專利名稱：多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
肽抗生素(peptide antibiotic)，也稱抗微生物肽(antimicrobial peptide)，是一類由生物體基因編碼且具有抗病原體感染功能的肽類活性物質(zhì)，為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Fellermann K，et al.NEngl J Med..2003；348(4)361-363)。它們多由12-50個(gè)氨基酸組成，分子量小，通常帶有正電荷。研究表明，肽抗生素主要通過(guò)在細(xì)菌胞膜上打孔或形成離子通道而殺菌，這種獨(dú)特的抗菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素截然不同，高效而迅速，且細(xì)菌對(duì)之不易產(chǎn)生耐藥性。此外，肽抗生素還具有廣譜而高效的抗菌活性，對(duì)G+菌、G-菌、真菌、帶包膜病毒、原蟲(chóng)及腫瘤細(xì)胞都有著不同程度的殺滅作用(Hancock RE and Scott MG.Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A，2000；97(16)8856-8861)，某些種類對(duì)臨床上多種多藥耐受菌的MIC僅在mg/L水平(饒賢才等，生命的化學(xué)，2001；21(5)357-359)，可與傳統(tǒng)抗生素中活性最強(qiáng)者相媲美。在病原菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重的今天，肽抗生素有著廣闊的應(yīng)用前景。
高產(chǎn)率制備是肽抗生素開(kāi)發(fā)應(yīng)用的前提。然而，肽抗生素作為有殺菌活性的小肽分子，不宜直接利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。人們?cè)趯?shí)踐中主要通過(guò)篩選一個(gè)承載分子，構(gòu)建其與肽抗生素的融合蛋白表達(dá)載體，從而解決肽抗生素的高效表達(dá)及對(duì)工程菌的毒性問(wèn)題(Lee JH，et al.Biochem-biophy-Res，2000；227(4)575-580)，但在獲得融合蛋白后，又要將承載分子切去，最后制備目的肽抗生素的效率仍然很低。本發(fā)明采用多拷貝方式制備我們?cè)谇捌诠ぷ髦锌寺〉娜嗽处滦碗目股豩PAB(human peptide antibiotics)。
hPAB是由42個(gè)氨基酸組成的堿性多肽，等電點(diǎn)8.79，分子量4236，氨基酸序列為N-Gly-Ile-Gly-Asp-His-Val-Thr-Cys-Leu-Arg-Ser-Gly-Ala-Ile-Cys-His-His-Val-Ile-Cys-Pro-His-Arg-Ser-Arg-Gln-Ile-Gly-Thr-Cys-Gly-Val-Pro-Gly-Thr-Lys-Cys-Cys-Lys-Lys-Pro-Asn-C。本發(fā)明的目的就是要構(gòu)建hPAB的多拷貝體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)hPAB的高效率制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)hPAB氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，以含hPAB基因的PP-T重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出目的基因，并克隆入pQE-32原核表達(dá)載體，進(jìn)一步利用同裂酶構(gòu)建多拷貝重組質(zhì)粒，獲得含多拷貝hPAB的重組工程菌，最后以發(fā)酵方式獲得高純度、高活性的肽抗生素hPAB。
技術(shù)方案的具體步驟為1.hPAB的核苷酸序列為5’-GGCATCGGCGATCATGTTACCTGCCTTAGAAGTGGAGCCATTTGCCATCATGTCATATGTCCGCACAGGAGTAGGCAAATTGGCACCTGCGGTGTTCCTGGCACCAAATGTTGTAAAAAGCCAAAC-3’?？寺〉募夹g(shù)路線如下BamHI AvaIII Asn hPAB Gly PstIStop codon HindIII 2.根據(jù)上述克隆路線設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物上游引物P1 下游引物P2 3.PCR擴(kuò)增以含hPAB基因的PP-T重組質(zhì)粒為模板，用新合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為50μl。經(jīng)94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸40s擴(kuò)增2個(gè)循環(huán)后，再進(jìn)入94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸10min，1.2％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.目的片段的酶切消化取PCR反應(yīng)獲得的hPAB基因片段1μg，用BamHI、HindIII雙酶切，然后電泳酶切產(chǎn)物，回收所需條帶，溶于20μl重蒸水中；同樣取pQE-32表達(dá)質(zhì)粒1μg用BamHI/HindIII酶切，電泳并回收質(zhì)粒片段，溶于20μl位點(diǎn)重蒸水中。
5.連接反應(yīng)取步驟④中回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒各5μl，加T4DNA連接酶1.0μl，連接緩沖液1.5μl，重蒸水2.5μl，混勻后置16℃連接16小時(shí)。
6.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取步驟⑤所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物6μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)。取100μl轉(zhuǎn)化菌涂AMP平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
7.陽(yáng)性克隆的篩選在AMP平板上隨機(jī)挑取5個(gè)AMP抗性菌落，接種于5ml含100μg/ml AMP的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用BamHI，HindIII雙酶切及AvaIII(載體上無(wú)此酶位點(diǎn))單酶切初步篩選陽(yáng)性克隆，最后通過(guò)測(cè)序鑒定。所確定的陽(yáng)性重組子即為含單拷貝肽抗生素hPAB的重組質(zhì)粒，命名為pQE-hPAB-1。
8.多拷貝體的構(gòu)建利用同裂酶AvaIII(識(shí)別序列為ATGCA↓T)和PstI(識(shí)別序列為CTGCA↓G)切割靶序列后可形成相同粘性末端的特性，在將兩者分別酶切的產(chǎn)物用T4 Ligase連接后，連接處的堿基序列變?yōu)锳TGCAG，不再為二者所識(shí)別。大量制備含單拷貝hPAB的pQE-hPAB-1質(zhì)粒，把質(zhì)粒分為兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含單拷貝hPAB)，另一份用XhoI+PstI雙酶切后回收小片段(含單拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含雙拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-2；若再將pQE-hPAB-2質(zhì)粒分兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含雙拷貝hPAB)，另一份用XhoI+PstI雙酶切后回收小片段(含雙拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含四拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-4；若將上述雙酶切后含雙拷貝hPAB的大片段與含單拷貝hPAB的小片段連接即可獲得含三拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-3；如此重復(fù)，從理論上講，可構(gòu)建含任意拷貝hPAB的重組體。具體構(gòu)建策略見(jiàn)附圖-1所示。我們?cè)趯?shí)踐中成功構(gòu)建并獲得了含1～8拷貝hPAB的重組質(zhì)粒，分別命名為pQE-hPAB-1～8，用HindIII，BamHI雙酶切可見(jiàn)含不同拷貝hPAB的目標(biāo)片段(如附圖-2所示)。
9.多拷貝融合蛋白的表達(dá)將過(guò)夜培養(yǎng)的含多拷貝hPAB重組質(zhì)粒的重組菌株按1∶20的比例加入含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃下以160rpm轉(zhuǎn)速振搖培養(yǎng)3.5h，加入IPTG(終濃度為0.5×10-3mol/L)，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)4.5小時(shí)。將誘導(dǎo)后的菌液取100μl，6000rpm離心5min，取沉淀用Tricine-SDS-PAGE電泳觀察蛋白表達(dá)情況?？捡R氏亮藍(lán)R250染色后可見(jiàn)各多拷貝重組體均可表達(dá)預(yù)期大小的目的融合蛋白，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的15～25％(如附圖-3所示)。
10.最佳多拷貝重組菌的篩選分別誘導(dǎo)表達(dá)2～8拷貝重組工程菌，提取包涵體，用8mol/L尿素溶解。然后根據(jù)工程菌穩(wěn)定性、融合蛋白表達(dá)量、融合蛋白的溶解性等指標(biāo)來(lái)篩選最佳多拷貝重組菌。實(shí)驗(yàn)確定3拷貝重組菌為最佳重組菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵、分離純化后表明，三拷貝菌株具有良好的穩(wěn)定性，表達(dá)量占菌體蛋白的20％，所表達(dá)的融合蛋白能被8mol/L尿素溶解完全溶解，說(shuō)明三拷貝體工程菌符合后續(xù)的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。
11.融合蛋白的親和層析大量培養(yǎng)三拷貝工程菌，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，提取包涵體，選用Ni-NTA純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。包涵體溶解液于4℃以13000g離心20分鐘，吸取上清進(jìn)行親和層析，以buffer B(100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，pH6.3)沖洗層析柱，然后以buffer C(100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，pH4.5)洗柱，收集洗脫峰，即為目的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，三拷貝融合蛋白經(jīng)親和層析后純度達(dá)86％。
12.融合蛋白的化學(xué)裂解根據(jù)多拷貝體中各單體間有羥胺裂解位點(diǎn)(N-G)，三拷貝體經(jīng)羥胺裂解后可獲得3個(gè)單體。將洗脫的融合蛋白溶液調(diào)整為1.5mg/ml濃度，用10mol/LNaOH調(diào)pH到8.5，再加入8mol/L羥胺使終濃度為2mol/L，再用NaOH調(diào)pH到9.0。45℃攪拌裂解2小時(shí)，取10μl行SDS-PAGE電泳分析，確保裂解完全。
13.反向?qū)游黾兓痟PAB單體將羥胺裂解混合物用0.2μm的濾膜過(guò)濾，上樣至Soucre 30 RPC反相層析柱(16×250mm)，上樣緩沖液為含5％(v/v)乙腈的10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH4.4；用3倍柱床體積的復(fù)性緩沖液(0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0，0.3mol/L NaCl，3mmol/L還原型谷胱甘肽，0.3mmol/L氧化型谷胱甘肽)洗柱，使目的單體充分復(fù)性；再用60％的乙腈梯度洗脫，可收集兩個(gè)洗脫峰，第一個(gè)峰出現(xiàn)在30％乙腈梯度處，為復(fù)性了的hPAB單體(占60％)，第二個(gè)峰出現(xiàn)在50％乙腈梯度處，為未復(fù)性的hPAB單體。
14.復(fù)性hPAB單體的離子交換層析純化將反向?qū)游鍪占牡谝环謇鋬龀楦桑谜麴s水稀釋為2mg/ml濃度，上樣于Macro prepHigh S(Bio-Rad)陽(yáng)離子交換柱(16mm×200mm)，平衡緩沖液為50mmol/L Tris-Cl，pH7.5，100mmol/L NaCl，再用NaCl梯度洗脫，收集洗脫峰。
15.目的肽的葡聚糖凝膠層析純化將離子交換的洗脫峰再用Bio-gel P6(分離Mr范圍1×103～6×103)凝膠柱分離純化，流動(dòng)相為10mmol/L磷酸緩沖液，PH7.0，流速0.3ml/min。層析峰經(jīng)Tris-Tricine電泳分析，純度達(dá)98％。
16.重組hPAB的殺菌活性分析將經(jīng)上述工藝路線制備的hPAB用蒸餾水調(diào)整為1mg/ml濃度，點(diǎn)20μl于接種了各實(shí)驗(yàn)菌的平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，可見(jiàn)重組的hPAB對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌以及對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌等都有很好的殺菌活性。適合作為抗生素類藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。
以上這些技術(shù)步驟展示了本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用。正如上所述，本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB的多拷貝體構(gòu)建，成功獲得了可表達(dá)1～8個(gè)拷貝hPAB的工程菌株?？梢?jiàn)，本發(fā)明構(gòu)建肽抗生素的多拷貝體，從而將肽抗生素單體對(duì)原核微生物宿主細(xì)胞的毒性降到最低限度，實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB的高效表達(dá)。以優(yōu)選的三拷貝菌株為例，雖然工程菌所表達(dá)的融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的20％，但相對(duì)常規(guī)的制備單拷貝體的工藝技術(shù)而言，生產(chǎn)效率提高了200％。本發(fā)明探索出了重組hPAB特定的制備工藝，提供了工藝流程的詳細(xì)步驟，制備的重組肽抗生素hPAB純度達(dá)98％以上，滿足新藥制備的需要。


附圖1肽抗生素hPAB多拷貝體構(gòu)建示意圖。
附圖2多拷貝體的酶切鑒定。如圖中所示，1～8拷貝體重組質(zhì)粒分別經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切后，左起第二至第八泳道顯示了能從相應(yīng)的陽(yáng)性重組子中酶切出分別含一至八個(gè)拷貝hPAB基因的目的片段，第一泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250bp。
附圖3多拷貝體的蛋白表達(dá)。將1～8拷貝的工程菌用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Tricine電泳結(jié)果如圖所示，左起第二至第八泳道顯示了含相應(yīng)陽(yáng)性重組子的工程菌能表達(dá)預(yù)期大小的目標(biāo)融合蛋白，表達(dá)量為宿主菌總蛋白的15～25％，其中，七拷貝重組菌表達(dá)的融合蛋白正好和宿主菌的一條蛋白帶重疊。第一泳道為蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為66，45，36，29，24，20.1，14.4kDa。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人致力于解決肽抗生素生產(chǎn)過(guò)程中的低產(chǎn)率和高成本問(wèn)題，成功地通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB多拷貝體的構(gòu)建及在原核微生物宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而達(dá)到高效制備肽抗生素。采用三拷貝工程菌發(fā)酵，以30L發(fā)酵罐為例，每升發(fā)酵液收菌10克，30L共發(fā)酵30×10＝300克，2天為一個(gè)發(fā)酵周期，每周發(fā)酵3次，每個(gè)月發(fā)酵12次，共收菌300×12＝3600克；以表達(dá)量15％計(jì)，純化效率50％，每個(gè)月可生產(chǎn)hPAB單體3600×15％×50％＝270克。每支藥0.5毫克，共裝270000÷0.5＝540000支，每支售價(jià)按20元計(jì)，月產(chǎn)值為540000×20＝10800000元，年產(chǎn)值為10800000×12＝129800000元，即1.298億元。
權(quán)利要求
1.多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備，其特征是首先根據(jù)肽抗生素hPAB氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物上游引物P1 下游引物P2 然后通過(guò)PCR技術(shù)在hPAB基因的5’端依次加上核酸內(nèi)切酶BamHI、AvaIII，天冬酰胺對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，在hPAB基因的3’端依次加上甘氨酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，核酸內(nèi)切酶PstI，終止密碼子TAA和核酸內(nèi)切酶HindIII。PCR產(chǎn)物回收后用BamHI和HindIII酶切，用T4 DNA連接酶將之連接到pQE-32表達(dá)質(zhì)粒的BamHI/HindIII位點(diǎn)上，采用酶切、核苷酸測(cè)序篩選陽(yáng)性重組子。提取陽(yáng)性重組子質(zhì)粒，分為兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含單拷貝hPAB)，另一份用Xho I+Pst I雙酶切后回收小片段(含單拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含雙拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-2；若再將pQE-hPAB-2質(zhì)粒分兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含雙拷貝hPAB)，另一份用Xho I+Pst I雙酶切后回收小片段(含雙拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含四拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-4；若將上述雙酶切后含雙拷貝hPAB的大片段與含單拷貝hPAB的小片段連接即可獲得含三拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-3；如此重復(fù)，分別構(gòu)建含1～8拷貝hPAB重組體的工程菌，進(jìn)行表達(dá)。上述克隆的技術(shù)路線如下BamHI AvaIII Asn hPABGly PstI Stop codon HindIIIGGATCC GATGCA AAC ＝ GGC CTGCAT TAA AAGCTT
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備，其特征是肽抗生素hPAB以1～8拷貝的形式在大腸桿菌中表達(dá)，所不同的是，在1～8拷貝體的基礎(chǔ)上再用XhoI+AvaIII和XhoI+PstI酶切后進(jìn)行串聯(lián)，可獲得9拷貝，10拷貝，11拷貝，……，16拷貝的重組體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多拷貝串聯(lián)體，其特征為三拷貝體是依據(jù)工程菌穩(wěn)定性、融合蛋白表達(dá)量、融合蛋白的溶解性而篩選出來(lái)的最佳重組菌，三拷貝體的氨基酸序列如下MRGSHHHHHHTDPMHNGIGDHVTCLKSGAICHHVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKPNGLHNGIGDHVTCLKSGAICHHVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKPNGLHNGIGDHVTCLKSGAICHHVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKPNGLQ。其特征在于，它為一段含肽抗生素hPAB三個(gè)串聯(lián)拷貝的堿性多肽，等電點(diǎn)(pI)為9.17，分子量為16639Da。
4.如權(quán)利要求3所述的三拷貝體，其特征是在重組體中含有6個(gè)羥胺的裂解位點(diǎn)(N-G)，分別位于每個(gè)肽抗生素hPAB單體的頭部和尾部。這樣，獲得的一個(gè)三拷貝重組體經(jīng)羥胺裂解可得3個(gè)hPAB單體，經(jīng)后續(xù)的反相、陽(yáng)離子交換、分子篩層析可方便地獲得有殺菌活性的hPAB。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備方法。通過(guò)分子生物學(xué)操作，將hPAB構(gòu)建成多拷貝體，并由表達(dá)載體介導(dǎo)在大腸桿菌中高效表達(dá)，多拷貝體表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的15～25％。以三拷貝工程菌為例，表達(dá)量為20％，純化的一個(gè)三拷貝體分子經(jīng)裂解可獲得3個(gè)活性單體，制備效率增加了200％。本發(fā)明公開(kāi)的制備方法具有分離純化方法簡(jiǎn)單，成本低，易于放大，產(chǎn)物純度高、殺菌力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保鮮及護(hù)膚品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1560253SQ20041000753
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者胡福泉, 饒賢才, 黎庶, 胡金川 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)