化合物 金黃色葡萄球菌 釀膿鏈球菌 肺炎鏈球菌A82846A 0.19 0.19 0.17A82846B 0.19 0.20 0.18A82846C 2.18 2.71 5.87萬古霉素 1.3 0.72 1.52a mg/kg×2;感染后1小時(shí)和4小時(shí)大鼠皮下給予劑量A82846抗生素抗菌活性的一個(gè)主要方面，是它們對(duì)腎盂腎炎的治療功效。例如A82846A和A82846B在大鼠遺傳性腎盂腎炎感染實(shí)驗(yàn)中所提供的保護(hù)作用比萬古霉素更有效。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)所用方法，如同美國專利4，208，403所描述的那樣。其觀測結(jié)果總結(jié)于表Ⅺ。
表Ⅺ A82846A和B對(duì)大鼠遺傳性腎盂腎炎試驗(yàn)的活性劑量 治愈大鼠 細(xì)菌滴度下降一萬倍化合物 (mg/kg×12)a百分?jǐn)?shù) (4Log)的大鼠百分?jǐn)?shù)A82846A 10 88 1005 75 882 63 100A82846B 10 100 1005 100 1002 50 88萬古霉素 10 63 1005 38 882 38 75注a隔日皮下給藥劑量，持續(xù)6天A82846抗生素在治療心內(nèi)膜炎方面也很有用。例如，A82846A和B在治療大鼠實(shí)驗(yàn)性導(dǎo)管誘發(fā)的心內(nèi)膜炎時(shí)，與萬古霉素比同樣有效。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)大鼠的準(zhǔn)備工作是將一根塑料導(dǎo)管插入大鼠的右頸動(dòng)脈，往下達(dá)到右心室，并安全地固定好。該動(dòng)物休息兩天，然后靜脈給予待測微生物糞鏈球菌X-66，微生物滴度大約為5×108/ml，給藥量0.5ml。
在感染前15分鐘皮下給藥，每隔12小時(shí)一次，持續(xù)14天，共計(jì)28次治療。治療后動(dòng)物保持2天，然后取出心臟，制成勻漿，稀釋，并置于trypticase大豆瓊脂平皿上，將平皿孵育48小時(shí)，然后計(jì)數(shù)。研究結(jié)果總結(jié)于表Ⅻ。
表Ⅻ A82846A和B對(duì)大鼠心內(nèi)膜炎試驗(yàn)的活性a16天劑量b治愈的大鼠細(xì)菌滴度下降一萬倍化合物 (mg/kg×28) 百分?jǐn)?shù) (4Log)的大鼠百分?jǐn)?shù)A82846A 20 100 100A82846B 20 100 100萬古霉素 20 100 100注a.用糞鏈球菌X-66導(dǎo)管誘發(fā)的心內(nèi)膜炎。
注b.皮下劑量，每隔12小時(shí)給藥，持續(xù)14天。
注c.下降4Log死亡的動(dòng)物百分?jǐn)?shù)。
A82846抗生素的藥劑配方也是本發(fā)明的一部分。因而，該抗生素，尤以其符合藥劑學(xué)要求的鹽為優(yōu)選，可配成口服或注射制劑，用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染。例如，可以將該化合物與常規(guī)的藥用載體賦形劑調(diào)配，制成片劑，膠囊，劑，懸浮劑，糖漿，糯米紙囊劑以及類似劑型。
在含A82846抗生素制劑復(fù)方中，活性化合物重量比可從0.1%至90%左右，通常為10%至30%左右。該制劑中可以含有常規(guī)的載體和賦形劑，如玉米淀粉或明膠，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，高嶺土，甘露糖醇，磷酸二鈣，氯化鈉和藻酸。本發(fā)明提供配方中適用的崩解劑包括croscarmellose鈉，微晶纖維素，玉米淀粉，淀粉甘醇酸酯鈉，及藻酸。
片劑中的粘合劑可以選用阿拉伯膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮(povidone)，羥丙基甲基纖維素，蔗糖，淀粉及乙基纖維素。
潤滑劑可以選用硬脂酸鎂或其它金屬硬脂酸鹽，硬脂酸，硅流體，滑石粉，臘，油類及膠體硅。
調(diào)味劑可以選用薄荷，冬青油，櫻桃調(diào)味劑或其它類似物。
如果需要可加入著色劑以改善片子外觀，或有助于產(chǎn)品的鑒別。
為靜脈給藥，可將一種水溶型此類抗生素溶于常規(guī)的靜脈輸液中的其中一種，再輸注給藥。此類輸液如生理鹽水，林格注射液或5%葡萄糖溶液，均可使用。
為肌肉給藥，可將該化合物適宜的可溶性鹽構(gòu)成的無菌制劑，如鹽酸鹽制劑，溶于藥用稀釋劑，并用此溶液給藥，稀釋劑為注射用水，生理鹽水或5%葡萄糖溶液。該化合物適宜的非溶解體可制成水性或油性的藥用懸浮劑，并以上劑型給藥。藥用油劑可用長鏈脂肪酸酯，如油酸乙酯。
為了口服，可將該抗生素適宜的鹽配成的無菌制劑，如鹽酸鹽制劑，以蒸餾水或去離子水作為稀釋劑配制。此法特別有用。
或者，抗生素的單位劑型為密封在安瓿中的加稀釋劑的無菌溶液，尤以其鹽的形式為佳。單位劑型中的抗生素濃度是可變的，例如，從約1%至50%左右，這取決于該抗生素特定的物態(tài)及其溶解性和醫(yī)生所需的劑量。
另一方面，本發(fā)明進(jìn)一提供了針對(duì)一些傳染病，特別是那些由革蘭氏陽性菌，在動(dòng)物體引起的傳染病，而采用的治療方法。這些動(dòng)物或者是對(duì)微生物敏感的，或者是易受病菌感染的。
為此目的，本方法包括給動(dòng)物服用一定有效量的A82846抗生素。一般說來，A82846抗生素的有效量為0.5-100mg/kg的劑量。最好的劑量大約為1-60mg/kg的活性化合物。對(duì)成年人，典型的日劑量大約為50mg-1.0g。
在實(shí)踐中應(yīng)用此法時(shí)，可采用每日給一個(gè)單劑量或一日給多個(gè)劑量。治療方案為在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)給藥，療程為幾天或一周至六周。每次給藥劑量或全部給藥劑量由以下因素決定感染的性質(zhì)和嚴(yán)重程度;患者的年齡及平時(shí)的健康狀況;患者對(duì)抗生素的耐藥性，以及微生物本身或感染中涉及的微生物。
一個(gè)簡便的治療實(shí)踐方法是通過靜脈輸注給抗生素。在本方法中，將合適的抗生素可溶性鹽的無菌配方，與生理液(如5%葡萄糖)混合生成的溶液通過靜脈緩慢輸注，或可用背在肩上的脈輸注法。
在其它具體方面，本發(fā)明還關(guān)系到1)提高家禽、豬、羊和牛等動(dòng)物飼料利用率的方法;2)促進(jìn)家禽、豬、羊和牛等動(dòng)物的生長方法，以提高肉類的產(chǎn)量;及3)提高授乳反芻動(dòng)物產(chǎn)奶的方法。為了提高飼料利用率和促進(jìn)生長，可將A82846抗生素以每噸飼料中加進(jìn)大約2-200g的比例給予牲口口服。以菜牛為例，大約為12-3000mg/頭/天的藥量范圍是合適的。為了提高授乳反芻動(dòng)物的產(chǎn)奶量，建議每日量大約為0.04-16mg/kg體重(或大約25-5000mg/頭/天)。
在這些方面，本發(fā)明的化合物一般以動(dòng)物飼料預(yù)混品的形式出售。這樣的預(yù)混物包含一種或多種適合農(nóng)藝學(xué)要求的載體物質(zhì)。
為了更全面地闡明本發(fā)明的操作過程，現(xiàn)提供以下實(shí)例。
實(shí)例1A82846高壓液相鑒定方法下列分析型高壓液相系統(tǒng)適用于A82846成份。
1.陽離子交換樹脂柱柱載體Zorbax＊SCX(4.6×150mm)系統(tǒng)梯度洗脫，5分鐘內(nèi)，A∶B從(4∶1)至(1∶9)，維持15分鐘。
A＝MeOH∶0.1M NaH2PO4(1∶9)B＝MeOH∶0.9M NaH2PO4(1∶9)流速1.0毫升/分檢測紫外光，225nm處保留時(shí)間與濃度有關(guān)，大約為A82846C＝6.6分鐘A82846B＝8.9分鐘A82846A＝9.5分鐘2.反相柱柱載體Zorbax ODA(4.6×150mm)系統(tǒng)梯度洗脫，1%(NH4)H2PO4∶CH3CN20分鐘內(nèi)，從(95∶5)至(1∶1)。
流速1.0毫升/分鐘檢測紫外光，225nm處保留時(shí)間A82846A＝7.3分鐘A82846C＝7.6分鐘A82846B＝8.0分鐘＊Zorbax柱是E.I.duPont de Nemours公司(Wilmington，Delaware州，19898)的產(chǎn)品。
實(shí)例2用培養(yǎng)物A82846制備抗生素A82846A.培養(yǎng)物A82846的燒瓶振搖發(fā)酵法將培養(yǎng)物東方諾卡氏菌NRRL18098的冷凍干燥片或保存在液氮中的懸浮物，接種到含有下列成份的接種培養(yǎng)基中，接種培養(yǎng)基原料成份 含量(%)葡萄糖 1.0可溶性淀粉 2.0酵母提取物 0.5酪蛋白的酶促水解物＊ 0.5CaCO30.1去離子水 適量加到1L在滅菌前用NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.5左右。
＊NZ Amine A，Sheffield化學(xué)公司，Norwich，紐約。
向接種培養(yǎng)基中加入2.5%的瓊脂制成的斜面或平皿培養(yǎng)基。斜面接種在30℃下孵育約需10至14天。用無菌工具刮擦成熟的斜面培養(yǎng)物，使芽孢松散并移開，同時(shí)浸漬菌絲叢。這樣得到的大約四分之一的松散芽孢和培養(yǎng)物用于接種到50ml第一級(jí)接種培養(yǎng)基上。
經(jīng)接種的第一級(jí)培養(yǎng)基，在250ml錐形瓶中，于30℃孵育約24-48小時(shí)，在一振蕩器上，以250rpm的轉(zhuǎn)速，圍繞直徑為2英寸(5.08cm)的圓旋轉(zhuǎn)。
將上述孵育過的第一級(jí)培養(yǎng)基(0.5ml)接種到50ml含有下列成份的產(chǎn)物培養(yǎng)基中成份 含量%葡萄糖 2.5大豆粉 1.5馬鈴薯糊精 3.0CaCO 0.25赤糖糊糖漿 0.3酸性水解酪蛋白＊ 0.5去離子水 適量加到1L(無菌劑pH用NaOH調(diào)至7.5)＊Hy-Case，Sheffield化學(xué)公司。
經(jīng)孵育過的產(chǎn)物培養(yǎng)基，在一個(gè)250ml廣口錐形瓶中，于30℃孵育4-5天，在一振蕩器上，以250rpm的轉(zhuǎn)速，圍繞直徑為2英寸的圓旋轉(zhuǎn)。
B.培養(yǎng)物A82846的罐式發(fā)酵法為提供大體積接種物，按A節(jié)所述方法制得的10ml經(jīng)孵育的第一期培養(yǎng)基，接種到400ml具有與第一期培養(yǎng)基成份相同的第二期生長培養(yǎng)基中。該第二期生長培養(yǎng)基在2-L廣口錐形瓶中，于30℃孵育約48小時(shí)，在一振蕩器上，以250rpm的轉(zhuǎn)速，圍繞直徑為2英寸的圓旋轉(zhuǎn)。
將這樣制得的經(jīng)孵育的第二期生長培養(yǎng)基(100ml)，接種到100L無菌生產(chǎn)培養(yǎng)基上(后者按A節(jié)所述方法制得)，但需再加入P-2000抗泡沫劑(0.3g/升)。經(jīng)孵育的產(chǎn)物培養(yǎng)基在165-L攪拌發(fā)酵罐中，于30℃發(fā)酵90-100小時(shí)。調(diào)節(jié)攪拌發(fā)酵罐(80rpm)中的氣流，維持溶解氧水平在飽和空氣的50%以上。
C.培養(yǎng)物A82846另一種罐式發(fā)酵法仿效B節(jié)所述方法。除了以下條件有所不同，即將一定量生長培養(yǎng)基用來接種到近1200加侖生產(chǎn)培養(yǎng)基上，后者在1600加侖(4536-L)發(fā)酵罐中。
實(shí)例3用培養(yǎng)物A82846.1制備抗生素A82846用培養(yǎng)物東方諾卡氏菌NRRL18099的冷凍干燥片或保存在液氮中的懸浮物，按實(shí)例2所述方法進(jìn)行培養(yǎng)。除了以下條件有所不同，即生產(chǎn)培養(yǎng)基為下列組成原料成份 含量(%)葡萄糖 1.0馬鈴薯糊精 2.0胨＊ 1.0CaCO30.2赤糖糊糖漿 2.0去離子水 適量加到1L無需調(diào)pH值＊Bacto-胨(Difco實(shí)驗(yàn)室)實(shí)例4用培養(yǎng)物A82846.2制備抗生素A82846培養(yǎng)物東方諾卡氏菌NRRL18100，或者用其冷凍干燥片，或者為保存在液氮中的懸浮物，以實(shí)例2所述方法進(jìn)行培養(yǎng)。除下列條件有所不同，即所用的酸水解酪蛋白為Amicase(sheffield化學(xué)公司)。
實(shí)例5A82846粗品的制備在1600加侖發(fā)酵罐中按實(shí)例2C節(jié)所述方法制得，發(fā)酵液(4200L)用5N NaOH調(diào)pH值至10.5，并加入3%硅藻土545(助濾)。該混合液用壓濾器過濾，用水洗滌壓濾器。合并濾液及洗滌水(4200L)，用5N HCl(或H2SO4)調(diào)pH至7，上Dowex-XFS-43278(NH+4)樹脂柱(200L濾液/10L樹脂)，以750ml/分的流速洗脫柱子，各組分既可用枯草桿菌進(jìn)行生物鑒定，也可用高壓液著進(jìn)行檢測。
用5倍于柱體積的水洗滌柱子，每100L收集一次，為等分試樣。
用5倍柱體積的0.05N的NH4OH將樹脂上吸附的活性物質(zhì)洗脫下來，每25L收集一份，合并含A82846的各組分，減壓濃縮至體積約為30L。該溶液上10L用水飽和過的Diaion HP-20樹脂柱。用3倍柱體積的水以300ml/分的流速，洗滌樹脂柱。洗滌水棄去。用含1%乙酸的水∶異丙醇(94∶5)溶液，以100ml/分洗脫柱子上的活性成份，每收集4L為1份，并用生物鑒定法及高壓液相法鑒定。合并含A82846(＃6-14)的組份，減壓濃縮，冷凍干燥，得356克A82846粗品。
實(shí)例6A82846和A82846B的分離A.富集的A82846A及A82846B的分離將30g按實(shí)例5制備的A82846溶于500ml水中，并上30L加壓不銹鋼層析柱，柱載體為用1%NH4H2PO4飽和的硅膠LP-1/C18。該柱用1%NH4H2PO4(60L)至含1%NH4H2PO4(60L)水∶乙腈(88∶12)的溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為250-300ml/分(最大壓力為600psi)，每收集4L為一份，用紫外在254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行監(jiān)測。用分析型高壓液相色譜對(duì)個(gè)別組分進(jìn)行鑒定，分別合并富含A82846A(＃6-9)和A82846B(＃10-17)的組份，并減壓濃縮。
B.A82846A的純制將A節(jié)所述方法，從兩份30g原料得到的富集A82846A的濃縮物，上1750ml的Diaion HP-20SS柱，進(jìn)行脫鹽，用水洗滌，并用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，用分析型高壓液相色譜進(jìn)行鑒定，合并含有A82846A的組份，濃縮，冷凍干燥，得到7.4g富集A82846A的產(chǎn)品。
將7.2g富集A82846A的制品溶于水中，用以1%(NH4)H2PO4飽和的硅膠LP-1/C18為載體的制備型高壓液相柱對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行層析。柱子以1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(9∶1)進(jìn)行梯度洗脫，用分析型高壓液相色譜紫外檢測儀于254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行監(jiān)測，洗脫流速為48ml/分，開頭10L洗脫液流出后，以500ml為一份進(jìn)行收集。
分別將含有A82846A(＃4-10)的組份及含有A82846B(＃12-20)的組份進(jìn)行合并，減壓濃縮。合并3批A82846A濃縮物，用1750ml Diaion HP-20SS柱對(duì)該濃縮物進(jìn)行脫鹽，柱子用水洗，用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液對(duì)A82846A進(jìn)行洗脫，高壓液相色譜監(jiān)測洗脫過程。合并含有A82846A的組份，濃縮，冷凍干燥，得到A82846A純品7.9g。
A82846A的紅外光譜(KBr壓片法)見圖1;A82846A在硫甘油中的快原子轟擊-質(zhì)譜(FAB-MS)見圖4;A82846A鹽酸鹽的核磁共振譜〔二甲亞砜-d6，即(methyl sulfoxide)-d6〕見圖7，測試溫度為60℃，儀器為Bruker AM500分光計(jì)，(壓制HDO(水)峰)。
C.A82846B的純制按B節(jié)所述方法，從3批用制備型高壓液相層析分離的A82846A和A82846B的洗脫液中，得到富集A82846B的組份，將組份合并，用1750ml的Diaion HP-20SS柱進(jìn)行脫鹽，水洗柱子。用含0.5%乙酸的水∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，用高壓液相色譜監(jiān)測洗脫過程，含A82846B的組份合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得A82846B純品8.8g。
A82846B的紅外光譜(KBr壓片法)見圖2;A82846B在硫甘油中的快原子轟擊-質(zhì)譜(FAB-MS)見圖5;A82846B乙酸酯的核磁共振譜見圖8，溶液為二甲亞砜-d6，儀器為Bruker AM500分光計(jì)，測試溫度為60℃。
D.脫鹽脫鹽過程也可用Diaion HP-20樹脂完成，以含0.1%乙酸的甲醇∶水(4∶1)的溶液洗脫。
實(shí)例7A82846C的離析A.A82846的分離按實(shí)例2，B節(jié)所述方法，從4批165-L發(fā)酵原料得到的發(fā)酵液，用5N NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5，加入3%Hyflo Supercel助濾劑后進(jìn)行過濾。濾液(430L)用5N HCl調(diào)節(jié)pH值至7，然后上含10L Dowex-XFS-43278(NH+4)樹脂的層析柱進(jìn)行層析。柱子用50L水洗滌，活性物質(zhì)用0.05N NH4OH洗脫，每收集4L為一份。洗脫過程用生物鑒定法進(jìn)行監(jiān)測。合并活性組份(＃1-7)，減壓濃縮至體積約為1700ml。冷凍干燥，得A82846粗品283.9g。
B.A82846A，B和C的分離將A節(jié)方法所得A82846粗品2g溶于水中，用2″×45″不銹鋼制備型高壓液相層析柱進(jìn)行分離，柱載體含2110ml硅膠LP-1/C18樹脂于1%(NH4)H2PO4中的溶液。柱子用1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(92∶8)進(jìn)行梯度洗脫，流速70ml/分，每收集400ml為一份，并用紫外儀在254nm處進(jìn)行監(jiān)測。
將含A82846A(＃11-14)的組份合并為第1庫，將含A82846C(＃16-20)的合并為第2庫，將含A82846B(＃21-25)的合并為第3庫。
C.A82846C的純制將第2庫體積濃縮至200ml左右，然后上7×45cm玻璃層析柱進(jìn)行脫鹽，柱載體為1800ml Diaion HP-20樹脂。活性物質(zhì)用含0.1%乙酸的MeOH∶H2O(4∶1)溶液進(jìn)行洗脫。每收集1L為一份，流速為25ml/分。將含C(＃9-12)的組份合并，訪壓濃縮，冷凍干燥，得A82846C的半純品662.6mg。
該半純品(500mg)進(jìn)一步用反相高壓液相步驟重復(fù)多次純化，層析用1″×48″鋼柱，450ml硅膠LP-1/C18為載體，以1%(NH4)H2PO4至1%(NH4)H2PO4∶乙腈(92∶8)進(jìn)行梯度洗脫，流速為11ml/分，每收集25ml為一份，并用紫外儀在245nm處進(jìn)行監(jiān)測。合并A82846C(＃169-210)組份，用5×45cm玻璃層析柱進(jìn)行脫鹽，柱載體為HP-20樹脂。以含0.1%乙酸的MeOH∶H2O(4∶1)的溶液洗脫，每收集100ml為一份，隨后用分析型高壓液相儀洗脫，并在紫外儀225nm處鹽測。將含有A82846C(＃5-11)的組份合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得127.3mgA82846C。
采用與A82846C同樣的方法，對(duì)含A82846A的第一庫以及含A82846B的第3庫，分別進(jìn)行純化，進(jìn)一步得到純化的A82846A和A82846B。
D.A82846C的進(jìn)一步純化進(jìn)一步用下列制備型色譜法對(duì)A82846C(70mg)進(jìn)行純化柱載體Zorbax SCX(9.2×250mm)陽離子交換型流動(dòng)相線性梯度改變，在6分鐘內(nèi)，從含10%甲醇的0.15M NaH2PO4緩沖液至含10%甲醇的0.9M NaH2PO4緩沖液，并保持5分鐘，對(duì)緩沖液不作調(diào)節(jié)。
流速6.0ml/分檢測紫外，280nm處載荷6.0mg/注射，于水液中使用配備有峰檢測功能的自動(dòng)組份收集器(Gilson 201C)對(duì)A82846C進(jìn)行收集;通過Millipore Waters M600梯度高壓液相色譜系統(tǒng)，釋放流動(dòng)相，并使用日立牌自動(dòng)進(jìn)樣器注入樣品溶液。
將含有A82846C的組份合并，濃縮至體積為30ml，上HP-20層析柱(50ml)，柱用水洗滌，并用含0.5%乙酸的H2O∶異丙醇(95∶5)溶液洗脫，每收集25ml為一份，合并含A82846C(＃9-14)的組份，濃縮，冷凍干燥，得37mg純化的A82846C。
A82846C的紅外光譜(KBr壓片法)見圖3;A82846C在硫甘油中的FAB-MS見圖6;A82846C乙酸酯的核磁共振譜見圖9，溶劑為二甲亞砜-d，儀器為Bruker AM500型儀〔壓制HDO(水)峰〕，測試溫度為60℃。
實(shí)例8A82846鹽的制備步驟在每種情況下，將A82846組分(100mg)溶于去離子水(10ml)中。用0.5N的酸(HCl，H2SO4，H3PO4)調(diào)節(jié)該溶液pH值至3左右。經(jīng)冷凍干燥，析出適宜的鹽。特別要指出的是，若是pH值比3低得多時(shí)(即pH2)，則該成分將會(huì)降解。所得產(chǎn)量如下鹽 產(chǎn)量(mg)A82846A A82846BHCl 93.8 88.1H2SO492.5 75.4H3PO4110.8 105.7
實(shí)例9A82846A片劑配方可用下列原料，按下表所示量，制備A82846A的片劑。
原料成分 重量A82846A磷酸鹽 282.9mg徵晶纖維素 101.1mgCroscarmellose鈉 12.0mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 12.0mg硬脂酸鎂 3.0mg硬脂酸 4.0mg(純水 0.16ml)在一合適容器中加入A82846A磷酸鹽，一小部分微晶纖維素和一小部分Croscarmellose鈉，調(diào)和至均勻。配制聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，將該溶液加到配好的粉末中。將此混合物制成顆粒，必要時(shí)過篩，而后干燥。向該干燥的混合物中加進(jìn)剩余的微晶纖維素和Croscarmellose鈉，調(diào)和均勻，再加進(jìn)硬脂酸鎂和硬脂酸，調(diào)勻混合物，將生成的粉末狀混合物壓片。
實(shí)例10A82846B膠囊配方可用下列原料，按下表所示量，配制A82846B的膠囊。
原料成分 重量A82846B鹽酸鹽 262.2mg玉米淀粉細(xì)粉 137.7mg硅流體(350厘斯托克斯) 2.7mg玉米淀粉 147.1mg
在合適的容器中，將A82846B鹽酸鹽，淀粉細(xì)粉，硅流體(350厘斯托克斯)和淀粉粉末在合適的混合器中混勻。裝填入尺寸適宜的硬明膠膠囊內(nèi)。
實(shí)例11A82846A懸浮劑配方通過結(jié)晶或沉淀法制成無菌的不溶性形式的A82846A。研磨或篩選成粒子大小適宜于懸浮劑用的顆粒，將A82846A懸浮于下列賦形劑中。
原料成分 量卵磷脂 1%檸檬酸鈉 2%對(duì)羥苯甲酸丙酯 0.015%注射用水 適量至所需體積該懸浮劑可大量制備，并分裝到小瓶中，或者臨時(shí)制備，在小瓶中將賦形劑加到A82846A中去。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗生素A82846，A82846A，A82846B，或A82846C的工藝方法，它包括培養(yǎng)東方諾卡氏菌(Nocardia orientalis)NRRL 18098，NRRL 18099或NRRL 18100，或其能在含有可吸收碳、氮?dú)夂蜔o機(jī)鹽源的培養(yǎng)基內(nèi)，在液面下需氧發(fā)酵條件下產(chǎn)生A82846后代的工藝方法，接著可任意從發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)分離出抗生素，和/或使抗生素成鹽，若前者不呈鹽形式的話。
2.按照“權(quán)利要求
1”的工藝方法，制備A82846A或其符合藥物學(xué)上可接受的鹽。
3.按照“權(quán)利要求
1”的工藝方法，制備A82846B或其符合藥物學(xué)上可接受的鹽。
4.選自東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL 18099和NRRL 18100或其能產(chǎn)生A82846后代的生物純培養(yǎng)物。
專利摘要
用東方諾卡氏菌株NRRL 18098，NRRL18099和NRRL 18100生產(chǎn)新型糖肽抗生素A82846，包括A82846A，A82846B和A82846C。A82846抗生素與萬古霉素相比，具有抗革蘭氏陽性菌的活性。
文檔編號(hào)A61P31/04GK87106483SQ87106483
公開日1988年6月8日 申請(qǐng)日期1987年9月19日
發(fā)明者羅伯特·L·哈米爾, 詹姆斯·艾伯特·馬比, 戴維·弗朗西斯·馬奧尼, 沃爾特·中司三男, 姚慈晃 申請(qǐng)人:伊萊利利公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan