背景

白介素2(IL-2)是主要由活化的CD4⁺T細(xì)胞產(chǎn)生的多能細(xì)胞因子，其在產(chǎn)生正常免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。IL-2促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞的增殖和擴(kuò)增，增強(qiáng)B細(xì)胞生長，并且活化單核細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。正是憑借這些活性，IL-2得到測試并且用作癌癥的批準(zhǔn)治療(阿地白介素(aldesleukin)，)。

在真核細(xì)胞中，人IL-2作為153個(gè)氨基酸的前體多肽合成，從所述前體多肽中去除20個(gè)氨基酸以產(chǎn)生成熟的分泌性IL-2(Taniguchi 1983)。重組人IL-2已在大腸埃希氏菌(E.coli)(Rosenberg 1984)、昆蟲細(xì)胞(Smith 1985)和哺乳動(dòng)物COS細(xì)胞(Taniguchi 1983)中產(chǎn)生。

白介素-2(IL-2)是首先被鑒定為T細(xì)胞生長因子的四α-螺旋束I型細(xì)胞因子(Morgan等人，Science 193：1007(1976))，但隨后顯示其具有廣泛的作用。IL-2促進(jìn)T輔助分化(Zhu等人，Annual review of immunology 28：445(2010)；Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008)；及Liao等人，Nat Immunol 12：551(2011))和調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的發(fā)育(Cheng等人，Immunol Rev 241：63(2011))，誘導(dǎo)天然殺傷和淋巴因子活化的殺傷活性(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，并介導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)(Lenardo等人，Nature 353：858(1991))。

IL-2通過與三種不同的受體相互作用起作用：白介素2受體α(IL-2Rα；CD25)、白介素2受體β(IL-2Rβ；CD122)和白介素2受體γ(IL-2Rγ；CD132；共同γ鏈)。待鑒定的第一種受體是IL-2Rα，其是在T細(xì)胞活化后出現(xiàn)的55kD多肽(p55)，并且最初被稱為Tac(代表T活化)抗原。IL-2Rα以約10^-8M的K_d結(jié)合IL-2，并且也被稱為“低親和力”IL-2受體。IL-2與僅表達(dá)IL-2Rα的細(xì)胞的結(jié)合不導(dǎo)致任何可檢測的生物學(xué)應(yīng)答。

IL-2經(jīng)由靜息T細(xì)胞和NK細(xì)胞上的中間親和力受體(K_d約10^-9M)(其由IL-2Rβ和共同的細(xì)胞因子受體γ鏈γ_c(IL-2Rγ)組成)或經(jīng)由活化的淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞(其另外表達(dá)IL-2Rα(CD25))上的高親和力受體(K_d約10^-11M)發(fā)信號(Lenardo等人，Nature 353：858(1991)；及Yuan等人，Immunol Rev 259：103(2014))。鑒于γ_c由IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受體共享(Leonard等人，Nature Reviews Immunology 1：200(2001))并且由具有X染色體連鎖性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的人中突變的基因編碼(Noguchi等人，Cell 73：147(1993年4月9日))，IL-2Rβ被IL-15的受體共享(Waldmann，Nature Reviews Immunology 6：595(2006))，IL-15是一種對于NK細(xì)胞和記憶CD8⁺T細(xì)胞的正常發(fā)育至關(guān)重要的細(xì)胞因子(Waldmann，Nature Reviews Immunology 6：595(2006))。

結(jié)合其受體的IL-2和IL-15的三維結(jié)構(gòu)提供了對受體裝配和信號傳導(dǎo)的了解(Wang等人，Science 310：1159(2005)；及Ring等人，Nat Immunol 13：1187(2012))。除了它們在正常免疫應(yīng)答中的生理作用之外，IL-2和IL-15還可以促進(jìn)病理應(yīng)答，并且治療目標(biāo)是維持這些細(xì)胞因子的期望作用，同時(shí)阻斷不利的自身免疫或免疫抑制應(yīng)答。針對人IL-2Rα的兩種單克隆抗體(mAb)，即達(dá)利珠單抗(Daclizumab)和巴利昔單抗(Basiliximab)得到FDA批準(zhǔn)，并且在腎移植排斥(Vincenti等人，N Engl J Med 338：161(1998))、心臟移植(Hershberger等人，N Engl J Med 352：2705(2005))、多發(fā)性硬化(Gold等人，Lancet 381：2167(2013))和哮喘(Bielekova等人，Proc Natl Acad Sci USA 101：8705(2004)；及Busse等人，Am J Respir Crit Care Med 178：1002(2008))中展現(xiàn)出功效，但是它們不經(jīng)由NK和記憶CD8⁺細(xì)胞上表達(dá)的中間親和性IL-2Rβ-γ_c受體阻斷IL-2信號傳導(dǎo)并且不能阻斷IL-15信號傳導(dǎo)(Tkaczuk等人，Am J Transplant 2：31(2002))。雖然抗-人IL-2Rβ mAb Mikβ1可以阻斷IL-2和IL-15向表達(dá)IL-2Rβ-γ_c受體的細(xì)胞的反式呈遞(trans-presentation)(Morris等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：401(2006))，但是它在經(jīng)由其高親和力異三聚體受體復(fù)合物阻斷通過IL-2或IL-15的反式信號傳導(dǎo)中是相對無效的(Morris等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：401(2006)；及Waldmann等人，Blood 121：476(2013))。因此，需要可阻斷一種或多種IL-2和/或IL-15功能的新型IL-2突變蛋白。本公開提供了用作IL-2部分激動(dòng)劑和拮抗劑的新型IL-2突變蛋白。

概述

IL-2對免疫系統(tǒng)發(fā)揮了廣譜的作用，并且它在調(diào)節(jié)免疫活化和穩(wěn)態(tài)兩者中發(fā)揮重要的作用。作為免疫系統(tǒng)刺激劑，IL-2已經(jīng)在治療癌癥和慢性病毒感染中得到應(yīng)用。IL-2的刺激影響也可以導(dǎo)致破壞，介導(dǎo)自身免疫和移植物排斥。由于其在免疫調(diào)節(jié)和疾病中的工具性作用，鑒定新型IL-2分子，如IL-2部分激動(dòng)劑和拮抗劑仍然是研究的活躍領(lǐng)域。

基于對IL-2與其關(guān)聯(lián)受體如何相互作用的新了解，本文中提供了新型IL-2組合物。在大多數(shù)情況下，IL-2經(jīng)由三種不同受體起作用：IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。大多數(shù)細(xì)胞，如靜息T細(xì)胞不響應(yīng)IL-2，由于它們僅表達(dá)IL-2Rβ和IL-2Rγ(它們對IL-2具有低親和力)。在刺激時(shí)，靜息T細(xì)胞表達(dá)相對高親和力IL-2受體IL-2Rα。IL-2與IL-2Rα的結(jié)合引起此受體序貫結(jié)合IL-2Rβ，和IL-2Rγ，引起T細(xì)胞活化。

先前開發(fā)出由于對IL-2Rβ的增強(qiáng)的結(jié)合親和力而具有提升的作用的IL-2“超級因子(superkine)”(Levin等人，Nature 484：529(2012))。假設(shè)此高親和力超級因子/IL-2Rβ復(fù)合物可以充當(dāng)顯性陰性支架以創(chuàng)建“受體信號傳導(dǎo)夾”以阻斷內(nèi)源信號傳導(dǎo)。定向突變這些超級-IL-2“完全激動(dòng)劑”以降低對IL-2Rγ_c的結(jié)合會減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化，并且代表新一類的基于機(jī)制的IL-2部分激動(dòng)劑和非信號傳導(dǎo)(中性)分子，其通過阻斷內(nèi)源細(xì)胞因子并且自身不施加作用而在功能上起拮抗劑的作用(參見圖1中的示意圖)。

本文中提供了新型人白介素-2(IL-2)突變蛋白或其變體。具體地講，提供了IL-2突變蛋白，其具有升高的對IL-2Rβ受體的結(jié)合能力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合能力。例如，此類IL-2突變蛋白在降低或抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能為有用的應(yīng)用中(例如，在治療移植物抗宿主病(GVHD)和成人T細(xì)胞白血病中)作為IL-2部分激動(dòng)劑和拮抗劑得到應(yīng)用。還提供了編碼此類IL-2突變蛋白的核酸、制備此類IL-2突變蛋白的方法、包含此類IL-2突變蛋白的藥物組合物和使用此類IL-2突變蛋白的治療方法。

在一個(gè)方面中，本文中提供了IL-2突變蛋白，所述IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力(hIL-2)。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白包含：(a)提供IL-2Rβ結(jié)合親和力的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其選自根據(jù)野生型hIL-2編號的氨基酸位置24、65、74、80、81、85、86、89、92和/或93；和(b)降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其選自根據(jù)野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22、126和/或130。

在多個(gè)實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I93或其組合。在某些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在一些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，所述提高IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、R81T、L85V和I92F。

在一些實(shí)施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括氨基酸取代L18R、Q22E、A126T和/或S130R或其組合。在具體的實(shí)施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括Q126T。在某些實(shí)施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R和Q22E。在一些實(shí)施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R、Q22E和Q126T。在某些實(shí)施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R、Q22E、Q126T和S130R。

在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。

在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。

在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、Q126T和I92F。

在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R。

在某些實(shí)施方案中，主題IL-2突變蛋白與野生型hIL-2相比具有降低的刺激IL-2Rβ+T細(xì)胞中的STAT5磷酸化的能力。在一些實(shí)施方案中，T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，主題IL-2突變蛋白與野生型hIL-2相比具有降低的刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的pERK1/ERK2信號傳導(dǎo)的能力。

在某些實(shí)施方案中，主題IL-2突變蛋白是IL-2和/或IL-15拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是CD8+T細(xì)胞中的IL-2和/或IL-15STAT5磷酸化的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2和/或IL-15誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞增殖的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性的TCR誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性Th1、Th9和/或Treg分化的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是Th17分化的促進(jìn)劑。在一些實(shí)施方案中，突變蛋白是NK細(xì)胞的IL-2依賴性活化的抑制劑。

在另一個(gè)方面中，本文中提供了IL-2突變蛋白融合蛋白，其包含與人Fc抗體片段連接的本文中描述的任一種IL-突變蛋白。

在另一個(gè)方面中，本文中提供了藥物組合物，其包含本文中描述的任一種IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白融合蛋白和藥學(xué)可接受載體。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

在又一個(gè)方面中，本文中提供了治療患有移植物抗宿主病(GVHD)的受試者的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，方法包含對受試者施用治療有效量的包含本文中公開的任一種IL-2突變蛋白的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

在另一個(gè)方面中，本文中提供了治療患有成人T細(xì)胞白血病的受試者的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含本文中公開的任一種IL-2突變蛋白的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

附圖說明

圖1顯示了用于產(chǎn)生本文中提供的主題IL-2突變蛋白的示意圖。左邊，在IL-2上，綠色區(qū)域指示先前報(bào)道的變化以產(chǎn)生對IL-2Rβ具有高親和力結(jié)合的H9“超級IL-2”，從而阻斷內(nèi)源性IL-2的結(jié)合。紅色圓圈指示IL-2的變化，其降低與IL-2Rγ_c的結(jié)合和IL-2Rβ-γ_c異二聚化。右邊，根據(jù)對IL-2Rγ_c結(jié)合的破壞水平，應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生不同水平的活性和功能，如指示。

圖2顯示了如本文中描述的IL-2突變蛋白文庫的FACS概貌。將人IL-2基因的易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行選擇。經(jīng)由六輪選擇產(chǎn)生第一代IL-2文庫。使用與藻紅蛋白(PE)綴合的四聚體IL-2Rβ進(jìn)行第一輪以結(jié)合表達(dá)IL-2突變蛋白的酵母(A)。使用用PE標(biāo)記的單體IL-2Rβ實(shí)現(xiàn)選擇的后續(xù)輪次。(B)來自第二代IL-2文庫的結(jié)果。

圖3描繪了相對于野生型IL-2序列顯示的具有高親和力IL-2Rβ結(jié)合的IL-2突變蛋白中改變的氨基酸殘基。還顯示了每種突變蛋白和IL-2對IL-2Rβ的結(jié)合親和力。

圖4顯示了對IL-2Rβ具有高親和力結(jié)合的IL-2突變蛋白對CD25^-和CD25⁺天然殺傷(NK)細(xì)胞的刺激作用。在經(jīng)處理的(A)CD25^-和(B)CD25⁺YT-1NK細(xì)胞中證實(shí)的野生型IL-2和IL-2突變蛋白6-6、D10、和H9對STAT5磷酸化的劑量響應(yīng)關(guān)系。圓圈野生型IL-2；正方形6-6；三角形向上H9；三角形向下D10。

圖5顯示了IL-2突變蛋白結(jié)合的CD25非依賴性。CD25^-和CD25⁺YT-1NK細(xì)胞的STAT5磷酸化的劑量響應(yīng)曲線。(A)IL-2和IL-2(F42A)(圓圈，實(shí)線野生型IL-2，CD25+細(xì)胞；正方形，實(shí)線IL-2F42A，CD25+細(xì)胞；三角形向上，虛線野生型IL-2，CD25-細(xì)胞；三角形向下，虛線，IL-2F42A，CD25-細(xì)胞)。(B)H9和H9(F42A)(圓圈，實(shí)線野生型H9，CD25+細(xì)胞；正方形，實(shí)線H9F42A，CD25+細(xì)胞；三角形向上，虛線H9，CD25-細(xì)胞；三角形向下，虛線，H9F42A，CD25-細(xì)胞)。雖然F42A突變使CD25⁺細(xì)胞上的野生型IL-2的劑量響應(yīng)曲線向右轉(zhuǎn)變，但對CD25^-沒有觀察到的影響，H9和H9 F42A的劑量響應(yīng)曲線是基本上重疊的，不管CD25表達(dá)如何。

圖6描繪了幾種IL-2突變蛋白“超級激動(dòng)劑”(即，對IL-2Rβ具有高親和力結(jié)合的突變蛋白)在缺乏IL-2Rα的情況下刺激T細(xì)胞的能力。用IL-2突變蛋白或野生型IL-2刺激從CD25敲除小鼠分離的T細(xì)胞。提供了IL-2突變蛋白的劑量響應(yīng)曲線和響應(yīng)的EC50。如顯示，所有測試的IL-2突變蛋白相對于野生型IL-2在缺乏IL-2Rα的情況下導(dǎo)致相對升高的T細(xì)胞刺激。

圖7是比較IL-2突變蛋白“超級激動(dòng)劑”誘導(dǎo)有經(jīng)歷的T細(xì)胞刺激的相對能力的FACS分析。用兩種濃度的(10ng/ml或1ng/ml)的IL-2突變蛋白或野生型IL-2刺激T細(xì)胞。在每個(gè)FACS概貌中顯示了刺激的T細(xì)胞的百分比。

圖8顯示了IL-2“超級激動(dòng)劑”突變蛋白D10對天然殺傷(NK)細(xì)胞功能，特別是自發(fā)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響。將天然殺傷細(xì)胞(效應(yīng)子)和經(jīng)Cr⁵¹標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞(靶物)在存在野生型IL-2或IL-2突變蛋白D10的情況下與或不與抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)一起孵育5小時(shí)。NK細(xì)胞自發(fā)細(xì)胞毒性的D10刺激由于高劑量IL-2(*p＝0.008，**p＝0.001)，在沒有IL-2或D10刺激的情況下有最小的自發(fā)細(xì)胞毒性。此外，D10的添加增強(qiáng)西妥昔單抗抗體的ADCC。

圖9顯示了D10的晶體結(jié)構(gòu)。L85V的初始疏水核心突變導(dǎo)致靶向多個(gè)疏水性核心殘基和高親和力共有序列的第二代IL-2文庫。D10的晶體結(jié)構(gòu)在螺旋C之前的環(huán)區(qū)域中含有明確限定的電子密度。

圖10顯示了相對于IL-2，對IL-2Rβ具有高親和力結(jié)合的IL-2“超級激動(dòng)劑”突變蛋白展現(xiàn)出CD8⁺T細(xì)胞而非Treg的增強(qiáng)的刺激。在接受PBS、20μgIL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復(fù)合物(IL-2/mAb)的小鼠的脾中測定(A)宿主CD3⁺CD8⁺CD44^高記憶表型(MP)T細(xì)胞和(B)宿主CD3⁺CD4⁺CD25^高T細(xì)胞(調(diào)節(jié)T細(xì)胞)的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖11顯示了相對于IL-2，對IL-2Rβ具有高親和力結(jié)合的IL-2突變蛋白激動(dòng)劑展現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤響應(yīng)及降低的不利作用。肺水腫(肺濕重)充當(dāng)IL-2處理后不利毒性作用的量度，并通過在干燥之前和之后稱重肺測定(A)。P值意指治療方式之間的比較。*，p＜0.05；**，p＜0.01。(B)使用B16F10黑素瘤細(xì)胞在體內(nèi)測試IL-2突變蛋白的抗贅生性質(zhì)。給C57B1/6小鼠(n＝3-4只小鼠/組)皮下注射106個(gè)B16F10黑色素瘤細(xì)胞，然后一旦腫瘤結(jié)節(jié)變得可見和可觸摸(其通常對應(yīng)于腫瘤細(xì)胞注射后的第4至5天或約15mm²的腫瘤大小)，每天注射PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復(fù)合物(IL-2/mAb)達(dá)5天。顯示以mm²計(jì)的平均腫瘤面積(+/-SD)對腫瘤接種后的時(shí)間。P值意指IL-2與其它治療方式的比較。

圖12顯示了通過破壞γ_c結(jié)合產(chǎn)生基于機(jī)制的IL-2突變蛋白。(A)H9-IL-2Rβ-γ_c復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(H9是綠色；IL-2Rβ是藍(lán)色；γ_c是金色)。以青色顯示了對H9-RETR摻入以破壞IL-2與γ_c的相互作用的突變(L18R，Q22E，Q126T，和S130R)(圖的右邊部分)。(B，C)H9-IL-2Rβ(C)和H9-RET-IL-2Rβ(D)復(fù)合物對γ_c的結(jié)合的表面等離子體共振分析。

圖13顯示了對IL2Rγ_c具有降低的結(jié)合親和力的IL-2突變蛋白的減弱的信號傳導(dǎo)。(A，B)對野生型IL-2或各種H9變體測試其在CD25^-(A)和CD25⁺(B)YT-1人NK樣細(xì)胞中誘導(dǎo)STAT5磷酸化的能力。(C，D)相對于細(xì)胞因子刺激后CD25^-YT-1細(xì)胞中的最大表面表達(dá)，IL-2Rβ(C)和IL-2Rγ(D)的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)。(E)將新鮮分離的(上部圖)或預(yù)活化的(下部圖)的CD8⁺T細(xì)胞保持未刺激或者用1μg/ml IL-2、H9-RE、H9-T、H9-RET或H9-RETR刺激30分鐘。通過流式細(xì)胞術(shù)測定CD25表達(dá)(左圖)或pSTAT5(右圖)。(F)用IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR處理如指定的細(xì)胞，裂解，并且用針對pSTAT5或總STAT5的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。(G)由野生型IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET和H9-RETR誘導(dǎo)的pSTAT5的劑量響應(yīng)曲線。(H)由野生型IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR得到的磷酸-S6核糖體蛋白(pS6)的劑量響應(yīng)曲線。MFI，均值熒光強(qiáng)度。對于劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)(A，B，G，H)，橫坐標(biāo)指示以ng/ml計(jì)的細(xì)胞因子濃度的對數(shù)。MFI，均值熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)代表每組的至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)(誤差條，一式三份的S.E.M.)。

圖14顯示了在兩種不同測定中對IL2Rγ_c具有降低的結(jié)合親和力的IL-2突變蛋白的減弱的信號傳導(dǎo)。(A)CD25^-YT1人NK樣細(xì)胞上的磷酸-ERK1/ERK2蛋白的劑量響應(yīng)曲線。(B)新鮮分離的(上部圖)或預(yù)活化的(下部圖)人CD8⁺T細(xì)胞上的IL-2Rβ和IL-2Rγ表達(dá)的比較。數(shù)據(jù)代表每組的至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。誤差條代表一式三份的SEM.。

圖15顯示了響應(yīng)IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET和H9-RETR的增殖和CD25表達(dá)。由IL-2和H9而非由H9-RET或H9-RETR誘導(dǎo)新鮮分離的人CD8⁺T細(xì)胞的增殖的誘導(dǎo)，H9-T有中間作用。用CFSE標(biāo)記細(xì)胞，用指定的IL-2變體刺激，并且在5天后通過流式細(xì)胞術(shù)評估CFSE稀釋。

圖16顯示了H9-RET和RETR對增殖、STAT5結(jié)合、和基因表達(dá)的影響。(A)在具有不同濃度的指定的IL-2變體的96孔板中培養(yǎng)新鮮分離的和預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞達(dá)2天，并且測量[³H]-胸苷摻入。棒代表均值±S.E.M。從2名個(gè)體供體組合細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(B)用IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR(1μg/ml)處理24小時(shí)的預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞的RNA-Seq熱圖分析。顯示了基因，其表達(dá)相對于對照被IL-2上調(diào)或下調(diào)(根據(jù)顏色量表，在-1.00和1.00之間歸一化每種基因的表達(dá))。顯示了優(yōu)先上調(diào)(紅色)或下調(diào)(綠色)≥2倍的mRNA。(C)用指定的細(xì)胞因子刺激后上調(diào)(空心棒)或下調(diào)(實(shí)心棒)的mRNA數(shù)目。IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR分別誘導(dǎo)731、742、65和23種mRNA，并且抑制437、397、13和46種mRNA(倍數(shù)變化≥2；p值＜1e-10)。(D)基于ChIP-Seq的STAT5B結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目及其在用IL-2變體處理的預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中的全基因組分布。顯示了5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、外顯子、內(nèi)含子、和3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，如在人RefSeq數(shù)據(jù)庫(匯編GRCh37.p9)中限定。TSS上游的5kb稱為啟動(dòng)子區(qū)。(E)使用IL-2誘導(dǎo)的STAT5B峰實(shí)施熱圖聚簇，其以STAT“峰頂點(diǎn)”(以位置“0”指示)的上游約1kb和下游1kb為中心。由IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR誘導(dǎo)的結(jié)合強(qiáng)度以紅色的強(qiáng)度指示。(F)在保持未刺激或用IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR刺激24小時(shí)的預(yù)活化的細(xì)胞中相對于RPL7的IL2RA、LTA、CISH、IL7RA和BCL6 RNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)代表至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，除了RNA-Seq實(shí)驗(yàn)外，其中通過RT-PCR確認(rèn)選擇基因(參見文本)。

圖17描繪了用IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET或H9-RETR處理的預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞上的CD25表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖18顯示了H9-RETR抑制IL-2R介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。(A和B)H9-RET和H9-RETR是IL-2和IL-15的競爭性抑制劑。在缺乏或存在1μg/ml H9-RET或H9-RETR的情況下將預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞與指定濃度的IL-2或IL-15孵育。(C和D)H9-RETR在預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中比抗Tac或Mikβ1單抗更有效阻斷IL-2和IL-15誘導(dǎo)的STAT5磷酸化。(E和F)H9-RETR比抗Tac或Mikβ1更有效抑制IL-2誘導(dǎo)的或IL-15誘導(dǎo)的增殖。顯示了均值±S.E.M。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(G)H9-RETR在體內(nèi)抑制IL-2-誘導(dǎo)的(上圖)和IL-15誘導(dǎo)的(下圖)STAT5磷酸化。在IL-2或IL-15之前60分鐘向C57BL/6小鼠注射(i.p)Fc4或Fc4-H9-RETR。30分鐘后在脾CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T細(xì)胞中測量pSTAT5。指示MFI。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(H)Fc4-H9-RETR減弱GVHD。對BALB/c小鼠進(jìn)行輻照(950cGy)，并移植1000萬個(gè)T消耗的骨髓(BM)細(xì)胞，不含或含有來自C57BL/6小鼠的200萬個(gè)Treg消耗的泛-T細(xì)胞。通過以100μg/劑量每天兩次i.p.注射10天，用Fc4或Fc4-H9-RETR融合蛋白處理接受泛-T細(xì)胞的小鼠。數(shù)據(jù)表示從三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并的存活曲線，并使用Kaplan-Meier方法和對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對于Fc4對H9-RETR-Fc4，p＝0.0001。(I)如指示，在存在或缺乏UPC10，達(dá)利珠單抗，Mikβ1或H9-RETR的情況下阻斷用50U/ml IL-2培養(yǎng)3天的ED40515(+)T細(xì)胞的增殖。數(shù)據(jù)代表兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。(J)用UPC10、達(dá)克珠單抗、Mikβ1或H9-RETR處理的來自具有郁積型ATL的患者的細(xì)胞的自發(fā)性6天增殖測定。一式三份進(jìn)行測定。

圖19顯示IL-2突變蛋白H9-RET和h9-RETR對CD8+T細(xì)胞的影響。(A)H9-RET和H9-RETR抑制IL-2-誘導(dǎo)的CD25在預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞上的表達(dá)。(B)在存在或缺乏H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2刺激的預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞中的IL2RA mRNA水平(相對于RPL7表達(dá)歸一化)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(C)H9-RETR對IL-2-和IL-15誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制。新鮮分離的CD8⁺T細(xì)胞進(jìn)行CFSE標(biāo)記并在存在或缺乏1μg/ml H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2或IL-15(1μg/ml)刺激，并評估CFSE稀釋。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(A和C)或者自一式三份完成的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并(B)。

圖20顯示IL-2突變蛋白H9-RET和h9-RETR對CD8+T細(xì)胞的影響。(A)H9-RET和H9-RETR都抑制新鮮分離的CD8⁺T細(xì)胞的TCR誘導(dǎo)的增殖。細(xì)胞用CFSE標(biāo)記，在有或沒有1μg/ml的H9-RET或H9-RETR的情況下用平板結(jié)合的抗-CD3(2μg/ml)+可溶性抗CD28(1μg/ml)刺激4天，并且通過流式細(xì)胞術(shù)評估CFSE稀釋。(B)1μg/ml的H9-RET或H9-RETR抑制用2μg/ml抗CD3+1μg/ml抗-CD28刺激4天的外周血CD8⁺T細(xì)胞上的TCR誘導(dǎo)的CD25表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖21顯示H9-RET和H9-RETR阻斷Th1、Th9和Treg分化，但是促進(jìn)Th17分化。在缺乏或存在H9-RET或H9-RETR的情況下，在各種T輔助極化條件下分化細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表每種類型細(xì)胞的至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖22顯示H9-RETR阻斷IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性。(A)與IL-2不同，H9-RET和H9-RETR(1μg/ml)在孵育24小時(shí)后都不刺激原代人NK細(xì)胞中的CD69表達(dá)，但H9-RETR抑制IL-2(100ng/ml)誘導(dǎo)的CD69表達(dá)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。(B，C)H9-RET和H9-RETR都不刺激原代人NK細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，而10³ng/mL的H9-RETR抑制HER18(B)和K562(C)靶細(xì)胞的IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性。NK細(xì)胞和靶細(xì)胞在指定的細(xì)胞因子存在下以10∶1的比率孵育4小時(shí)。通過⁵¹Cr釋放測定HER18細(xì)胞裂解并一式三份進(jìn)行；通過流式細(xì)胞術(shù)評估K562細(xì)胞的裂解。進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖23是用于圖18G中的實(shí)驗(yàn)的方案的示意圖。

詳述

為了使本公開更容易理解，某些術(shù)語和短語在下面以及貫穿整個(gè)說明書定義。

定義

本文中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用方式整體并入，如同完全闡述一樣。除非另有定義，本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2001)；3月，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2001)；以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版，Cold Spring harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2001)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本公開中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。適當(dāng)時(shí)，涉及使用市售試劑盒和試劑的方法通常根據(jù)制造商定義的方案和/或參數(shù)進(jìn)行，除非另有說明。

如本文中所用，“IL-2”意指野生型IL-2，無論是天然的還是重組的。成熟的人IL-2作為133個(gè)氨基酸的序列(少信號肽，其由另外的20個(gè)N端氨基酸組成)發(fā)生，如Fujita等人，PNAS USA，80，7437-7441(1983)中描述。人IL-2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)見于Genbank，在登錄定位符(accession locator)NP_000577.2下。成熟人IL-2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：2中。鼠(小家鼠(Mus musculus))IL-2氨基酸序列見于Genbank，在登錄定位符(SEQ ID NO：3)下。成熟鼠IL-2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：4。

SEQ ID NO：1

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWTTFCQSIISTLT

SEQ ID NO：2

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWTTFCQSIISTLT

SEQ ID NO：3

MYSMQLASCVTLTLVLLVNSAPTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ

SEQ ID NO：4

APTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ

如本文中所用，“IL-2突變蛋白”意指已經(jīng)對白介素-2蛋白進(jìn)行特定取代的IL-2多肽。IL-2突變蛋白的特征在于在天然IL-2多肽鏈的其它殘基中或處的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的氨基酸插入，缺失，取代和修飾。根據(jù)本公開，任何此類插入，缺失，取代和修飾導(dǎo)致保留IL-2Rβ結(jié)合活性的IL-2突變蛋白。示例性突變蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)氨基酸的取代。

突變蛋白還包括在IL-2的其它位置處的保守修飾和取代(即，對突變蛋白的二級或三級結(jié)構(gòu)具有最小影響的那些)。此類保守取代包括Dayhoff在The Atlas of Protein Sequence and Structure 5(1978)和由Argos于EMBO J.，8：779-785(1989)中描述的那些。例如，屬于下組之一的氨基酸代表保守改變：第I組：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；組II：cys、ser、tyr、thr；組III：val、ile、leu、met、ala、phe；組IV：lys、arg、his；組V：phe、tyr、trp、his；和VI組：asp、glu。

“根據(jù)IL-2編號”意指參照在野生型IL-2的成熟序列中正常發(fā)生該氨基酸的位置來鑒定所選擇的氨基酸，例如R81意指存在于SEQ ID NO：2中的第81個(gè)氨基酸精氨酸。

術(shù)語“具有IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞類型”意指已知具有這種受體型的細(xì)胞，即T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞，B細(xì)胞，活化的單核細(xì)胞和活化的NK細(xì)胞。術(shù)語“具有IL-2Rβγ受體的細(xì)胞類型”意指已知具有該受體型的細(xì)胞，即B細(xì)胞，靜息單核細(xì)胞和靜息NK細(xì)胞。

如本文中所用，關(guān)于多肽或DNA序列的術(shù)語“同一性”意指兩個(gè)分子之間的亞基序列同一性。當(dāng)兩個(gè)分子中的亞基位置被相同的單體亞基(即，相同的氨基酸殘基或核苷酸)占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的。兩個(gè)氨基酸或兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性是相同位置數(shù)目的直接函數(shù)。一般來說，比對序列，使得獲得最高階匹配。如果必要，那么可以使用發(fā)表的技術(shù)和廣泛可用的計(jì)算機(jī)程序，如GCS程序包(Devereux等，Nucleic Acids Res.12：387，1984)，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul等，J.Molecular Biol.215：403，1990)計(jì)算同一性?？梢允褂眯蛄蟹治鲕浖?，如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包，以其默認(rèn)參數(shù)測量序列同一性。

術(shù)語“多肽”，“蛋白質(zhì)”或“肽”意指任何氨基酸殘基鏈，不管其長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)。

在本公開的突變體IL-2多肽是“基本上純的”的情況下，按重量(干重)計(jì)，它們可以是至少約60％感興趣的多肽，例如含有突變體IL-2氨基酸序列的多肽。例如，按重量計(jì)，多肽可以是至少約75％，約80％，約85％，約90％，約95％或約99％感興趣的多肽。純度可以通過任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法，例如柱色譜，聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測量。

“激動(dòng)劑”是與靶物相互作用以引起或促進(jìn)靶物的活化增加的化合物。

“部分激動(dòng)劑”是如下的化合物，其與激動(dòng)劑與相同的靶物相互作用，但是即使通過增加部分激動(dòng)劑的劑量也不產(chǎn)生與激動(dòng)劑一樣大的生物化學(xué)和/或生理作用的量級。

“超級激動(dòng)劑(super agonist)”是能夠產(chǎn)生比靶受體的內(nèi)源性激動(dòng)劑更大的最大應(yīng)答，并且因此具有超過100％的功效的一類激動(dòng)劑。

“拮抗劑”是例如通過阻止，減少，抑制或中和激動(dòng)劑的活性對抗激動(dòng)劑的作用的化合物?！稗卓箘边€可以阻止，抑制或降低靶物，例如靶受體的組成性活性，甚至在沒有鑒定的激動(dòng)劑的情況下。

“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列(即，編碼IL-2突變蛋白的序列)以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接于調(diào)節(jié)序列(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)將載體引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)?！罢{(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。參見例如Goeddel(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，SanDiego，Calif.)。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成性表達(dá)的那些，以及僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素。可以將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中，從而產(chǎn)生本文中公開的人IL-2突變蛋白或產(chǎn)生其生物活性變體。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，此類術(shù)語不僅指特定的受試細(xì)胞，而且指此類細(xì)胞的后代或潛在后代。因?yàn)槟承┬揎椏赡苡捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而在后代中發(fā)生，所以此類后代實(shí)際上可能不與親本細(xì)胞相同，但仍然包括在如本文中使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。

如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指用于將外來核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞中的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染、粒子槍或電穿孔。

如本文中所用，術(shù)語“藥學(xué)可接受載體”包括但不限于與藥物施用相容的鹽水，溶劑，分散介質(zhì)，涂層材料，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等張劑和吸收延遲劑等。補(bǔ)充的活性化合物(例如抗生素)也可以摻入組合物中。

如本文中所用，術(shù)語“癌癥”(或“癌性”)，“過度增殖性”和“贅生性”意指具有自主生長能力的細(xì)胞(即以快速增殖細(xì)胞生長為特征的異常狀態(tài)或狀況)。過度增殖性和贅生性疾病狀態(tài)可以分類為病理性(即表征或構(gòu)成疾病狀態(tài))，或者它們可以分類為非病理性(即，作為偏離正常，但與疾病狀態(tài)無關(guān))。該術(shù)語意在包括所有類型的癌性生長或致癌過程，轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織或器官，而不考慮組織病理學(xué)類型或侵入性階段?！安±硇赃^度增殖”細(xì)胞發(fā)生在以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)中。非病理性過度增殖性細(xì)胞的實(shí)例包括與傷口修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞增殖。術(shù)語“癌癥”或“腫瘤”用于指各種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，包括影響肺，乳腺，甲狀腺，淋巴腺和淋巴樣組織，胃腸器官和泌尿生殖道的惡性腫瘤，以及腺癌，其通常認(rèn)為包括惡性腫瘤，如大多數(shù)結(jié)腸癌，腎細(xì)胞癌，前列腺癌和/或睪丸腫瘤，非小細(xì)胞肺癌，小腸癌和食管癌。

術(shù)語“癌”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并且意指上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌，胃腸系統(tǒng)癌，泌尿生殖系統(tǒng)癌，睪丸癌，乳腺癌，前列腺癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤?！跋侔币庵冈醋韵俳M織或其中腫瘤細(xì)胞形成可識別的腺體結(jié)構(gòu)的癌。

如本文中所用，術(shù)語“造血贅生性病癥”意指涉及造血起源的增生性/贅生性細(xì)胞的疾病，例如源自髓樣，淋巴樣或紅細(xì)胞樣譜系或其前體細(xì)胞。優(yōu)選地，疾病源自分化不良的急性白血病(例如，成紅細(xì)胞性白血病和急性巨核細(xì)胞白血病)。其它示例性髓樣病癥包括但不限于急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APML)，急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(綜述于Vaickus，L.(1991)Crit Rev.，Oncol./Hemotol 11：267-97)；淋巴樣惡性腫瘤包括但不限于急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，包括B譜系A(chǔ)LL和T譜系A(chǔ)LL，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，幼淋巴細(xì)胞白血病(PLL)，毛細(xì)胞白血病(HLL)和瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血癥(WM)。惡性淋巴瘤的其它形式包括但不限于非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤及其變體，外周T細(xì)胞淋巴瘤，成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)，大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病(LGF)，霍奇金病和Reed Stemberg病。

IL-2突變蛋白

IL-2突變蛋白部分激動(dòng)劑和拮抗劑

在一個(gè)方面中，本文中提供作為部分激動(dòng)劑和拮抗劑的IL-2突變蛋白。在某些實(shí)施方案中，本文中提供了與野生型IL-2(例如，人IL-2，SEQ ID NO：2)相比含有一個(gè)或多個(gè)降低IL-2突變蛋白對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力的突變的IL-2突變蛋白。如本文中所用，術(shù)語“共同γ_c鏈”、“IL-2Rγ_c”、“Yc”、“IL-2Rγ”、“IL-2受體亞基γ”和“IL-2RG”(Genbank登錄號：NM_000206和NP_000197(人)和NM_013563和NP_038591(小鼠))均指I型細(xì)胞因子受體家族的成員，其是針對至少6種不同白介素受體的受體復(fù)合物的細(xì)胞因子受體亞基，包括但不限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受體。IL-2Rγ_c與IL-2Rβ相互作用，以主要在記憶T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞上形成中間親和力IL-2受體，并與IL-2Rα和IL-2Rβ相互作用，以在活化的T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)上形成高親和力IL-2受體。不受任何特定運(yùn)行理論束縛，認(rèn)為此類突變蛋白可以通過在結(jié)合IL-2Rβ+/IL-2Rγ_c+細(xì)胞(例如靜息T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞)上的IL-2Rβ時(shí)減弱或抑制IL-2β/IL-2γ_c異二聚化和信號傳導(dǎo)而用作IL-2部分激動(dòng)劑或拮抗劑的功能。

示例性的主題IL-2突變蛋白在至少約50％、至少約65％、至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約87％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％約99％與野生型IL-2相同。突變可以由氨基酸殘基的數(shù)量或含量的變化組成。例如，突變體IL-2可以具有比野生型IL-2更大或更小數(shù)目的氨基酸殘基?；蛘呋蛄硗猓纠酝蛔凅w多肽可以含有存在于野生型IL-2中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代。在多個(gè)實(shí)施方案中，突變體IL-2多肽可以通過單個(gè)氨基酸殘基的添加，缺失或取代而不同于野生型IL-2。

作為說明，包括與參考氨基酸序列SEQ ID NO：2至少95％相同的氨基酸序列的IL-2突變蛋白是除了包括SEQ ID NO：2的參考氨基酸序列的多至5個(gè)改變外包含與參考序列相同的序列的多肽。例如，參考序列中高達(dá)5％的氨基酸殘基可以缺失或用另一個(gè)氨基酸取代，或可以將參考序列中總氨基酸殘基的高達(dá)5％的氨基酸數(shù)目插入?yún)⒖夹蛄兄小⒖夹蛄械倪@些改變可發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基(N--)或羧基(C--)末端位置或在那些末端位置之間的任何位置，在參考序列的殘基之間個(gè)別或在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中散布。

在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以比野生型IL-2小至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的親和力結(jié)合IL-2Rγ_c。IL-2突變蛋白的結(jié)合親和力也可以表示為比野生型IL-2低1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250或更多倍的對IL-2γ_c的親和力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法測量主題IL-2突變蛋白對IL-2γ_c的結(jié)合親和力。用于測量IL-2Rγ_c結(jié)合的合適方法包括但不限于放射性配體結(jié)合測定(例如飽和結(jié)合，斯卡恰特(scatchard)圖，非線性曲線擬合程序和競爭結(jié)合測定)；非放射性配體結(jié)合測定(例如，熒光偏振(FP)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和表面等離子體共振測定(參見例如Drescher等人，Methods Mol Biol 493：323-343(2009))；液相配體結(jié)合測定(例如實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)和免疫沉淀)；和固相配體結(jié)合測定(例如多孔板測定，珠上配體結(jié)合測定，柱上配體結(jié)合測定，和濾器測定)。

在某些實(shí)施方案中，相對于野生型IL-2，IL-2突變蛋白破壞IL-2Rβ與IL-2Rγ_c的締合，使得該IL-2Rβ/IL-2Rγ_c相互作用減少約2％，約5％、約10％、約15％、約20％、約50％、約75％、約90％、約95％或更多。

在一些實(shí)施方案中，降低IL-2突變蛋白對IL-2Rγ_c受體的結(jié)合親和力的一個(gè)或多個(gè)突變是氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，與野生型IL-2(SEQ ID NO：2)相比，主題IL-2突變蛋白由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸取代組成。取代的氨基酸殘基可以是但不一定是保守取代，其通常包括下組內(nèi)的取代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸；精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在具體的實(shí)施方案中，取代位于接觸IL-2Rγ_c結(jié)合界面的IL-2的氨基酸殘基處。

在某些實(shí)施方案中，氨基酸取代是選自根據(jù)野生型hIL-2(例如，SEQ ID NO：2)編號的位置：18、22、126和/或130的野生型IL-2的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的取代。在某些實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括氨基酸取代L18R、Q22E、A126T和/或S130R或其組合。

在一些實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括Q126T。在其它實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R和Q22E。在一些實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R，Q22E和Q126T。在其它實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的氨基酸取代包括L18R，Q22E，Q126T和S130R。

在一些實(shí)施方案中，對IL-2Rβ受體具有降低的結(jié)合親和力的IL-2突變蛋白還包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)或更多個(gè)增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的突變。如本文中所用，術(shù)語“IL-2Rβ”和“CD122”(Genbank登錄號NM_000878和NP_000869(人))均指I型細(xì)胞因子受體家族的成員，其與IL-2Rγ_c相互作用以主要在記憶T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞上形成中間親和力IL-2受體，并與IL-2Rα和IL-2Rγ_c相互作用，以在活化的T細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)上形成高親和力IL-2受體。不受任何具體的運(yùn)行理論束縛，認(rèn)為具有對IL-2Rβ的強(qiáng)結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c的弱結(jié)合親和力的此類IL-2突變蛋白充當(dāng)顯性陰性支架以產(chǎn)生“受體信號傳導(dǎo)夾”以阻斷內(nèi)源信號傳導(dǎo)。此類IL-2突變蛋白將減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化，并且代表一類新型基于機(jī)制的IL-2部分激動(dòng)劑和非信號傳導(dǎo)(中性)分子，其通過阻斷內(nèi)源性細(xì)胞因子并且不自身施加作用在功能上起拮抗劑作用(參見圖1中的示意圖)。

在某些實(shí)施方案中，相對于野生型IL-2(例如，SEQ ID NO：2)，主題IL-2突變蛋白包括至少一個(gè)突變(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)氨基酸殘基的缺失、添加或取代)，并且以比野生型IL-2更高的親和力結(jié)合IL-2Rβ。

在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以比野生型IL-2大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的親和力結(jié)合IL-2Rβ。IL-2突變蛋白的結(jié)合親和力也可以表示為比野生型IL-2大1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250或更多倍的對IL-2Rβ的親和力?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法評估主題IL-2突變蛋白與IL-2Rβ的結(jié)合，包括但不限于上述方法。

在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的至少一個(gè)突變是氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括在根據(jù)野生型hIL-2(SEQ ID NO：2)編號的氨基酸位置I24、P65、Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、和/或V93處的取代：在某些實(shí)施方案中，取代包括I24V、P65H、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、和/或V93I或其組合。在某些實(shí)施方案中，取代包括Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V、和/或I93V或其組合。

在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、和I92F。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，增加IL-2Rβ結(jié)合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、R81T、L85V和I92F。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：5)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：6)。

在示例性實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：7)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：8)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：9)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：10)。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：11)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中、IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：12)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中、IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：13)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：14)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：15)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：16)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：17)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：18)。

在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：19)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：20)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：21)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：22)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：23)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：24)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：25)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：26)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：27)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：28)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74S、R81T、L85V、I92F和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：29)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、R81T、L85V、和I92F。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：30)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22S、Q74H、R81T、L85V、I92F、和Q126T。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：31)。

在一些實(shí)施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結(jié)合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結(jié)合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22S、Q74H、R81T、L85V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：32)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，主題IL-2突變蛋白具有根據(jù)下式的氨基酸序列：

A-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-(X¹)_n-L-D-L-(X²)_n--M-(X³)_n--L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-R-M-L-T-F-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-E-E-L-K-(X⁴)_n-^-L-E-E-V-L-N-L-A-(X⁵)_n-^-S-K-N-F-H-(X⁶)_n-(X⁷)_n--P-R-D-(X⁸)_n--(X⁹)_n--S-N-(X¹⁰)_n--N-V-(X¹¹)_n--(X¹²)_n--L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-RW-I-T-F-C-(X¹³)_n--S-I-I-(X¹⁴)_n--T-L-T，其中：

每個(gè)n單獨(dú)選自0或1；

X¹是L(野生型)或R；

X²是Q(野生型)或E；

X³是I(野生型)或V；

X⁴是P(野生型)或H；

X⁵是Q(野生型)，R，H，N或S；

X⁶是L(野生型)，F(xiàn)或V；

X⁷是R(野生型)，I，T或D；

X⁸是L(野生型)或V；

X⁹是I(野生型)或V；

X¹⁰是I(野生型)或V；

X¹¹是I(野生型)或F；

X¹²是V(野生型)或I；

X¹³是A(野生型)或T；并且

X¹⁴是S(野生型)或R。(SEQ ID NO：50)。

在根據(jù)SEQ ID NO：50的IL-2突變蛋白的某些實(shí)施方案中，至少在X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、X⁹、X¹⁰、X¹¹、X¹²、X¹³或X¹⁴之一處的氨基酸不是野生型氨基酸。在一些實(shí)施方案中，至少在X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、X⁹、X¹⁰、X¹¹、X¹²、X¹³或X¹⁴的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14處的氨基酸不是野生型氨基酸。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與SEQ ID NO：50的IL-2突變蛋白具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源性。

在一些實(shí)施方案中，作為部分激動(dòng)劑的主題IL-2突變蛋白與野生型IL-2相比具有一種或多種降低的功能。

在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白具有降低的刺激依賴于IL-2Rβ/IL-2Rγ_c異二聚化的一種或多種信號傳導(dǎo)途徑的能力。在一些實(shí)施方案中，與野生型hIL-2相比，主題IL-2突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的STAT5磷酸化的能力。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細(xì)胞中的STAT5磷酸化的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的STAT5磷酸化。在一些實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞是新鮮分離的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞T細(xì)胞是活化的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是天然殺傷(NK)細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，與野生型hIL-2相比，突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的ERK1/ERK2信號傳導(dǎo)的能力。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細(xì)胞中的pERK1/ERK2信號傳導(dǎo)的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的pERK1/ERK2信號傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是T細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞是新鮮分離的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞T細(xì)胞是活化的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是天然殺傷(NK)細(xì)胞。

可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如通過STAT5和ERK1/2的磷酸化來測量STAT5和ERK1/2信號傳導(dǎo)。例如，可以使用對這些分子的磷酸化形式特異的抗體結(jié)合如本文中所述的流式細(xì)胞術(shù)分析來測量STAT5和ERK1/2磷酸化。

在一些實(shí)施方案中，與野生型hIL-2相比，突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的PI 3激酶信號傳導(dǎo)的能力。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細(xì)胞中的PI 3激酶信號傳導(dǎo)的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細(xì)胞中的PI 3激酶信號傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞T細(xì)胞是活化的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，IL-2Rβ+細(xì)胞是天然殺傷(NK)細(xì)胞。

PI 3-激酶信號傳導(dǎo)可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來測量。例如，可以使用對磷酸-S6核糖體蛋白特異性的抗體結(jié)合如本文中所述的流式細(xì)胞術(shù)分析來測量PI 3-激酶信號傳導(dǎo)。

在某些實(shí)施方案中，與野生型IL-2相比，突變蛋白具有降低的誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的能力。在一些實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞是原代CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞是活化的CD8+T細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法測量細(xì)胞增殖。例如，可以使用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺二酯(CFSE)稀釋測定或通過[³H]-胸苷摻入來測量淋巴細(xì)胞增殖，如本文中所述。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖。

在一些實(shí)施方案中，與野生型IL-2相比，IL-2突變蛋白具有降低的活化淋巴細(xì)胞中的IL-2Rα表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2活化相同細(xì)胞中的IL-2Rα表達(dá)的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平活化淋巴細(xì)胞中的IL-2Rα表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞是新鮮分離的CD8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，CD8+T細(xì)胞是活化的CD8+T細(xì)胞。

不受任何特定運(yùn)行理論束縛，認(rèn)為展現(xiàn)出增強(qiáng)的IL-2Rβ結(jié)合和降低的IL-2Rγ_c的IL-2突變蛋白可以作為顯性陰性IL-2拮抗劑用作功能并且干擾一種或多種IL-2依賴性功能。此類拮抗劑通過干擾IL-2與IL-2Rβ的結(jié)合而用作功能，同時(shí)也抑制IL-2Rβ/IL-2Rγ_c異二聚化。此外，由于IL-15信號傳導(dǎo)通過IL-2Rβ/IL-2Rγ_c受體結(jié)合用作功能，認(rèn)為此類IL-2突變蛋白也可以用作IL-15拮抗劑的功能。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能。

在一些實(shí)施方案中，抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能的IL-2突變蛋白包括在根據(jù)野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22和126處的氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白的氨基酸取代包括根據(jù)野生型hIL-2編號的L18R、Q22E和Q126T。

在一些實(shí)施方案中，抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能的IL-2突變蛋白包括在根據(jù)野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22、126和130處的氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白的氨基酸取代包括根據(jù)野生型hIL-2編號的L18R、Q22E、Q126T和S130R。

在某些實(shí)施方案中，突變蛋白是CD8+T細(xì)胞中IL-2和/或IL-15STAT5磷酸化的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，突變蛋白是IL-2和/或IL-15誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞增殖的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，突變蛋白是IL-2依賴性的TCR誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制劑。

IL-2促進(jìn)Th1、Th9和Treg T細(xì)胞分化并抑制Th17分化。因此，不受任何特定運(yùn)行理論束縛，認(rèn)為用作IL-2拮抗劑功能的IL-2突變蛋白能夠抑制Th1、Th9和/或Treg細(xì)胞分化或促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性Th1、Th9和/或Treg分化的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，突變蛋白是Th17分化的促進(jìn)劑。

在某些實(shí)施方案中，突變蛋白是天然殺傷(NK)細(xì)胞的IL-2依賴性活化的抑制劑?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方法測量NK細(xì)胞的IL-2活化，例如通過測量IL-2誘導(dǎo)的CD69表達(dá)和/或細(xì)胞毒性，如本文所述。

IL-2突變蛋白的重組表達(dá)、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞

在多個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明實(shí)踐中的多肽是合成的，或通過重組核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生。在多肽是嵌合體(例如，至少含有突變體IL-2多肽和異源多肽的融合蛋白)的情況下，其可以由雜合核酸分子編碼，所述雜合核酸分子含有編碼突變體IL-2的全部或部分的一個(gè)序列和編碼異源多肽的全部或部分的第二序列。例如，本文中所述的主題IL-2突變蛋白可以與六組氨酸標(biāo)簽融合以促進(jìn)細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)的純化，或與血凝素標(biāo)簽融合，以促進(jìn)在真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的純化。

用于構(gòu)建編碼IL-2突變蛋白的DNA序列并在適當(dāng)轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)那些序列的方法包括但不限于使用PCR輔助的誘變技術(shù)。也可以用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)制備由對IL-2多肽缺失或添加氨基酸殘基組成的突變。在缺失或添加的情況下，編碼IL-2的核酸分子任選地用合適的限制性內(nèi)切核酸酶消化。所得的片段可以直接表達(dá)或通過例如將其連接到第二片段進(jìn)一步操作。如果核酸分子的兩個(gè)末端包含彼此重疊的互補(bǔ)核苷酸，則可以促進(jìn)連接，但是也可以連接平末端片段。PCR產(chǎn)生的核酸也可用于產(chǎn)生各種突變體序列。

完整的氨基酸序列可用于構(gòu)建反向翻譯的基因?？梢院铣珊芯幋aIL-2突變蛋白的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成編碼期望的多肽的部分的幾個(gè)小寡核苷酸，然后連接。單個(gè)寡核苷酸通常含有用于互補(bǔ)組裝的5’或3’突出端。

除了通過表達(dá)已經(jīng)通過重組分子生物學(xué)技術(shù)改變的核酸分子產(chǎn)生突變多肽外，可以化學(xué)合成主題IL-2突變蛋白?；瘜W(xué)合成的多肽由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)產(chǎn)生。

一旦組裝(通過合成，定點(diǎn)誘變或另一種方法)，會將編碼IL-2突變蛋白的DNA序列插入表達(dá)載體中，并且可操作地連接到適于在期望的轉(zhuǎn)化宿主中表達(dá)IL-2突變蛋白的表達(dá)控制序列?？梢酝ㄟ^核苷酸測序，限制性作圖和在合適的宿主中表達(dá)生物活性多肽確認(rèn)正確的裝配。如本領(lǐng)域中公知，為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染基因的高表達(dá)水平，基因必須可操作地連接到在所選的表達(dá)宿主中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列。

編碼IL-2突變蛋白的DNA序列(無論是通過定點(diǎn)誘變，化學(xué)合成或其它方法制備)還可以包括編碼信號序列的DNA序列。如果存在的話，此類信號序列應(yīng)當(dāng)是被選擇用于IL-2突變蛋白表達(dá)的細(xì)胞識別的信號序列。它可以是原核的，真核的或兩者的組合。它也可以是天然IL-2的信號序列。信號序列的包含取決于是否期望從制備它的重組細(xì)胞分泌IL-2突變蛋白。如果選擇的細(xì)胞是原核的，那么通常優(yōu)選DNA序列不編碼信號序列。如果選擇的細(xì)胞是真核的，那么通常優(yōu)選編碼信號序列，最優(yōu)選使用野生型IL-2信號序列。

IL-2突變蛋白融合蛋白

如上所述，示例性主題IL-2突變蛋白可以制備為包括主題IL-2突變蛋白和異源多肽(即，多肽，其不是IL-2的多肽或其突變體)的融合或嵌合多肽(參見例如美國專利號6,451,308)。示例性異源多肽可以增加嵌合多肽在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，并且因此可以進(jìn)一步增強(qiáng)突變體IL-2多肽的性質(zhì)。在多個(gè)實(shí)施方案中，增加循環(huán)半衰期的多肽可以是血清白蛋白，例如人血清白蛋白，或缺少IgG重鏈可變區(qū)的抗體的IgG亞類的Fc區(qū)的。示例性的Fc區(qū)可以包括抑制補(bǔ)體固定和Fc受體結(jié)合的突變，或者它可以是裂解的，即能夠結(jié)合補(bǔ)體或通過另一種機(jī)制，如抗體依賴性補(bǔ)體裂解(ADCC；USSN 08/355,502 1994年12月12日提交)裂解細(xì)胞。

“Fc區(qū)”可以是與通過用木瓜蛋白酶消化IgG產(chǎn)生的IgG C末端結(jié)構(gòu)域同源的天然存在的或合成的多肽。IgG Fc具有約50kDa的分子量。突變體IL-2多肽可以包括整個(gè)Fc區(qū)，或保留延長其作為其中一部分的嵌合多肽的循環(huán)半衰期的能力的較小部分。此外，全長或片段化Fc區(qū)可以是野生型分子的變體。也就是說，它們可以含有可以影響或可以不影響多肽功能的突變；如下文進(jìn)一步描述的，在所有情況下天然活性不是必需的或期望的。在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白融合蛋白(例如，如本文中所述的IL-2部分激動(dòng)劑或拮抗劑)包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。

Fc區(qū)可以是“裂解性”或“非裂解性”，但通常是非裂解性的。非裂解性Fc區(qū)通常缺少高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)。鼠IgG Fc的高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括IgG Fc的位置235處的Leu殘基。因此，可以通過突變或缺失Leu 235來破壞Fc受體結(jié)合位點(diǎn)。例如，Glu取代Leu 235抑制Fc區(qū)結(jié)合高親和力Fc受體的能力。通過突變或缺失IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基，可以功能性破壞鼠C″1q結(jié)合位點(diǎn)。例如，Ala殘基取代Glu 318，Lys 320和Lys 322使得IgG1 Fc不能指導(dǎo)抗體依賴性補(bǔ)體裂解。相比之下，裂解性IgG Fc區(qū)具有高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′1q結(jié)合位點(diǎn)。高親和力Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括IgG Fc的235位的Leu殘基，并且C′1q結(jié)合位點(diǎn)包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基。裂解性IgG Fc在這些位點(diǎn)處具有野生型殘基或保守氨基酸取代。裂解性IgG Fc可以靶向細(xì)胞，用于抗體依賴性細(xì)胞毒性或補(bǔ)體指導(dǎo)性細(xì)胞溶解(CDC)。人IgG的適當(dāng)突變也是已知的(參見例如Morrison等人，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等人，The Immunologist 2：125，1994)。

在其它實(shí)施方案中，嵌合多肽可以包括主題IL-2突變蛋白和用作抗原性標(biāo)簽功能的多肽，如FLAG序列。FLAG序列通過如本文中所述的生物素化的、高度特異性的抗FLAG抗體識別(還參見Blanar等人，Science 256：1014，1992；LeClair等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽還包含C-末端c-myc表位標(biāo)簽。

在其它實(shí)施方案中，嵌合多肽包括突變體IL-2多肽和異源多肽，其用作功能以增強(qiáng)突變體IL-2多肽的表達(dá)或指導(dǎo)突變體IL-2多肽的細(xì)胞定位，如Aga2p凝集素亞基(參見例如Boder和Wittrup，Nature Biotechnol.15：553-7，1997)。

在其它實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生包含突變體IL-2和抗體或其抗原結(jié)合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗體或抗原結(jié)合組分可以充當(dāng)靶向部分。例如，其可以用于將嵌合蛋白定位到細(xì)胞或靶分子的特定子集。產(chǎn)生細(xì)胞因子-抗體嵌合多肽的方法描述于例如美國專利號6,617,135。

編碼突變體IL-2的核酸分子

在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)或作為嵌合多肽(如上文所述的那些)的一部分的主題IL-2突變蛋白可通過核酸分子的表達(dá)獲得。正如IL-2突變蛋白可以根據(jù)其與野生型IL-2多肽的同一性描述一樣，編碼它們的核酸分子將必然與編碼野生型IL-2的核酸分子具有某種同一性。例如，編碼主題IL-2突變蛋白的核酸分子可以與編碼野生型IL-2的核酸(例如，SEQ ID NO：2)是至少50％、至少65％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％且最優(yōu)選至少95％(例如99％)相同的。

提供的核酸分子可以包含天然存在的序列，或與天然存在的序列不同，但由于遺傳密碼的簡并性，編碼相同多肽的序列。這些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因組DNA、cDNA或合成DNA，如通過基于亞磷酰胺的合成產(chǎn)生)或這些類型的核酸內(nèi)的核苷酸的組合或修飾組成。此外，核酸分子可以是雙鏈或單鏈(即，有義鏈或反義鏈)。

核酸分子不限于編碼多肽的序列；也可以包括位于編碼序列(例如，IL-2的編碼序列)上游或下游的一些或所有非編碼序列。分子生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉用于分離核酸分子的常規(guī)程序。它們可以例如通過用限制性內(nèi)切核酸酶處理基因組DNA或通過進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情況下，可以例如通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生分子。

本公開的示例性分離的核酸分子可以包括在天然狀態(tài)下本身找不到的片段。因此，本公開涵蓋重組分子，例如其中核酸序列(例如，編碼突變體IL-2的序列)摻入載體(例如質(zhì)?；虿《据d體)或異源細(xì)胞的基因組(或同源細(xì)胞的基因組，在除天然染色體位置以外的位置)中的那些重組分子。

如上所述，主題IL-2突變蛋白可以作為嵌合多肽的一部分存在。除了上述異源多肽之外或代替上述異源多肽，主題核酸分子可以含有編碼“標(biāo)志物”或“報(bào)告物”的序列。標(biāo)志物或報(bào)告物基因的實(shí)例包括β-內(nèi)酰胺酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo^r，G418^r)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin-B-hosphotransferase，HPH)、胸苷激酶(TK)、lacz(編碼β-半乳糖苷酶)和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到另外的有用試劑，例如，可以充當(dāng)標(biāo)志物或報(bào)告物功能的另外的序列。

可以通過將突變引入從任何生物細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞)獲得的編碼IL-2的DNA中獲得主題核酸分子。因此，主題核酸(及它們編碼的多肽)可以是小鼠、大鼠、豚鼠、牛、綿羊、馬、豬、兔、猴、狒狒、狗或貓的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是人的核酸分子。

突變體IL-2基因產(chǎn)物的表達(dá)

上述核酸分子可以包含在能夠指導(dǎo)其在例如已經(jīng)用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中表達(dá)的載體內(nèi)。因此，除了主題IL-2突變蛋白之外，包含編碼主題IL-2突變蛋白的核酸分子的表達(dá)載體和用這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在優(yōu)選的實(shí)施方案中。

當(dāng)然應(yīng)該理解，不是所有的載體和表達(dá)控制序列都能同樣好地發(fā)揮功能以表達(dá)本文中所述的DNA序列。在相同表達(dá)系統(tǒng)下，所有宿主也不會同樣好地發(fā)揮作用。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在這些載體，表達(dá)控制序列和宿主中進(jìn)行選擇而無需過多的實(shí)驗(yàn)。例如，在選擇載體中，必須考慮宿主，因?yàn)檩d體必須在其中復(fù)制。還應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)，控制該拷貝數(shù)的能力和由載體編碼的任何其它蛋白質(zhì)，如抗生素標(biāo)志物的表達(dá)。例如，可以使用的載體包括允許編碼IL-2突變蛋白的DNA以拷貝數(shù)擴(kuò)增的載體。此類可擴(kuò)增載體是本領(lǐng)域中公知的。它們包括例如能夠通過DHFR擴(kuò)增(參見例如Kaufman，美國專利號4,470,461，Kaufman和Sharp，“Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene：Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression”，Mol.Cell.Biol.，2，第1304-19頁(1982))或谷氨酰胺合成酶(“GS”)擴(kuò)增(參見例如美國專利號5,122,464和歐洲公開申請338,841)擴(kuò)增的載體。

在一些實(shí)施方案中，本公開的人IL-2突變蛋白將從載體，優(yōu)選表達(dá)載體表達(dá)。載體可用于宿主細(xì)胞中的自主復(fù)制，或可以在引入宿主細(xì)胞中后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而與宿主基因組一起復(fù)制(例如，非附加體哺乳動(dòng)物載體)。表達(dá)載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的編碼序列的表達(dá)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒(載體)的形式。然而，也包括其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)。

示例性重組表達(dá)載體可以包括可操作地連接到待表達(dá)的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，其基于待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇。

可以設(shè)計(jì)表達(dá)構(gòu)建體或載體以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)IL-2突變蛋白或其變體。

可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)和其它標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊。

蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)最經(jīng)常在具有含有組成性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中進(jìn)行。在大腸埃希氏菌中最大化重組蛋白表達(dá)的策略可以參見例如Gottesman(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，San Diego，Calif.)，第119-128頁和Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118。用于從細(xì)胞培養(yǎng)，收獲，破壞或提取IL-2突變蛋白或其變體的方法基本上描述于例如美國專利號4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234；和4,931,543，其全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。

在一些實(shí)施方案中，也可以在真核生物，如酵母或人細(xì)胞中制備重組IL-2突變蛋白或其生物活性變體。合適的真核宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞(可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體的實(shí)例包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39))；酵母細(xì)胞(用于在酵母釀酒酵母(S.cerenvisiae)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSec1(Baldari等人(1987)EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和pPicZ(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.))；或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187：195))。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，常用的啟動(dòng)子源自多瘤，腺病毒2，巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對于原核和真核細(xì)胞兩者的其它合適的表達(dá)系統(tǒng)，參見Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)的第16和17章。參見Goeddel(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，San Diego，Calif.)。

可以優(yōu)化編碼本公開的人IL-2突變蛋白的序列以在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)。可以將序列的G-C含量調(diào)整至給定細(xì)胞宿主的平均水平，如通過參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算。用于密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域中公知的?？梢詢?yōu)化IL-2突變蛋白編碼序列內(nèi)的密碼子以增強(qiáng)宿主細(xì)胞中的表達(dá)，使得已經(jīng)優(yōu)化編碼序列內(nèi)的約1％，約5％、約10％、約25％、約50％、約75％或高達(dá)100％的密碼子以在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)。

適合使用的載體包括用于細(xì)菌中的基于T7的載體(參見例如Rosenberg等人，Gene 56：125，1987)，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521，1988)，和用于昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒衍生的載體(例如，表達(dá)載體pBacPAK9，來自Clontech，Palo Alto，Calif.)。

在一些實(shí)施方案中，編碼此類載體中的主題IL-2突變蛋白的核酸插入物可以與啟動(dòng)子可操作地連接，所述啟動(dòng)子基于例如在其中尋求表達(dá)的細(xì)胞類型來選擇。

在選擇表達(dá)控制序列中，還應(yīng)考慮多種因素。這些包括例如序列的相對強(qiáng)度、其可控性以及其與編碼主題IL-2突變蛋白的實(shí)際DNA序列的相容性，特別是關(guān)于潛在的二級結(jié)構(gòu)而言。宿主應(yīng)該通過考慮它們與選擇的載體的相容性，由本發(fā)明的DNA序列編碼的產(chǎn)物的毒性，它們的分泌特征，它們正確折疊多肽的能力，它們的發(fā)酵或培養(yǎng)需求以及純化由DNA序列編碼的產(chǎn)物的容易性選擇。

在這些參數(shù)內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇各種載體/表達(dá)控制序列/宿主組合，其將在發(fā)酵上或在大規(guī)模動(dòng)物培養(yǎng)(例如使用CHO細(xì)胞或COS 7細(xì)胞)中表達(dá)期望的DNA序列。

在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇將取決于宿主的選擇?？梢允褂枚喾N表達(dá)宿主/載體組合。用于真核宿主的有用的表達(dá)載體包括例如具有來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。用于細(xì)菌宿主的有用的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來自大腸埃希氏菌的質(zhì)粒，包括col E1、pCRI、pER32z、pMB9及其衍生物，更寬的宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4，噬菌體DNA，例如，噬菌體λ(例如NM989)和其它DNA噬菌體(例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體)的許多衍生物。用于酵母細(xì)胞的有用的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物。用于昆蟲細(xì)胞的有用載體包括pVL 941和pFastBac^TM 1(GibcoBRL，Gaithersburg，Md.)。Cate等人，“Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells”，Cell，45，第685-98頁(1986)。

此外，在這些載體中可以使用極其多種表達(dá)控制序列中的任一種。此類有用的表達(dá)控制序列包括與前述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的表達(dá)控制序列。有用的表達(dá)控制序列的實(shí)例包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，噬菌體λ的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)，例如PL，fd外殼蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，酸性磷酸酶的啟動(dòng)子(例如PhoA)，酵母a-交配系統(tǒng)的啟動(dòng)子，桿狀病毒的多角體啟動(dòng)子和已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列，及其各種組合。

T7啟動(dòng)子可以用于細(xì)菌，多角體蛋白啟動(dòng)子可以用于昆蟲細(xì)胞，并且巨細(xì)胞病毒或金屬硫蛋白啟動(dòng)子可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，在高等真核生物的情況下，組織特異性和細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子是可廣泛可用的。這些啟動(dòng)子因其指導(dǎo)核酸分子在體內(nèi)給定組織或細(xì)胞類型中表達(dá)的能力而命名。技術(shù)人員熟知許多啟動(dòng)子和可用于指導(dǎo)核酸表達(dá)的其它調(diào)節(jié)元件。

除了促進(jìn)插入的核酸分子轉(zhuǎn)錄的序列之外，載體可以含有復(fù)制起點(diǎn)和編碼選擇標(biāo)志物的其它基因。例如，新霉素抗性(neo^r)基因?qū)Ρ磉_(dá)其的細(xì)胞賦予G418抗性，并且因此允許轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表型選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定給定的調(diào)節(jié)元件或選擇標(biāo)志物是否適合于在特定的實(shí)驗(yàn)背景中使用。

可以用于本發(fā)明的病毒載體包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨載體，皰疹病毒，猿猴病毒40(SV40)和牛乳頭瘤病毒載體(參見例如Gluzman(編)，Eukaryotic Viral Vectors，CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

含有并表達(dá)編碼本文公開的主題IL-2突變蛋白的核酸分子的原核或真核細(xì)胞也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的細(xì)胞是轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即通過重組DNA技術(shù)引入核酸分子，例如編碼突變體IL-2多肽的核酸分子的細(xì)胞。也認(rèn)為此類細(xì)胞的后代在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

表達(dá)系統(tǒng)的精確組分不是至關(guān)重要的。例如，可以在原核宿主，如細(xì)菌大腸埃希氏菌中，或在真核宿主，如昆蟲細(xì)胞(例如Sf21細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞、NIH 3T3細(xì)胞或HeLa細(xì)胞)中產(chǎn)生IL-2突變蛋白。這些細(xì)胞可從許多來源獲得，包括美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Va.)。在選擇表達(dá)系統(tǒng)中，重要的僅是組件彼此相容。技術(shù)人員或普通技術(shù)能夠做出此類確定。此外，如果在選擇表達(dá)系統(tǒng)中需要指導(dǎo)，那么熟練技術(shù)人員可以查閱Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，N.Y.，1993)和Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985增刊1987)。

表達(dá)的多肽可以使用常規(guī)生物化學(xué)程序從表達(dá)系統(tǒng)中純化，并且可以用作例如如本文中所述的治療劑。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)用于產(chǎn)生突變蛋白的宿主生物體，獲得的IL-2突變蛋白將是糖基化的或未糖基化的。如果選擇細(xì)菌作為宿主，那么產(chǎn)生的IL-2突變蛋白將是未糖基化的。另一方面，真核細(xì)胞將糖基化IL-2突變蛋白，盡管可能不以與天然IL-2被糖基化相同的方式。由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的IL-2突變蛋白可以根據(jù)任何合適的方法純化。已知用于純化IL-2的各種方法。參見，例如，Current Protocols in Protein Science，第2卷.John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploehg，David W.Speicher，Paul T.Wingfield編，Unit 6.5(Copyright 1997，John Wiley and Sons，Inc.)?？梢允褂藐栯x子交換，凝膠過濾和或反相液相色譜從在大腸埃希氏菌中產(chǎn)生的包含體中，或從產(chǎn)生給定突變蛋白的哺乳動(dòng)物或酵母培養(yǎng)物的條件化培養(yǎng)基中分離IL-2突變蛋白。

構(gòu)建編碼IL-2突變蛋白的DNA序列的另一個(gè)示例性方法是通過化學(xué)合成。這包括通過編碼展現(xiàn)出所述特性的IL-2突變蛋白的蛋白質(zhì)序列的化學(xué)手段直接合成肽。該方法可以在影響IL-2與IL-2Rα，IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的相互作用的位置處摻入天然和非天然氨基酸兩者。或者，編碼期望的IL-2突變蛋白的基因可以通過使用寡核苷酸合成儀的化學(xué)手段合成。此類寡核苷酸基于期望的IL-2突變蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)，并且優(yōu)選地選擇在會產(chǎn)生重組突變蛋白的宿主細(xì)胞中有利的那些密碼子。在這方面，公認(rèn)的是遺傳密碼是簡并的：氨基酸可以由超過一個(gè)密碼子編碼。例如，Phe(F)由兩個(gè)密碼子TIC或TTT編碼，Tyr(Y)由TAC或TAT編碼，并且his(H)由CAC或CAT編碼。Trp(W)由單一密碼子TGG編碼。因此，應(yīng)當(dāng)理解，對于編碼特定IL-2突變蛋白的給定DNA序列，將存在許多將編碼該IL-2突變蛋白的DNA簡并序列。例如，應(yīng)當(dāng)理解，除了圖2中所示的突變蛋白5-2的優(yōu)選DNA序列之外，還會有許多編碼所示的IL-2突變蛋白的簡并DNA序列。認(rèn)為這些簡并DNA序列在本公開的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明上下文中的“其簡并變體”意指編碼特定突變蛋白并因此實(shí)現(xiàn)特定突變蛋白表達(dá)的所有DNA序列。

可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法測定IL-2突變蛋白的生物活性。此類測定包括PHA母細(xì)胞(PHA-blast)增殖和NK細(xì)胞增殖。

治療方法

在一些實(shí)施方案中，可以向受試者施用主題IL-2突變蛋白和/或表達(dá)它們的核酸，以治療與異常凋亡或分化過程有關(guān)的病癥(例如細(xì)胞增殖性病癥或細(xì)胞分化疾病，如癌癥，例如通過產(chǎn)生主動(dòng)或被動(dòng)免疫)。在治療此類疾病中，公開的IL-2突變蛋白可以擁有有利的性質(zhì)，如降低的血管滲漏綜合征。

細(xì)胞增殖性和/或分化性病癥的實(shí)例包括癌癥(例如癌、肉瘤、轉(zhuǎn)移性病癥或造血贅生性病癥，例如白血病)。轉(zhuǎn)移性腫瘤可以源自大量原發(fā)性腫瘤類型，包括但不限于前列腺、結(jié)腸、肺、乳腺和肝的那些。本發(fā)明的組合物(例如突變體IL-2多肽和/或編碼它們的核酸分子)也可以施用給具有病毒感染(例如AIDS或流感)的患者。

突變體IL-2多肽可以用于治療具有，懷疑具有或可以有風(fēng)險(xiǎn)形成任何類型的癌癥(包括腎癌或黑素瘤)或任何病毒性疾病的患者。示例性的癌包括從宮頸、肺、前列腺、乳房、頭和頸、結(jié)腸和卵巢的組織形成的那些。該術(shù)語還包括癌肉瘤，其包括由癌性和肉瘤組織組成的惡性腫瘤。

增殖性病癥的其它實(shí)例包括造血贅生性病癥。

增殖性和/或分化性病癥的其它實(shí)例包括皮膚病癥。皮膚病癥可涉及真皮，表皮或下皮層中的細(xì)胞或細(xì)胞組或?qū)拥漠惓；钚?，或真?表皮連接處的異常。例如，皮膚病癥可以涉及角化細(xì)胞(例如，過度增殖基底和立即上基質(zhì)角質(zhì)形成細(xì)胞)，黑素細(xì)胞，朗格漢斯(Langerhans)細(xì)胞，梅克爾(Merkel)細(xì)胞，免疫細(xì)胞和在一個(gè)或多個(gè)表皮層(例如基底層(生發(fā)層)、棘層、顆粒層、透明層或角質(zhì)層)中發(fā)現(xiàn)的其它細(xì)胞的異?；钚?。在其它實(shí)施方案中，病癥可涉及真皮細(xì)胞，例如真皮層(例如乳頭層或網(wǎng)狀層)中發(fā)現(xiàn)的真皮內(nèi)皮，成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞(例如，肥大細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的異?；钚?。

皮膚病癥的實(shí)例包括銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、皮炎(濕疹)(例如剝脫性皮炎或特應(yīng)性皮炎)、毛發(fā)紅糠疹、玫瑰糠疹(pityriasis rosacea)、紅斑痤瘡、副銀屑病、苔癬樣糠疹(pityriasis lichenoider)、扁平苔癬(lichen planus)、光澤苔蘚、魚鱗病樣皮膚病、角皮病(keratodermas)、皮膚病、斑禿、壞疽性膿皮病、白癜風(fēng)、類天皰瘡(例如眼瘢痕性類天皰瘡或大皰性類天皰瘡)、，蕁麻疹、汗孔角化病(prokeratosis)、涉及關(guān)節(jié)囊內(nèi)襯的上皮相關(guān)細(xì)胞的過度增殖和炎癥的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；皮炎，如溢脂性皮炎和日光皮炎；角化病如脂溢性角化病、老年角化病、光線性角化病、光誘發(fā)的角化病(photo-induced keratosis)和毛囊角化病(keratosis follicularis)；尋常痤瘡；瘢痕疙瘩和預(yù)防瘢痕疙瘩形成；痣；疣，包括疣、濕疣(condyloma)或尖銳濕疣，以及人乳頭瘤病毒(HPV)感染，如性病疣(venereal wart)；白斑；扁平苔蘚；和角膜炎。皮膚病癥可以是皮炎，例如特應(yīng)性皮炎或過敏性皮炎，或銀屑病。

適于治療的患者也可具有銀屑病。術(shù)語“銀屑病”旨在具有其醫(yī)學(xué)含義，即主要累及皮膚并產(chǎn)生凸起的，增厚的，鱗屑的，不留疤痕的損害的疾病。病變通常是被重疊的有光澤的鱗屑覆蓋的尖銳分界的紅斑丘疹(erythematous papules)。鱗屑通常是銀色或微乳白色。經(jīng)常發(fā)生指甲損害，導(dǎo)致凹陷性病斑(pitting)、指甲分離、增厚和變色。銀屑病有時(shí)與關(guān)節(jié)炎相關(guān)，并且它可以是有嚴(yán)重后果的。角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是銀屑病表皮增生以及表皮炎癥和角化細(xì)胞分化減少的關(guān)鍵特征。已經(jīng)調(diào)用多種機(jī)制來解釋表征銀屑病的角化細(xì)胞過度增殖。無序的細(xì)胞免疫也牽涉銀屑病的發(fā)病機(jī)制。銀屑病病癥的實(shí)例包括慢性靜止性銀屑病(chronic stationary psoriasis)，尋常性銀屑病，發(fā)疹性(滴狀)銀屑病，銀屑病性紅皮病，泛發(fā)性膿皰性銀屑病(Von Zumbusch)，膿皰性環(huán)狀銀屑病和局部膿皰性銀屑病。

或者，或除了直接施用于患者的方法之外，在一些實(shí)施方案中，突變體IL-2多肽可以用于離體方法。例如，可以在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞(例如，從患者分離并且置于或維持在培養(yǎng)物中的外周血淋巴細(xì)胞或純化的淋巴細(xì)胞群體)，并且接觸步驟可以通過將IL-2突變體加入到培養(yǎng)基影響。培養(yǎng)步驟可以包括其它步驟，其中用其它作用劑刺激或處理細(xì)胞，例如以刺激增殖，或擴(kuò)增與感興趣的抗原(例如癌抗原或病毒抗原)反應(yīng)的細(xì)胞群。然后，在已經(jīng)治療患者后對患者施用細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，用作本文中所述的IL-2拮抗劑的主題IL-2突變蛋白可用于治療其中抑制一種或多種IL-2和/或IL-15依賴性功能有用的一種或多種狀況。在某些實(shí)施方案中，本文中所述的IL-2突變蛋白拮抗劑用于治療其中抑制IL-2Rβ/IL-2Rγ異二聚化和下游信號傳導(dǎo)有用的一種或多種疾病或病癥(例如GVDH或白血病)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法用于治療移植物抗宿主病(GVHD)。在一些實(shí)施方案中，治療包括對具有GVHD的受試者施用治療有效量的作為IL-2拮抗劑的IL-2突變蛋白的步驟。已知IL-2和IL-15促成GVHD((Ferrara等人，Journal of Immunology 137：1874(1986)；和Blaser等人，Blood 105：894(2005))。因此，不受任何具體運(yùn)行理論約束，認(rèn)為本文中所述的IL-2拮抗劑可用于治療GVHD。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療GVHD的IL-2突變蛋白包括與野生型IL-2相比降低其與IL-2Rγ_c受體的結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合的任一種突變，如本文中描述)。在一些實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的突變包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步具有降低的IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的IL-2突變蛋白進(jìn)一步包括與野生型IL-2相比增加IL-2突變蛋白對IL-2Rβ的結(jié)合親和力的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(例如，如本文所述，增加IL-2Rβ結(jié)合的任一種突變)。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白進(jìn)一步包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、Q126T、S130R、I86V和I92F。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法用于治療IL-2和/或IL-15介導(dǎo)的白血病。在具體實(shí)施方案中，白血病是成人T細(xì)胞白血病(ATL)。ATL的特征在于CD4+T細(xì)胞的惡性擴(kuò)增，其展現(xiàn)出牽涉IL-2和IL-15的自分泌信號以及IL-9的旁分泌信號的早期生長階段。此類細(xì)胞因子依賴性增殖在患有慢性和郁積型，但不是急性ATL的患者中是明顯的。因此，不受任何特定的運(yùn)行理論束縛，認(rèn)為IL-2部分激動(dòng)劑和拮抗劑可以用于治療白血病的此類形式。在一些實(shí)施方案中，治療包括對患有成人T細(xì)胞白血病的受試者施用治療有效量的作為IL-2拮抗劑的IL-2突變蛋白的步驟。在一些實(shí)施方案中，患者患有慢性和郁積型ATL。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療ATL的IL-2突變蛋白包括與野生型IL-2相比降低其與IL-2Rγ_c受體結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合的任一種突變，如本文中所述)。在一些實(shí)施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的突變包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步具有降低的IL-2Rγ_c受體結(jié)合親和力的IL-2突變蛋白進(jìn)一步包括與野生型IL-2相比增加IL-2突變蛋白對IL-2Rβ的結(jié)合親和力的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(例如，增加IL-2Rβ結(jié)合的任一種突變，如本文中所述)。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白進(jìn)一步包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、Q126T、S130R、I86V和I92F。

藥物組合物和施用方法

在一些實(shí)施方案中，主題IL-2突變蛋白和核酸可以摻入組合物(包括藥物組合物)中。此類組合物通常包括多肽或核酸分子和藥學(xué)可接受載體。

將藥物組合物配制成與其意圖的給藥途徑相容。本發(fā)明的突變體IL-2多肽可以口服給予，但更可能將通過腸胃外途徑施用它們。腸胃外施用途徑的實(shí)例包括例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸施用。用于腸胃外應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力的作用劑，如氯化鈉或右旋糖。可以用酸或堿，如磷酸二氫鈉和/或磷酸氫二鈉、鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH(例如，至約7.2-7.8的pH，例如7.5)。胃腸外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量小瓶中。

適合于可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)或分散體和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL^TM.(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的，并且在存在容易的可注射性的程度上應(yīng)當(dāng)是流體的。它在制造和儲存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且必須針對微生物，如細(xì)菌和真菌的污染作用進(jìn)行防腐。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^使用涂層材料，如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的粒度以及通過使用表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等，可以實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等張劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的作用劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實(shí)現(xiàn)。

無菌可注射溶液可以通過將所需量的活性化合物摻入根據(jù)需要具有上文列舉的成分中的一種或組合的合適溶劑中，然后過濾滅菌來制備。通常，通過將活性化合物摻入無菌媒介物中制備分散體，所述無菌媒介物包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文列舉的那些的需要的其它成分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何另外的需要成分的粉末。

口服組合物(如果使用的話)通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。為了口服治療施用的目的，活性化合物可以與賦形劑一起摻入并以片劑、錠劑或膠囊劑，如明膠膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用流體載體制備，用作漱口劑?？梢园ㄋ帉W(xué)相容粘合劑和/或輔助材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任何下列成分或類似性質(zhì)的化合物：粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸，Primogel^TM或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes^TM；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。

在通過吸入施用的情況下，從含有合適的推進(jìn)劑，例如氣體如二氧化碳的加壓容器或分配器，或霧化器以氣溶膠噴霧的形式遞送主題IL-2突變蛋白或編碼它們的核酸。此類方法包括在美國專利號6,468,798中描述的那些方法。

也可以通過經(jīng)粘膜或透皮手段進(jìn)行主題IL-2突變蛋白或核酸的系統(tǒng)施用。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，在配制劑中使用適合于待滲透的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如用于經(jīng)粘膜施用的去污劑，膽汁鹽和夫西地酸衍生物?？梢酝ㄟ^使用鼻噴霧或栓劑實(shí)現(xiàn)經(jīng)粘膜施用。對于透皮施用，將活性化合物配制成軟膏劑、軟膏(salve)、凝膠或乳膏，如本領(lǐng)域中通常已知。

在一些實(shí)施方案中，也可以以栓劑(例如，使用常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備化合物(突變體IL-2多肽或核酸)以進(jìn)行直腸遞送。

在一些實(shí)施方案中，也可以通過使用本領(lǐng)域中已知的方法轉(zhuǎn)染或感染施用化合物(主題IL-2突變蛋白或核酸)，所述方法包括但不限于McCaffrey等人(Nature 418：6893，2002)，Xia等人(Nature Biotechnol.20：1006-1010，2002)，或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53：151-160，1996，勘誤表于Am.J.Health Syst.Pharm.53：325，1996)中描述的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用將保護(hù)突變體IL-2多肽免于從體內(nèi)快速消除的載體制備主題IL-2突變蛋白或核酸，如受控釋放配制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔铮缫蚁┮宜嵋蚁?、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備此類配制劑。材料還可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商購獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用針對病毒抗原的單克隆抗體靶向到受感染的細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)可接受載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，美國專利號4,522,811。

可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序確定此類主題IL-2突變蛋白或核酸化合物的劑量、毒性和治療功效，例如用于測定LD₅₀(對50％群體致死的劑量)和ED₅₀(在50％的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)，并且其可以表示為比率LD₅₀/ED₅₀。展現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。雖然可以使用展現(xiàn)出毒性副作用的化合物，但是應(yīng)當(dāng)注意設(shè)計(jì)將此類化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)，以便使對未感染的細(xì)胞的潛在損害最小化，從而減少副作用。

從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的劑量范圍。此類化合物的劑量優(yōu)選位于包括ED₅₀的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，具有很少的毒性或沒有毒性。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，這取決于所使用的劑型和所使用的施用途徑。對于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)測定中估計(jì)?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到循環(huán)血漿濃度范圍，其包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC₅₀(即達(dá)到癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)。此類信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人體中的有用劑量?？梢岳缤ㄟ^高效液相色譜測量血漿中的水平。

如本文中所定義，主題IL-2突變蛋白的治療有效量(即有效劑量)取決于選擇的多肽。例如，可以施用在約0.001至0.1mg/kg患者體重范圍內(nèi)的單劑量；在一些實(shí)施方案中，可以施用約0.005，0.01，0.05mg/kg。在一些實(shí)施方案中，施用600,000IU/kg(IU可以通過淋巴細(xì)胞增殖生物測定確定，并且以國際單位(IU)表示，如由世界衛(wèi)生組織白介素-2(人)的第一國際標(biāo)準(zhǔn)建立)。劑量可以類似于但預(yù)期小于規(guī)定的劑量。組合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用一次；包括每隔一天一次。熟練技術(shù)人員將理解，某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)機(jī)，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、先前的治療、受試者的一般健康和/或年齡以及存在的其它疾病。此外，用治療有效量的主題IL-2突變蛋白治療受試者可以包括單一治療或可以包括一系列治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，每8小時(shí)施用組合物達(dá)5天，接著2-14天的休息期，例如9天，然后每8小時(shí)再施用5天。

藥物組合物可與施用說明書一起包括在容器，包裝或分配器中。

提供以下實(shí)施例以描述本文中提供的本發(fā)明的某些實(shí)施方案，且不應(yīng)解釋為限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1：酵母表面上的IL-2的功能性表達(dá)

盡管先前已經(jīng)在噬菌體上展示了IL-2(Buchli等人，Arch.Biochem.Biophys.339：79-841997)，但是現(xiàn)有系統(tǒng)不適于定向進(jìn)化，因此不適合于獲得具有改善的對IL-2R亞基的結(jié)合的IL-2突變體。為了克服這點(diǎn)，在酵母細(xì)胞的表面上表達(dá)IL-2。將人IL-2DNA克隆到酵母展示載體pCT302中。用pCT302_IL-2載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株EBY100，并在SD-CAA平板上于30℃下生長3天。將IL-2酵母的單個(gè)菌落在30℃下在SD-CAA中生長過夜，然后在20℃下在SGCAA中引入2天。在生物素化的γ存在下，用四聚化的生物素化的IL-2Rβ、生物素化的γ或生物素化的IL-2Rβ對酵母進(jìn)行染色。將IL-2Rβ和γ的胞外域進(jìn)行C端生物素化并偶聯(lián)至藻紅蛋白-綴合的鏈霉親和素，以用作染色和分選試劑。通過在冰上將2μM生物素化的IL-2Rβ與470nM鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE，Invitrogen)一起孵育15分鐘來形成IL-2Rβ四聚體。這些受體“四聚體”增強(qiáng)了低親和力單體胞外域(ECD)與IL-2的相互作用的親合力，使得能夠從文庫中最大回收IL-2變體。類似溶液野生型IL-2，酵母-展示的IL-2較弱地結(jié)合至單獨(dú)的IL-2Rβ，不結(jié)合至單獨(dú)的γ，但在IL-2Rβ的存在下的確結(jié)合至γ，如通過流式細(xì)胞術(shù)所示的對角線染色證明(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，酵母-展示的IL-2概括了用可溶性IL-2看到的細(xì)胞上的異二聚體受體復(fù)合物的協(xié)同裝配，并且因此適合作為文庫選擇的平臺。

實(shí)施例2：IL-2突變體文庫的構(gòu)建和篩選

第一代體外策略是創(chuàng)建整個(gè)IL-2基因的易錯(cuò)PCR文庫。第一代突變IL-2文庫如下構(gòu)建。使用 II隨機(jī)誘變試劑盒按照制造商的說明書使野生型人白介素-2(IL-2)經(jīng)受易錯(cuò)誘變。以下引物用于易錯(cuò)PCR：5’-GCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(“IL-2_errprone_for)和5’-GCCACCAGAGGATCC-3’(“IL-2_errprone_rev)。然后，使用以下引物擴(kuò)增易錯(cuò)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物：5’AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(SEQ ID NO：33)和5’ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO：34)，得到約130μg的DNA。用限制酶NheI和BamHI雙重消化酵母展示載體pCT302，并凝膠純化。將IL-2DNA和pCT302DNA以5：1μg比率與電感受態(tài)EBY100酵母混合在一起。將酵母電穿孔以促進(jìn)文庫DNA進(jìn)入酵母中。將此電穿孔重復(fù)約20次，得到1x10⁸個(gè)轉(zhuǎn)化體的最終文庫大小。

第一代IL-2文庫的選擇：使文庫經(jīng)受針對IL-2Rβ的六輪選擇(圖2A)。在第一輪中，用470nM四聚體IL-2Rβ標(biāo)記文庫，所述四聚體IL-2Rβ通過混合2μM生物素化的IL-2Rβ與470nM鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物(SAV-PE)15分鐘而形成。將文庫與IL-2Rβ一起孵育1.5小時(shí)、用PBS-BSA緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水+牛血清白蛋白)洗滌，并且在4℃下與Miltenyi抗PE微珠孵育20分鐘。再次洗滌細(xì)胞，并流過磁性柱用于選擇。將此選擇方法再連續(xù)重復(fù)5次，變化僅在于IL-2Rβ濃度中(第2輪-1μM，第3輪-1μM，第4輪-300nM，第5輪-300nM，第6輪-100nM，所有單體IL-2Rβ)。在選擇結(jié)束后，將第5輪和第6輪酵母培養(yǎng)物鋪在SD-CAA平板上，這產(chǎn)生單獨(dú)的酵母菌落。測試18個(gè)所得的酵母菌落與500nM IL-2Rβ的結(jié)合。從這18個(gè)酵母菌落中分離的IL-2DNA進(jìn)行測序。相對于野生型IL-2中的相應(yīng)殘基，這18個(gè)酵母菌落中的氨基酸差異顯示在表1中。

表1

第二代IL-2文庫的文庫構(gòu)建：基于高百分比的含有L85V的克隆，構(gòu)建了主要聚焦于疏水核心殘基的第二IL-2文庫。構(gòu)建了定點(diǎn)IL-2文庫，其具有在Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、V93處的突變。使得Q74以H/K/N/Q/R/S變化。使得R81用NNK簡并密碼子在所有20種氨基酸中變化，其中N表示為腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸各自的25％混合物，并且K為鳥嘌呤或胸腺嘧啶。使得剩余的殘基以F/I/L/V變化。使用以下寡聚物通過裝配PCR構(gòu)建文庫：

IL-2_affmat_ass01

GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCA(SEQ ID NO：35)

IL-2_affmat_ass02

CAAAATCATCTGTAAATCCAGAAGTAAATGCTCCAGTTGTAGCTGTG(SEQ ID NO：36)

IL-2_affmat_ass03

GGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCA(SEQ ID NO：37)

IL-2_affmat_ass04B

AACTTAGCTGTGAGCATCCTGGTGAGTTTGGGATTCTTGTAATTATT(SEQ ID NO：38)

IL-2_affmat_ass05B

GGATGCTCACAGCTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTG(SEQ ID NO：39)

IL-2_affmat_ass06

GTTCTTCTTCTAGACACTGAAGATGTTTCAGTTCTGTGGCCTTCTTG(SEQ ID NO：40)

IL-2_affmat_ass07

CAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTA(SEQ ID NO：41

IL-2_affmat_ass08GTGAAAGTTTTTGCTSYKAGCTAAATTTAGCACTTCCTCC(SEQ ID NO：42)

IL-2_affmat_ass09

AGCAAAAACTTTCACNTCNNKCCCAGGGACNTCNTCAGCAATNTCAACGTANTCNTCCTGGAACTAAAGGGATC(SEQ ID NO：43)

IL-2_affmat_ass10

CATCAGCATATTCACACATGAATGTTGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG(SEQ ID NO：44)

IL-2_affmat_ass11

ATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA(SEQ ID NO：45)

IL-2_affmat_ass12

AGATGATGCTTTGACAAAAGGTAATCCATCTGTTCAGAAATTCTACAAT(SEQ ID NO：46)

IL-2_affmat_ass13TTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACTGGATCCTCTGGTGGC(SEQ ID NO：47)

用以下寡聚物擴(kuò)增定點(diǎn)PCR：

PCR擴(kuò)增寡聚物(包括50bp同源性)

dL-2_site2_assFor：

5’-

AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(SEQ ID NO：48)

IL-2_site2_assRev：

5’-

ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO：49)

PCR產(chǎn)生40μg DNA，將其與雙重消化的pCT302和電感受態(tài)EBY100酵母混合，并如用第一代文庫一樣電穿孔。

第二代IL-2文庫的選擇：使文庫經(jīng)受針對IL-2Rβ的五輪選擇(圖2B)。與用第一代文庫完全一樣進(jìn)行此選擇方法，只是對使用的IL-2Rβ的濃度進(jìn)行修改(第1輪-1μM，第2輪-100nM，第3輪-30nM，第4輪-30nM，第5輪-10nM，所有單體IL-2Rβ)。在選擇結(jié)束后，將第4輪和第5輪酵母培養(yǎng)物鋪在SD-CAA平板上，這產(chǎn)生單獨(dú)的酵母菌落。來自這兩輪的48個(gè)單獨(dú)的酵母克隆在96孔板塊形式中培養(yǎng)，并且通過用5nM IL-2Rβ、然后用SAV-PE標(biāo)記進(jìn)行篩選。篩選產(chǎn)生了對IL-2Rβ的7種高親和力結(jié)合劑(圖3和表2)。相對于野生型IL-2中的相應(yīng)殘基在這7種高親和力結(jié)合劑間的氨基酸差異與對IL-2Rβ的結(jié)合親和力一起顯示在表2中。

表2

實(shí)施例3：IL-2突變蛋白蛋白表達(dá)和純化

將人IL-2變體(氨基酸1-133)、IL-2Rβ胞外域(氨基酸1-214)和γ_c(氨基酸34-232)與N-末端gp67信號序列和C-末端六組氨酸標(biāo)簽以讀碼框的方式克隆到pAcGP67-A載體(BD Biosciences)中，并使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。通過在SF900II培養(yǎng)基(Invitrogen)中生長的草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf9)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增來制備桿狀病毒儲液，并且在 Insect XPRESS^TM培養(yǎng)基(Lonza)中生長的懸浮液粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five^TM)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。蛋白質(zhì)被表達(dá)，并且在48-60小時(shí)后通過鎳瓊脂糖(QIAGEN)從HighFive^TM上清液中捕獲、濃縮并通過在10mM HEPES(pH 7.2)和150mM NaCl中平衡的Superdex^TM200柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色譜純化。表達(dá)完全糖基化在SPR和基于細(xì)胞的測定中使用的IL-2變體。對于生物素化受體表達(dá)，將IL-2Rβ和γ_c克隆到具有C-末端生物素受體肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE和六組氨酸標(biāo)簽的pAcGP67-A載體中。在過量生物素(100uM)的情況下共表達(dá)受體蛋白與BirA連接酶。

實(shí)施例4：CD25^-和CD25⁺天然殺傷(YT-1)細(xì)胞的刺激

將YT-1和CD25+YT-1細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、最低非必需氨基酸、丙酮酸鈉、25mM HEPES和青霉素-鏈霉素(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如下純化CD25⁺YT-1細(xì)胞：用FACS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水+2％牛血清白蛋白)洗滌1x 10⁷個(gè)細(xì)胞，并用1mL FACS緩沖液中的PE-綴合的抗人CD25(1：20；Biolegend，San Diego，CA)于4℃下染色20分鐘。用偶聯(lián)至抗-PEIgG的順磁性微珠標(biāo)記染色的細(xì)胞，并根據(jù)制造商的說明書(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)用LS分離柱分離。將洗脫的細(xì)胞以1x10⁵個(gè)細(xì)胞的濃度重懸于完全RPMI培養(yǎng)基中，并擴(kuò)增用于隨后的實(shí)驗(yàn)。經(jīng)由使用 C6流式細(xì)胞儀的具有FL-2通道的流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測細(xì)胞的富集。

通過用流式細(xì)胞術(shù)測定STAT5磷酸化來測定YT-1細(xì)胞上的H9、D10和6-6的劑量-響應(yīng)關(guān)系(圖4A和4B)。用FACS緩沖液洗滌CD25⁺或CD25^-YT-1細(xì)胞，并重懸于96孔板中的200μL具有指定濃度的野生型、6-6、H9或D10的FACS緩沖液內(nèi)。在室溫下刺激細(xì)胞20分鐘，然后通過添加甲醛至1.5％固定，并孵育10分鐘。用100％冰冷的甲醇在冰上透化細(xì)胞20分鐘，然后在-80℃孵育過夜。將固定的、透化的細(xì)胞用過量的FACS緩沖液洗滌，并與在FACS緩沖液中以1：20稀釋的50μL Alexa647綴合的抗STAT5 pY694(BD Biosciences，San Jose，CA)孵育20分鐘。將細(xì)胞在FACS緩沖液中洗滌兩次，并使用 C6流式細(xì)胞儀以FL-4通道測定平均細(xì)胞熒光。

通過利用IL-2的充分表征的突變，即第42位的苯丙氨酸突變到丙氨酸(F42A)進(jìn)一步測試了IL-2突變蛋白(所謂的“超級-2”分子)的CD25非依賴性，所述突變消除對CD25的結(jié)合但不影響其結(jié)合至IL-2Rβ或IL-2Rγ的能力(Mott，1995)。也將此突變引入H9突變蛋白中，產(chǎn)生H9F42A。在CD25-和CD25+YT-1細(xì)胞上通過IL-2、IL-2F42A、H9和H9F42A的STAT誘導(dǎo)進(jìn)行比較(圖5)。盡管IL-2F42A突變使CD25+細(xì)胞上的野生型IL-2的劑量響應(yīng)曲線右移約1個(gè)對數(shù)，但F42A突變對CD25-細(xì)胞上的STAT誘導(dǎo)沒有可觀察到的影響(圖5A)。相比之下，H9和H9F42A的劑量響應(yīng)曲線在CD25-和CD25+細(xì)胞上基本上重疊(圖5B)。因此，這些實(shí)驗(yàn)證明，雖然IL-2突變蛋白不明顯受益于CD25的存在，但它們的活性對破壞CD25界面的突變不敏感。

實(shí)施例5：CD25-和CD25+T細(xì)胞的刺激

分別使用經(jīng)抗體包被的CD4T細(xì)胞分離磁珠(Stem Cell Technologies and Miltenyi Biotec)從PBMC(Stanford Blood Bank)和BALB/C小鼠的脾和淋巴結(jié)制備人和小鼠CD4T細(xì)胞。對于首次用于試驗(yàn)的細(xì)胞刺激測定，立即使用細(xì)胞。為了產(chǎn)生體外‘有經(jīng)歷的’T細(xì)胞，在用碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中的二抗(Vector Labs)預(yù)包被孔，然后用100ng/mL的抗CD3(對于人類為OKT3，對于小鼠為2C11，eBiosciences)包被板。用可溶性抗CD28以0.1x10⁶個(gè)細(xì)胞/孔接種T細(xì)胞(對于人為CD28.2，對于小鼠為37.51，eBiosciences)。將細(xì)胞在完全TCR刺激下培養(yǎng)3天，然后在條件化培養(yǎng)基中靜置2天，并且在新鮮培養(yǎng)基中靜置2天。在使用前，通過Lympholyte-M(Cederlane)離心收集活細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

評估IL-2突變蛋白對缺乏CD25表達(dá)或經(jīng)表達(dá)的CD25的T細(xì)胞的活性(圖6)。在1ng/ml至1000ng/ml的蛋白質(zhì)濃度范圍在STAT5磷酸化方面，測定野生型IL-2和6種IL-2突變蛋白的劑量響應(yīng)關(guān)系。IL-2突變蛋白刺激CD25缺陷T細(xì)胞中的STAT5磷酸化的能力與其對IL-2Rβ的親和力高度相關(guān)。由IL-2突變蛋白引起的STAT5磷酸化的增加比IL-2大兩個(gè)數(shù)量級。

還評估了IL-2突變蛋白刺激有經(jīng)歷的人CD4+T細(xì)胞上的STAT5磷酸化的能力(圖7)，所述細(xì)胞表達(dá)大量完全I(xiàn)L-2受體復(fù)合物，CD25(IL-2Rα)、IL-2Rβ和γ_c。體外TCR刺激人CD4T細(xì)胞并靜置以產(chǎn)生‘有經(jīng)歷的’人CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞。在1ng/mL時(shí)，幾乎沒有觀察到STAT5磷酸化的差異。每種IL-2變體(包括野生型)刺激超過90％的細(xì)胞。在0.1ng/mL下，觀察到小的差異。野生型IL-2導(dǎo)致48％pSTAT5刺激，并且IL-2突變蛋白產(chǎn)生65-79％的pSTAT5刺激。因此，IL-2突變蛋白明顯比野生型IL-2更好地刺激有經(jīng)歷的人T細(xì)胞，但是增強(qiáng)不如在缺乏CD25的細(xì)胞上一樣明顯

實(shí)施例6：NK細(xì)胞細(xì)胞毒性測定

使用EGFR(內(nèi)皮生長因子受體)-表達(dá)鱗狀腫瘤細(xì)胞系(SCC6)和EGFR單克隆抗體西妥昔單抗評估了D10IL-2突變蛋白對天然殺傷細(xì)胞功能，特別是自發(fā)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的影響。人EGFR陽性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCC6作為禮物從J.Sunwoo實(shí)驗(yàn)室(Stanford，CA)獲得。在補(bǔ)充有10％熱滅活的FCS(HyClone Laboratories)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(均來自Invitrogen Life Technologies)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies)中培養(yǎng)SCC6細(xì)胞系。在37℃下在5％CO₂中在培養(yǎng)物中粘附生長細(xì)胞。西妥昔單抗(小鼠嵌合IgG1抗人表皮生長因子受體-EGFR；IMC-C225；)獲自Bristol-Myers Squibb。

如下進(jìn)行鉻釋放：從含有約1x10⁹個(gè)細(xì)胞的健康供體白細(xì)胞-減少的系統(tǒng)(LRS)產(chǎn)物中分離NK細(xì)胞。通過根據(jù)制造商的說明書使用NK細(xì)胞分離珠(Miltenyi Biotec)進(jìn)行陰性磁性細(xì)胞分選來分離NK細(xì)胞。評估NK細(xì)胞的純度(如通過CD3-CD56⁺流式細(xì)胞術(shù)定義的＞90％純度)。用150μCi⁵¹Cr/1x10⁶個(gè)細(xì)胞標(biāo)記SCC6靶細(xì)胞2小時(shí)。在將純化的NK細(xì)胞以0∶1、1∶1和5∶1的可變的效應(yīng)子∶靶細(xì)胞比率⁵¹Cr標(biāo)記的SCC6細(xì)胞在單獨(dú)的培養(yǎng)基、西妥昔單抗(100pg/mL)、IL-2(1000IU/mL)、IL-2D10(1pg/mL)、IL-2D10(10pg/mL)、或包括西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2(1000IU/mL)、西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2D10(1pg/mL)或西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2D10(10pg/mL)的組合中培養(yǎng)5小時(shí)后測定裂解百分比。一式三份進(jìn)行測定。在存在或缺乏可變濃度的西妥昔單抗、IL-2或IL-2D10的情況下，用⁵¹Cr標(biāo)記的SCC6細(xì)胞培養(yǎng)純化的NK細(xì)胞。NK細(xì)胞自發(fā)細(xì)胞毒性的D10刺激優(yōu)于高劑量IL-2(圖8，*p＝.008，**p＝.001)，在沒有IL-2或D10刺激的情況下具有最小的自發(fā)細(xì)胞毒性。與單獨(dú)的高劑量IL-2或西妥昔單抗相比，類似地通過D10刺激增加西妥昔單抗結(jié)合的SCC6的ADCC(*p＝.0005，**p＝.0001)。值得注意的是，與高劑量IL-2相比，用D10在所有效應(yīng)子∶靶物比率(包括1∶1)下發(fā)生細(xì)胞毒性(自發(fā)和ADCC兩者)更優(yōu)的功能性增強(qiáng)。

實(shí)施例7：IL-2突變蛋白在對抑制子-類型T細(xì)胞(Treg)的相對低刺激的情況下導(dǎo)致增強(qiáng)的記憶表型擴(kuò)增

在體內(nèi)評估IL-2突變蛋白H9對表達(dá)低水平CD25但高水平IL-2Rβγ的記憶表型CD8⁺T細(xì)胞的擴(kuò)增的效能。C57B1/6小鼠接受PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復(fù)合物，并通過流式細(xì)胞術(shù)評估脾CD3⁺CD4⁺CD44^高記憶表型T細(xì)胞的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。制備脾細(xì)胞懸液，并且用熒光染料-綴合的單克隆抗體CD3(克隆145-2C11，eBioscience)、CD4(克隆RM4-5，Caltag Laboratories)、CD8a(克隆53-6.7，BD Biosciences)、CD25(克隆PC61，BD Biosciences)、CD44(克隆IM7，eBioscience)NK1.1(克隆PK136，BD Biosciences)和Thy1.1(克隆HIS51，eBioscience)染色。使用BD FACSCanto^TM II流式細(xì)胞儀獲得至少100,000個(gè)活細(xì)胞，并使用FlowJo軟件(TriStar，Inc.)分析。如圖10A所示，相對于其它治療形式，用公開的IL-2突變蛋白處理導(dǎo)致記憶表型T細(xì)胞的更大的擴(kuò)增，且CD3⁺CD4⁺CD25^高T細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞的擴(kuò)增有限(圖10B)。

實(shí)施例8：IL-2突變蛋白的降低的體內(nèi)毒性

已知IL-2治療可以導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如急性肺水腫，其是目前阻止更有效使用IL-2的限制。因此，評估了公開的IL-2突變蛋白相對于IL-2的毒性(圖11A)。C57B1/6小鼠每天接受PBS，20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗-IL-2單克隆抗體復(fù)合物的腹膜內(nèi)注射達(dá)連續(xù)5天。在過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移后6天，取出肺，并在58℃下在真空下干燥過夜之前和之后稱重。通過從脫水后肺重量減去初始肺重量計(jì)算肺濕重。

實(shí)施例9：IL-2突變蛋白的增加的體內(nèi)抗腫瘤活性

在體內(nèi)測試公開的IL-2突變蛋白對腫瘤細(xì)胞的效能。將100μl RPMI中的10⁶個(gè)B16F10黑素瘤細(xì)胞注射到小鼠背部的上部真皮中(每組3-4只小鼠)。處理由PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復(fù)合物(IL-2/mAb)的每日5次注射組成，并在腫瘤結(jié)節(jié)在約15mm²的大小時(shí)清楚可見并且可觸知后一天開始。公開的IL-2突變蛋白導(dǎo)致增強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，如圖11B中表明。

實(shí)施例10：IL-2突變蛋白和IL-2的結(jié)構(gòu)比較

重組表達(dá)幾種IL-2突變蛋白以便通過表面等離子體共振(SPR)測量它們對IL-2Rβ的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。IL-2至IL-2Rβ的親和力為K_D＝280nM。IL-2突變蛋白聚簇成低、中和高親和力類別。低親和力IL-2突變蛋白(5-2和6-6)分別以50至70nM的K_D結(jié)合IL-2Rβ，從野生型IL-2的4-6倍的親和力增加幾乎完全通過L85V取代。從二級定點(diǎn)文庫選擇的中和高親和力突變體分別具有10-15nM(C5，H4)和1.2-1.7nM(B1，D10，E10，G8，H9)的K_D。以解離速率的降低一致表現(xiàn)親和力增加，并且高親和力IL-2突變蛋白在L80F/R81D/L85V/I86V/I92F的隨機(jī)化位置中含有共有序列。

為了理解IL-2突變蛋白的結(jié)構(gòu)結(jié)果，將D10突變蛋白以及結(jié)合到IL-2Rβ和γ_c的D10的三級復(fù)合物結(jié)晶。在單獨(dú)的D10的結(jié)構(gòu)中，6個(gè)突變中的5個(gè)在不與IL-2Rβ接觸的位置中聚簇在B-C環(huán)上和C螺旋核心內(nèi)。值得注意的是，B-C螺旋接頭區(qū)域與該區(qū)域部分或完全無序的其它IL-2結(jié)構(gòu)相比在電子密度圖中是良好排序的(圖9)?？偟膩碚f，F(xiàn)80、V85和V86取代似乎塌陷成疏水簇，其穩(wěn)定環(huán)并將C螺旋‘釘’到分子的核心中，從而相對于螺旋B堆積。H74和D81突變是溶劑暴露的，并且因此，它們的結(jié)構(gòu)作用是不太清楚的，然而Asp是可以進(jìn)一步有助于螺旋C結(jié)構(gòu)的公知的螺旋N-加帽殘基。6個(gè)共有突變中僅一個(gè)I92F位于與受體復(fù)合物中的IL-2Rβ接觸的位置。Phe92深深插入C和A螺旋之間，與Ile92相比僅有助于復(fù)合物中被IL-2Rβ掩埋的分子表面的另外因此，其IL-2Rβ接觸可能僅對D10的總體約300倍親和力增加產(chǎn)生較小的貢獻(xiàn)。

還測定了D10三級受體復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)以評估突變是否已經(jīng)擾亂IL-2Rβ/γc受體對接幾何學(xué)。將D10和IL-2Rβ的穩(wěn)定三級復(fù)合物結(jié)晶，并在缺乏CD25的情況下純化。在D10三級復(fù)合物中的總體IL-2Rβ/γc異二聚體構(gòu)造和細(xì)胞因子/IL-2Rβ接觸模式基本上與先前報(bào)道的四級裝配體相同。因此，超級-2的效能增加不是由于受體二聚體構(gòu)造的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的，而是可能是由于親和力增強(qiáng)導(dǎo)致的。

如較早討論，IL-2的C-螺旋似乎在結(jié)合至IL-2Rα后經(jīng)歷微妙的復(fù)位(repositioning)，如在二級和四級復(fù)合物兩者中看到的。相比之下，在PDB數(shù)據(jù)庫中的三種野生型無配體結(jié)構(gòu)的檢查揭示了C-螺旋位置的可變性，與該螺旋中相對于分子的其余部分的更高B因子一致。進(jìn)行D10的結(jié)構(gòu)與無配體的IL-2，和受體復(fù)合物中的IL-2的結(jié)構(gòu)的比較。觀察到D10中的C螺旋比游離形式更類似于在IL-2的兩種受體結(jié)合的構(gòu)象中看到的，已經(jīng)經(jīng)歷上移并進(jìn)入螺旋核中。

使用分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬詢問IL-2突變蛋白被賦予對IL-2Rβ的更高的結(jié)合親和力的機(jī)制。構(gòu)建原子上詳細(xì)的馬爾可夫狀態(tài)模型(Markov state model，MSM)以直接探測IL-2對IL-2突變蛋白的相對構(gòu)象柔性。此MSM中的狀態(tài)來自由原子論模擬產(chǎn)生的快速相互轉(zhuǎn)換構(gòu)象的動(dòng)力學(xué)聚簇。這些亞穩(wěn)狀態(tài)中的每一個(gè)對應(yīng)于潛在的自由能量圖景中的局部最小值，其最終確定系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。MSM的分析表明IL-2突變蛋白可以比IL-2更穩(wěn)定，并且IL-2比IL-2突變蛋白訪問幾乎多兩倍的簇。例如，與IL-2的約0.05相比，IL-2突變蛋白填充狀態(tài)具有約0.20的平衡概率。與IL-2相比，螺旋B、B-C環(huán)和螺旋C在IL-2突變蛋白中是剛性化的。由于進(jìn)化突變位于B-C環(huán)(H74，D81)上，并且在B和C螺旋堆積界面(F80，V85，V86)內(nèi)，兩個(gè)螺旋(不僅僅是螺旋C)受益于突變并且經(jīng)歷共同的穩(wěn)定化。F92似乎起螺旋C和螺旋A之間的分子楔的作用，在螺旋的更為C末端起額外的穩(wěn)定化影響的作用。MD模擬暗示螺旋B也在超級-2中經(jīng)歷穩(wěn)定化是一個(gè)驚喜，因?yàn)檫@從IL-2晶體結(jié)構(gòu)的比較是不明顯的。IL-2Rα主要在B螺旋和D螺旋的部分上結(jié)合至IL-2。MD模擬表明IL-2Rα與IL-2的結(jié)合可以使螺旋B剛性化的可能性，并且這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化可以傳播到B-C環(huán)和螺旋C。原則上，類似于IL-2突變蛋白中的進(jìn)化突變的表觀效應(yīng)。

來自每種蛋白質(zhì)的模擬的最高填充的構(gòu)象的可視化顯示，螺旋C在IL-2中比在IL-2突變蛋白中遠(yuǎn)更有柔性，并且IL-2突變蛋白中的突變也確實(shí)穩(wěn)定受體結(jié)合樣構(gòu)象。

實(shí)施例11：部分IL-2激動(dòng)劑和拮抗劑

先前開發(fā)了由于增強(qiáng)的對IL-2Rβ的結(jié)合親和力而具有提升作用的IL-2“超級因子”(Levin等人，Nature 484：529(2012))。假設(shè)此高親和力超級因子/IL-2Rβ復(fù)合物可以充當(dāng)顯性陰性支架以創(chuàng)建“受體信號傳導(dǎo)夾”，從而阻斷內(nèi)源信號傳導(dǎo)。這些超級IL-2“完全激動(dòng)劑”減少與γ_c的結(jié)合的定向突變將減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化并且代表新一類的基于機(jī)制的IL-2部分激動(dòng)劑和非信號傳導(dǎo)(中性)分子，所述分子通過阻斷內(nèi)源性細(xì)胞因子并且自身不施加作用而功能性地用作拮抗劑(參見圖1中的示意圖)。

基于IL-2-IL-2R晶體結(jié)構(gòu)，鑒定了IL-2-γ_c界面處的四個(gè)關(guān)鍵殘基(圖12A)，并且產(chǎn)生了H9變體，每個(gè)H9變體含有一個(gè)(Q126T)、兩個(gè)(L18R，Q22E)、三個(gè)(L18R、Q22E和Q126T)或四個(gè)(L18R、Q22E、Q126T和S130R)突變(分別表示為H9-T、H9-RE、H9-RET和H9-RETR，基于新引入的氨基酸)。通過表面等離子體共振，重組H9和H9-RET蛋白質(zhì)對IL-2Rβ具有相似的親和力。然而，盡管H9-IL-2Rβ復(fù)合物有效地結(jié)合γ_c(圖12B)，但H9-RET-IL-2Rβ不然(圖12C)。

為了測定H9變體的活性，純化NK樣YT-1細(xì)胞的CD25⁺和CD25^-亞-群，并定量信號傳導(dǎo)。H9突變體表現(xiàn)為IL-2部分激動(dòng)劑，產(chǎn)生從STAT5的磷酸化的野生型E_max(最大可能效應(yīng))水平的約90％下降到約10％的信號傳導(dǎo)功效的范圍(圖13A)，其中每種類似物的活性的水平與γ_c界面處的突變程度負(fù)相關(guān)。信號傳導(dǎo)效能相對獨(dú)立于IL-2Rα，如通過CD25⁺(圖13B)對比CD25^-(圖13C)YT-1細(xì)胞上的H9-RET和H9-RETR的相對E_max值證明，表明了改變的對IL-2Rβ和γ_c的結(jié)合主要負(fù)責(zé)H9變體的行為。

H9-RET和H9-RETR也展現(xiàn)其它IL-2信號傳導(dǎo)途徑的減少的誘導(dǎo)，包括CD25⁺YT-1細(xì)胞中的pERK1/ERK2(圖14A)。由于受體內(nèi)化是信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵事件，還評估了響應(yīng)于IL-2變體的YT-1細(xì)胞中的IL-2Rβ和IL-2Rγ的表面表達(dá)。與IL-2和H9一樣，H9-RET和H9-RETR兩者都驅(qū)動(dòng)快速和完全的IL-2Rβ內(nèi)化(圖13B)，但是這些部分激動(dòng)劑在促進(jìn)γ_c的內(nèi)化方面效率低得多(圖13C)，這與它們對γ_c的結(jié)合降低一致。因此，可變地破壞H9的γ_c-結(jié)合界面可以產(chǎn)生多種IL-2部分激動(dòng)劑，潛在地具有廣泛的一大批信號傳導(dǎo)功效。

接下來，分析這些分子在原代細(xì)胞中的效果。確定H9-RET和H9-RETR都不能在新鮮分離的CD8⁺T細(xì)胞(圖13，E和F，上圖)中誘導(dǎo)pSTAT5，所述新鮮分離的CD8⁺T細(xì)胞比活化的CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)更少的IL-2β和IL-2Rγ(圖14b，上圖對比下圖)和幾乎無或無IL-2Rα(圖13E，左上圖)。然而，顯著地，在用抗-CD3+抗CD28活化CD8⁺T細(xì)胞后，H9-RET可以誘導(dǎo)STAT5(圖13E，右下圖；圖13F，下圖；圖13G)和S6核糖體蛋白(圖13H)(PI 3-激酶信號傳導(dǎo)途徑的成員)的弱/部分磷酸化，而H9-RETR基本上保持惰性。有趣的是，H9-T在新鮮分離的CD8⁺T細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)pSTAT5(圖13E，右上圖)，并且這在預(yù)活化的T細(xì)胞中顯著增加，雖然仍然達(dá)不到用IL-2、H9或H9-RE觀察到的水平(圖13E，右下圖和圖13G)。因此，H9-T和H9-RET展現(xiàn)出表明真正的部分激動(dòng)劑的中間活性。

鑒于由H9-RET和H9-RETR誘導(dǎo)的弱pSTAT5表達(dá)，進(jìn)一步研究了這些分子對淋巴細(xì)胞增殖的影響。既然IL-2和H9強(qiáng)烈誘導(dǎo)原代CD8⁺T細(xì)胞的增殖并且H9-T在其作用中是中間的，H9-RET和H9-RETR都不誘導(dǎo)這些細(xì)胞的增殖，如通過羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺基二酯(CFSE)稀釋(圖15)或通過[³H]-胸苷摻入(圖16A，上圖)評估。然而，當(dāng)使用預(yù)活化的細(xì)胞時(shí)，H9-RETR仍然沒有效果，但是H9-RET可再現(xiàn)地誘導(dǎo)增殖(圖16B，下圖)，揭示了H9-RET可以在不同的細(xì)胞亞群中誘導(dǎo)不同的功能結(jié)果，與H9-RET對新鮮分離的對比預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中的pSTAT5的差異影響一致(圖13E)。如預(yù)期的，IL-2和H9可以在預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中有效誘導(dǎo)IL-2Rα表達(dá)，并且H9-T在其IL-2Rα誘導(dǎo)水平上是中間的，而H9-RET和H9-RETR顯著降低IL-2Rα表達(dá)，實(shí)際上降低到低于對照水平，推測反映它們與內(nèi)源性IL-2的有效競爭(圖17)。RNA-Seq接下來用于進(jìn)一步闡明H9-RET和H9-RETR在預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中的弱作用的基礎(chǔ)(圖16，B和C)。如預(yù)期的，IL-2和H9誘導(dǎo)控制細(xì)胞周期或參與細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的基因(例如CCND2、IL2RA、CISH和CDK6)但抑制許多其它基因(例如IL7R、BCL6)，而H9-RET僅具有弱刺激活性，并且H9-RETR幾乎沒有效果(圖16B和表S1，揭示了完全和部分激動(dòng)劑信號之間的基因表達(dá)的定量和定性差異兩者。IL-2和H9誘導(dǎo)的基因多于它們抑制的基因，而H9-RETR抑制的基因多于它誘導(dǎo)的基因，盡管其總體作用是最小的(圖16C)。由于STAT5是IL-2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵介質(zhì)，染色質(zhì)免疫沉淀和下一代測序(ChIP-Seq)用于全局評估基因組STAT5結(jié)合。H9-RET和H9-RETR-誘導(dǎo)的STAT5與共有TTCnnnGAA基序的結(jié)合，但是在比用IL-2或H9觀察到的位點(diǎn)少得多的位點(diǎn)處(圖16D)?；跓釄D聚簇，僅約35％的IL-2誘導(dǎo)的STAT5位點(diǎn)也由H9-RET誘導(dǎo)，而H9-RETR幾乎無影響(圖16E)。通過RT-PCR證實(shí)了由IL-2和H9對預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞中的幾種STAT5靶基因的誘導(dǎo)(IL2RA、CISH、LTA)或抑制(IL7RA、BCL6)(圖16F)，而H9-RET和H9-RETR都沒有作用，除了有趣的是，與RETR不同，RET再現(xiàn)性地降低了BCL6表達(dá)(圖16F)。

上述研究建立了H9-RET的減弱的活性和H9-RETR的可忽略的活性，其有效地是IL-2的顯性陰性拮抗劑。鑒于它們對IL-2Rβ的增強(qiáng)的結(jié)合和降低預(yù)活化的T細(xì)胞上的IL-2Rα表達(dá)的能力，假設(shè)這些分子將不僅會抑制內(nèi)源性IL-2，而且還抑制IL-15，其也經(jīng)由IL-2Rβ和γ_c信號傳導(dǎo)。實(shí)際上，H9-RET和H9-RETR兩者都抑制CD8⁺T細(xì)胞中的IL-2-誘導(dǎo)的(圖18A)和IL-15-誘導(dǎo)的(圖18B)pSTAT5，其中H9-RETR更有效。通過H9-RET和H9-RETR處理對pSTAT5的抑制與它們將TCR-誘導(dǎo)的(圖17)和IL-2-誘導(dǎo)的(圖19A)CD25表達(dá)降低至低于在未刺激的對照細(xì)胞中觀察到的那些水平的水平相關(guān)。相應(yīng)地，H9-RET和H9-RETR在預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞中抑制IL-2-誘導(dǎo)的IL2RA mRNA表達(dá)(圖19B)以及IL-2-和IL-15-誘導(dǎo)的增殖(圖19C)。

因?yàn)镠9-RETR抑制IL-2信號傳導(dǎo)，所以推測H9-RETR也會抑制TCR-誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，這取決于IL-2，并且情況確實(shí)如此(圖20A)并且與減少的CD25表達(dá)相關(guān)(圖20B)。類似地，由于IL-2可以促進(jìn)Th1、Th9和Treg分化但抑制Th17分化(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，檢查了H9-RET和H9-RETR對這些過程的影響。引人注目的是，H9-RET和H9-RETR兩者都抑制Th1、Th9和Treg分化，但加強(qiáng)了Th17分化(圖21)，從而強(qiáng)調(diào)了它們作為IL-2的有效拮抗劑的作用。

H9-RETR也有效阻斷由IL-2對原代人NK細(xì)胞的活化，如通過IL-2-誘導(dǎo)的CD69表達(dá)(圖22A)和對乳腺癌細(xì)胞系HER18(圖22B)和慢性骨髓性白血病細(xì)胞系K562(圖22C)的細(xì)胞毒性測量。H9-RET和H9-RETR都不刺激原代NK細(xì)胞進(jìn)行的CD69表達(dá)或細(xì)胞毒性(圖22A)。

實(shí)施例12：部分IL-2激動(dòng)劑和拮抗劑-體內(nèi)作用

鑒于H9-RETR在體外作為IL-2/IL-15拮抗劑的有效性，我們研究了其在體內(nèi)拮抗內(nèi)源細(xì)胞因子的作用的能力。由于IL-2具有短的血清半衰期(Boyman等人，Nature Reviews Immunology 12：180(2012))，H9-RETR融合至人IgG4的Fc片段(Fc4)，所述Fc片段是具有降低的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性/吞噬(ADCC/ADCP)的同種型(Strohl，Current Opinion in Biotechnology 20：685(2009))。引人注目的是，與針對CD25的抗-Tac mAb和針對IL-2Rβ的Mikβ1mAb(Morris等人，Proc Natl Acad Sci US A 103：401(2006))相比，H9-RETR-Fc4有效得多地阻斷預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞中的IL-2-(圖18C)和IL-15-介導(dǎo)的(圖18D)pSTAT5誘導(dǎo)，并且抑制IL-2-(圖18E)和IL-15-(圖18F)誘導(dǎo)的人CD8⁺T細(xì)胞增殖。重要的是，H9-RETR-Fc4在阻斷IL-2增殖(圖18E)中與抗Tac和Mikβ1的組合一樣有效，并且在抑制IL-15-誘導(dǎo)的增殖中比Mikβ1更有效(圖18F)。

接下來評估H9-RETR-Fc的體內(nèi)有效性。在穩(wěn)態(tài)條件下，Treg細(xì)胞是表達(dá)高親和力IL-2受體的原代細(xì)胞的主要群體，并且可以起IL-2信號傳導(dǎo)的系統(tǒng)性‘晴雨表’的作用。在施用IL-2或IL-15之前用H9-RETR-Fc4預(yù)處理小鼠顯著抑制CD4⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞中STAT5的磷酸化，如離體評估(圖23和圖18G)，指示H9-RETR-Fc4作為IL-2拮抗劑的體內(nèi)潛力。由于IL-2和IL-15信號傳導(dǎo)促成實(shí)驗(yàn)鼠模型中的急性GVHD(Ferrara等人，Journal of Immunology 137：1874(1986)；和Blaser等人，Blood 105：894(2005))，假設(shè)H9-RETR-Fc4可以在完全-MHC錯(cuò)配的骨髓移植的T細(xì)胞-介導(dǎo)的C57BL/6-到-BALB/C模型中抑制致死性GVHD。實(shí)際上，用H9-RETR-Fc4處理10天的小鼠比用同種型對照Fc4蛋白處理的小鼠具有更長的存活期(P＜0.001)(圖18H)。

人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒-I(HTLV-I)引起成人T細(xì)胞白血病(ATL)，即CD4⁺T細(xì)胞的惡性擴(kuò)增，所述CD4⁺T細(xì)胞展現(xiàn)出牽涉通過IL-2和IL-15的自分泌信號和通過IL-9的旁分泌信號的早期生長階段。此類細(xì)胞因子依賴性增殖在患有慢性和郁積型，但不是急性ATL的患者中是明顯的(Ju等人，Blood 117，1938(2011))。因此，測試了該系統(tǒng)中H9-RETR的功效。首先使用ATL-洐生的細(xì)胞系ED40515，其生長在體外通過添加外源IL-2支持。H9-RETR有效抑制這些細(xì)胞的增殖，并且優(yōu)于達(dá)利珠單抗和Mikβ1(圖18I)。在那里，接下來使用從具有郁積型ATL的患者新鮮分離的細(xì)胞，并在6天測定中測定自發(fā)增殖。10μg/ml的RETR比達(dá)利珠單抗略有效，并且比Mikβ1有效得相當(dāng)多(圖18J)，強(qiáng)調(diào)其在控制這些強(qiáng)力增殖的惡性細(xì)胞中的潛在效用。

部分激動(dòng)，定義為在配體飽和時(shí)減少的信號傳導(dǎo)幅度(E_max)，是通常與靶向GPCR、通道和其它多通跨膜蛋白的小分子相關(guān)的藥理學(xué)性質(zhì)。還沒有證明通過I型跨膜受體二聚體響應(yīng)于蛋白質(zhì)生長因子、如細(xì)胞因子的可調(diào)信號傳導(dǎo)(部分激動(dòng))的概念?；诮Y(jié)構(gòu)信息，如下工程化IL-2變體，即通過增強(qiáng)在一個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)(IL-2Rβ)處的親和力，同時(shí)減弱在第二受體結(jié)合位點(diǎn)(γ_c)處的相互作用以操縱二聚化和信號啟動(dòng)。由于增強(qiáng)的IL-2Rβ結(jié)合，這些分子相對于內(nèi)源性IL-2占優(yōu)勢，并且它們的γ_c相互作用水平設(shè)置由細(xì)胞察知的信號的強(qiáng)度，從而在部分激動(dòng)劑的Emax水平上“夾住”信號傳導(dǎo)幅度。使用這些部分激動(dòng)劑，證明了新鮮分離的對比預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞具有IL-2信號傳導(dǎo)強(qiáng)度的截然不同的活化閾值，如通過H9-T和H9-RET對這些細(xì)胞的差異作用證明，而H9-RETR(其是一種極弱的部分激動(dòng)劑，如pSTAT誘導(dǎo)所示)具有顯著的抑制性質(zhì)，具有作為新一類免疫抑制劑的潛力。特別地，它可以阻斷如離體評估的IL-2Rα誘導(dǎo)，延長在GVHD模型中存活，并且有效地抑制來自患有郁積型ATL的患者的外周血T細(xì)胞的自發(fā)增殖。除了其對T細(xì)胞的影響外，H9-RETR還抑制NK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性?？紤]到部分激動(dòng)劑的差異活性，較大的一批IL-2變體可以揭示甚至更寬的獨(dú)特信號傳導(dǎo)活性譜，范圍從部分激動(dòng)到完全拮抗并且潛在地包括對T細(xì)胞亞群、如Treg對比效應(yīng)T細(xì)胞具有獨(dú)特作用的另外的分子。此外，我們已經(jīng)使用的合理設(shè)計(jì)方法可以適合于其它γ_c家族細(xì)胞因子，并且實(shí)際上也適合于更寬范圍的細(xì)胞因子和生長因子。另外的部分激動(dòng)劑細(xì)胞因子類似物潛在可以剖析其它方面多向性免疫途徑的功能并且根據(jù)上下文具有獨(dú)特的治療益處。

材料與方法

蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

分泌人IL-2(氨基酸1-133)及其變體、人IL-2Rβ胞外域(氨基酸1-214)和γ_c胞外域(氨基酸34-232)，并且使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)純化，如先前所述(Morgan等人，Science 193：1007(1976年9月10日))。簡言之，將所有構(gòu)建體序列克隆到具有N-末端gp67信號肽和C-末端六組氨酸標(biāo)簽的pAcGP67A載體(BD Biosciences)中。用質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染在SF900 II SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)中在28℃下培養(yǎng)的草地貪夜蛾(Sf9)昆蟲細(xì)胞，以建立高滴度重組病毒，隨后將其擴(kuò)增。用高滴度病毒感染在昆蟲Xpress培養(yǎng)基(Lonza)中于28℃下生長的粉紋夜蛾昆蟲細(xì)胞(Invitrogen)以表達(dá)重組蛋白(Zhu等人，Annual Review of Immunology 28：445(2010)和W.Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008))。在用重組病毒感染后三天，經(jīng)由Ni-NTA(Qiagen)親和色譜提取蛋白質(zhì)、濃縮，并且用在10mM HEPES(pH7.3)和150mM NaCl中平衡的Superdex 200分篩柱(GE Healthcare)進(jìn)一步純化至＞98％同質(zhì)性。還通過將人IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域(Fc4)或后面有C末端人IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域的人IL-2RETR變體(Fc4-RETR)克隆到含有N末端gp67信號肽和C末端六組氨酸標(biāo)簽的pAcGP67A載體中，使用該桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分泌和純化Fc4和Fc4-RETR融合蛋白。從具有工程化的Ser228 Pro突變的經(jīng)修飾的pFUSE-hIgG4-Fc載體(Invivogen)獲得人IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域(Liao等人，Nat Immunol 12：551(2011))。對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，如先前所述(Cheng等人，Immunol Rev 241：63(2011))使用Triton X-114從制備的蛋白質(zhì)中去除內(nèi)毒素，并且用LAL生色內(nèi)毒素定量試劑盒(Thermo Scientific)確認(rèn)內(nèi)毒素去除。

對于生物素化的蛋白質(zhì)表達(dá)，表達(dá)具有C-末端生物素受體肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE的γ_c，并經(jīng)由Ni-NTA(Qiagen)親和色譜純化，然后用0.SmM Bicine pH8.3，100mM ATP，100mM乙酸鎂和500mM生物素(Sigma)中的可溶性BirA連接酶生物素化。通過在10mM HEPES(pH 7.3)和150mM NaCl中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色譜純化蛋白質(zhì)。

表面等離子體共振結(jié)合測量

經(jīng)由在Biacore T100儀器上使用Biacore SA傳感器芯片(GE Healthcare)的表面等離子體共振(SPR)研究表征結(jié)合相互作用。以低密度(RU_max＜100個(gè)響應(yīng)單位)將γ_c固定于芯片表面，并將H9：IL-2Rβ或H9-RET：IL-2Rβ復(fù)合物的連續(xù)稀釋液暴露于表面60秒。然后跟蹤解離200秒。將無關(guān)的生物素化蛋白質(zhì)固定在參考通道中以從測量中減去非特異性結(jié)合。在25℃下在補(bǔ)充有0.2％BSA的HBS-P+緩沖液(GE Healthcare)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有結(jié)合研究以30mL/min的流速進(jìn)行以使質(zhì)量運(yùn)輸貢獻(xiàn)最小化并防止分析物的再結(jié)合。對于所有測量，假定1∶1 Langmuir結(jié)合模型，使用Biacore T100評估軟件2.0版實(shí)施數(shù)據(jù)分析及平衡和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定。

CD25⁺YT-1細(xì)胞的組織培養(yǎng)和磁性純化

在RPMI完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、最低非必需氨基酸、丙酮酸鈉、25mM HEPES和青霉素-鏈霉素(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基)中培養(yǎng)未修飾的YT9(Zhu等人，AnnualReview of Immunology 28：445(2010))和CD25⁺YT-1天然殺傷樣細(xì)胞(Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008))。在37℃下在具有5％CO₂的濕潤氣氛中維持這兩種細(xì)胞系。

如先前詳述(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，經(jīng)由磁性選擇純化表達(dá)或不表達(dá)CD25的YT-1細(xì)胞的亞群。用FACS緩沖液(含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2)洗滌1000萬個(gè)未分選的CD25⁺YT-1細(xì)胞，隨后在4℃下與FACS緩沖液中的PE-綴合的抗人CD25抗體(Biolegend，克隆BC96)孵育2小時(shí)。然后將PE-染色的CD25⁺細(xì)胞在4℃下用綴合至抗-PE IgG的順磁性微珠標(biāo)記20分鐘，用冷FACS緩沖液洗滌一次，并根據(jù)制造商的方案使用LS MACS分離柱(Miltenyi Biotec)分選。將洗脫的細(xì)胞重懸并在RPMI完全培養(yǎng)基中生長，并使用Accuri C6流式細(xì)胞儀評價(jià)CD25⁺細(xì)胞的富集。通過使用PE-綴合的抗人CD25抗體的流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測分選的CD25⁺YT-1細(xì)胞上的CD25表達(dá)的持久性。

細(xì)胞內(nèi)磷酸-STAT5和磷酸-ERK1/2的流式細(xì)胞術(shù)分析將大約2x10⁵個(gè)YT或CD25⁺YT-1細(xì)胞在96孔板的每個(gè)孔中涂鋪，用FACS緩沖液洗滌，并重懸于FACS緩沖液中，所述FACS緩沖液含有IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR的連續(xù)稀釋液。將細(xì)胞在37℃下刺激20分鐘，并立即通過加入甲醛至1.5％固定，然后在室溫下孵育10分鐘。然后將細(xì)胞用100％冰冷的甲醇在4℃下透化30分鐘以允許檢測細(xì)胞內(nèi)信號效應(yīng)物。將固定且透化的細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌兩次，并在室溫下與在FACS緩沖液中稀釋的Alexa488-綴合的抗-STAT5 pY694(BD Biosciences)或Alexa488-綴合的抗ERK1/2 pT202/pY204(BD Biosciences)孵育2小時(shí)。然后將細(xì)胞在FACS緩沖液中洗滌兩次，并在Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)上定量平均熒光強(qiáng)度(MFI)。產(chǎn)生劑量-響應(yīng)曲線，并且在扣除未刺激細(xì)胞的MFI并相對于通過細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)的最大信號強(qiáng)度歸一化之后使用GraphPad Prism數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算EC₅₀和E_max值。

人CD8⁺T細(xì)胞分離及pSTAT5和pS6-核糖體蛋白的細(xì)胞內(nèi)染色

從來自NIH血庫的健康供體獲得血沉棕黃層(buffy coat)，并使用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(Mediatech，Inc.，VA)通過梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。使用人CD8⁺T細(xì)胞分離試劑盒I(Miltenyi Biotec，Germany)分離細(xì)胞。對于預(yù)活化細(xì)胞，用2μg/ml板結(jié)合的抗-CD3mAb(BD Biosciences)預(yù)包被6孔板。將細(xì)胞以1x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml接種于具有1μg/ml可溶性抗-CD28mAb(BD Biosciences)的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和10％FBS的RPMI培養(yǎng)基)中3天，然后在新鮮培養(yǎng)基中靜置48小時(shí)。如先前所述(Liao等人，Immunity 38：13(2013))對原代人CD8⁺T細(xì)胞進(jìn)行劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)；簡言之，將細(xì)胞用IL-2、H9、H9-RET、H9-RETR的連續(xù)稀釋液處理，然后在室溫下用Phosflow Fix Buffer I固定10分鐘(BD Biosciences)，并用FACS緩沖液洗滌一次。然后通過緩慢加入冷的BD PhosflowTM Perm緩沖液III使細(xì)胞透化，并在冰上孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞，并在室溫下在黑暗中用PE-綴合的抗STAT5 pY694(BD Biosciences)或APC-綴合的抗磷酸-S6核糖體蛋白(Ser235/236)(克隆D57.2.2E)染色30分鐘，再次用FACS緩沖液洗滌，并在FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)上獲得數(shù)據(jù)，并使用FlowJo(Tree Star)分析。

STAT5磷酸化的離體分析

C57BL/6小鼠來自Jackson實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物方案由NHLBI動(dòng)物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)并遵循NIH指南，“Using Animals in Intramural Research”。使用制造商的方案(BD Bioscience)測定STAT5磷酸化。簡言之，將IL-2或IL-15i.p.注射到C57BL/6小鼠中，分離總體脾細(xì)胞，立即使用BD Phosphoflow^TM Lyse/Fix緩沖液固定，用冰冷的PBS洗滌兩次，使用抗CD4和抗CD25抗體(Biolegend)染色，然后使用BD PhosFlow Perm緩沖液III在冰上在黑暗中透化30分鐘。然后用冰冷的FACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，用抗FoxP3按照制造商的方案(eBioscience)染色，用冰冷的FACS緩沖液洗滌兩次，并用抗磷酸-STAT5-PE(1：30)(BD)在室溫下在黑暗中染色30分鐘。用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞三次，并在FACS Canto流式細(xì)胞儀(BD)上獲得數(shù)據(jù)并使用FlowJo(Tree Star)分析。

IL-2受體內(nèi)化實(shí)驗(yàn)

將IL-2、H9、H9-RET或H9RETR(1μM)與96孔板中的3x10⁵個(gè)YT-1細(xì)胞孵育2、5、10、15、30、60、90、120、180或240分鐘。將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到冰上以防止進(jìn)一步的受體內(nèi)化，并用冰冷的PBSA緩沖液(PBS中的0.1％BSA)洗滌兩次。在冰上用PBSA緩沖液中的別藻藍(lán)蛋白-綴合的抗人IL-2Rβ抗體(TU27；Biolegend)和藻紅蛋白-綴合的抗人IL-2Rγ抗體(TUGh4；Biolegend)的1：50稀釋液同時(shí)染色細(xì)胞30分鐘。在冰冷的PBSA緩沖液中再洗滌兩次后，將細(xì)胞在室溫下用在PBSA中的1.5％多聚甲醛固定10分鐘，最后洗滌一次，并重懸于PBSA緩沖液中。用Accuri C6流式細(xì)胞儀定量平均細(xì)胞熒光。用Prism軟件包(GraphPad)使用非線性最小二乘方回歸將內(nèi)化數(shù)據(jù)擬合成單指數(shù)衰減模型。

對IL-2誘導(dǎo)的pSTAT5的抑制

在缺乏或存在H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2刺激新鮮分離的和預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞，并評估pSTAT5水平。將細(xì)胞與或不與抗-Tac或Mikβ1或Fc4-H9-RETR孵育1小時(shí)，然后用一系列劑量的IL-2或IL-15刺激30分鐘，并通過流式細(xì)胞術(shù)測量pSTAT5水平。對于NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在存在或缺乏指定的IL-2變體的情況下用IL-15的連續(xù)稀釋液刺激新鮮分離的人NK細(xì)胞(NK細(xì)胞分離試劑盒II，Miltenyi Biotech)，并評估pSTAT5。

蛋白質(zhì)印跡分析

在含有1％IGEPAL CA-630(Sigma)的RIPA緩沖液中裂解用或不用細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞。在4至12％Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上解析等量的裂解物，轉(zhuǎn)移至膜，并且將膜與針對pSTAT5(Y694)(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)或STAT5(BD Transduction Laboratories，San Diego，CA)的抗體在室溫下孵育1小時(shí)。用山羊抗兔IgG(H+L)-HRP綴合物(1：5,000稀釋)和用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP綴合物(1：10,000稀釋)(Biorad)檢測結(jié)合的抗體。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL，GE healthcare)顯現(xiàn)免疫印跡。在一些實(shí)驗(yàn)中，在室溫下在剝離緩沖液(Millipore)中孵育15分鐘后再使用膜。

CFSE稀釋和EdU增殖測定

在室溫下用PBS中的2.5μM CFSE(Molecular Probes)將新鮮分離或預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞(20x 10⁶/ml)標(biāo)記7分鐘，并立即用100％FBS(2ml/樣品)洗滌一次，然后在完全RMPI中洗滌兩次。在缺乏或存在野生型IL-2、H9、H9-RET、H9-RETR或IL-2+H9-RETR的情況下培養(yǎng)2x10⁶/ml經(jīng)CFSE標(biāo)記的細(xì)胞。通過在指定時(shí)間點(diǎn)的CFSE稀釋的流式細(xì)胞術(shù)分析來評估細(xì)胞增殖。對于EdU增殖測定，如上所述培養(yǎng)預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞。在收獲前16小時(shí)，添加10mM EdU，如指示對細(xì)胞進(jìn)行表面抗原染色，然后根據(jù)制造商的方案(BD Biosciences)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)EdU染色。通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞增殖。

ED40515細(xì)胞和來自患有郁積型ATL的患者的細(xì)胞的增殖

用PBS洗滌IL-2-依賴性ED40515(+)(Lenardo，Nature 353：858(1991))細(xì)胞兩次。將細(xì)胞以1x10⁴個(gè)細(xì)胞/100μl/孔的具有或沒有IL-2和具有或沒有試劑的RPMI 1640培養(yǎng)基接種到96孔板中，然后在37℃下孵育3天。

來自ATL患者的血液樣品在Clinical Trials Team，Lymphoid Malignancies Branch，NCI，NIH的護(hù)理下獲得。本研究方案由美國國家癌癥研究所的機(jī)構(gòu)審查委員會(Institutional Review Board of National Cancer Institute)批準(zhǔn)。根據(jù)赫爾辛基宣言獲得知情同意。來自ATL患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心從它們的肝素化血液中分離。將1x10⁵個(gè)細(xì)胞/100μl/孔的等分試樣在補(bǔ)充有10％FBS且具有或沒有試劑的RPMI 1640培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)6天。

在培養(yǎng)的最后6小時(shí)期間，用1μCi(0.037MBq)[³H]胸苷脈沖ED40515(+)細(xì)胞或ATL PBMC，然后用細(xì)胞收獲器(Tomtec，Hamden，CT)收獲細(xì)胞，用MicroBeta2微板計(jì)數(shù)器(PerkEmer)計(jì)數(shù)。該測定一式三份進(jìn)行。

NK細(xì)胞的活化

將外周血單核細(xì)胞(PBMC)在1μg/mL IL-2類似物存在下培養(yǎng)24小時(shí)。然后用APC-綴合的抗-CD56(BD Biosciences)、Pacific Blue-綴合的抗-CD3(BioLegend)和FITC-綴合的抗-CD69(BD Biosciences)對細(xì)胞染色。使用FACSAria II(BD Biosciences)通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。NK細(xì)胞門控為CD3陰性，CD56陽性。

使用Ficoll-Paque Premium(GE Life Sciences)通過梯度離心分離PBMC，然后使用人類NK細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi)純化未接觸的NK細(xì)胞，隨后使用autoMACS(Miltenyi)分離。每1x10⁶個(gè)細(xì)胞用150μCi ⁵¹Cr(Perkin Elmer)標(biāo)記HER18靶細(xì)胞2小時(shí)。將NK細(xì)胞以10∶1效應(yīng)子：靶物比率添加到10,000個(gè)HER18細(xì)胞。在不同濃度的IL-2類似物存在下培養(yǎng)4小時(shí)后測定特異性裂解。

通過原代NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的裂解如描述進(jìn)行(Yuan等人，Immunol Rev 259，103(2014))。簡言之，使用人NK分離試劑盒(STEMCELL)純化未接觸的人NK細(xì)胞。用PKH67綠色熒光細(xì)胞接頭試劑盒(SigmaAldrich)標(biāo)記K562細(xì)胞，將NK細(xì)胞以10∶1比率添加到5,000個(gè)K562細(xì)胞，在不同濃度的IL-2類似物存在下在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)，并置于冰上以防止進(jìn)一步的反應(yīng)性。然后用碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich)對細(xì)胞染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)測定PI⁺PKH67⁺K562細(xì)胞的百分比。

T輔助極化和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色

在缺乏或存在指定的細(xì)胞因子的情況下，在不同的T輔助極化條件下分化首次接觸實(shí)驗(yàn)的CD4⁺C57BL/6T細(xì)胞。4天后，首先針對如指定的表面抗原對細(xì)胞染色，然后用在BD細(xì)胞固定(cytofix)和細(xì)胞透化(cytoperm)中的針對IFNγ(eBioscience)，IL-17A(eBioscience)、IL-4(BioLegend)、IL-9(BioLegend)或FoxP3(eBioscience)的抗體，或eBioscience FoxP3染色緩沖液試劑盒，根據(jù)制造商的方案染色細(xì)胞。使用FlowJo軟件(Tree Star，Inc)在FACSCanto II流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)上分析染色的細(xì)胞。所有小鼠細(xì)胞因子來自Peprotech。

RNA-Seq分析

將預(yù)活化的人CD8⁺T細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中靜置兩天，用1μg/ml野生型IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR刺激24小時(shí)，并且分離來自5x10⁶個(gè)細(xì)胞的總RNA(RNeasy試劑盒，Qiagen，Valencia，CA)。匯集來自5個(gè)供體的RNA，并使用1μg匯集的RNA合成cDNA。如先前所述(Liao等人，Immunity 38：13(2013)，制備RNA-seq文庫。使用Illuminna HiSeq2000平臺對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行條形碼化并測序。使用Bowtie 0.12.4(Leonard，Nature Reviews.Immunology1：200(2001))將測序讀段與人類基因組(hg18，NCBI版本36.1)比對。保留獨(dú)特定位的讀段，并且使用RPKM(每百萬定位讀段每千堿基的讀段)計(jì)算基因的數(shù)字表達(dá)水平。使用R包edgeR鑒定差異表達(dá)的基因，并且在未處理或用IL-2變體處理24小時(shí)的細(xì)胞之間比較倍數(shù)變化(以log2標(biāo)度)差異。

ChIP-Seq文庫制備和分析

將預(yù)活化的CD8⁺T細(xì)胞用不同的細(xì)胞因子處理90分鐘，然后用1％多聚甲醛化學(xué)交聯(lián)。將來自1-2千萬個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)超聲處理成250-500bp的片段，用抗-STAT5B(Invitrogen)免疫沉淀，并且處理以進(jìn)行測序，如先前所述(Noguchi等，Cell 73：147(1993))。使用Bowtie 0.12.4(Leonard，Nature Reviews.Immunology 1：200(2001))將所有讀段與人類基因組(hg18，NCBI版本36.1)比對。將獨(dú)特定位的讀段轉(zhuǎn)換為瀏覽器可擴(kuò)展數(shù)據(jù)(BED)文件，并且過濾重復(fù)讀段(相同基因組位置中的多個(gè)讀段)。然后，將過濾的(非冗余的)BED文件轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制數(shù)據(jù)(binary tiled data)(.tdf)，并使用Integrative Genome Viewer(Broad Institute)可視化。

通過RT-PCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析

使用RNeasy Plus微型試劑盒(Qiagen)分離總RNA，并且與寡聚物dT(Invitrogen)和Omniscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Quiagen)一起使用200ng以合成cDNA。使用ABI 7900HD序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量RT-PCR。RT引物和探針來自Applied Biosystems。相對于RPL7歸一化表達(dá)水平。

對同種異體宿主的骨髓移植

將來自NCI-Frederick癌癥研究室(Cancer Research Facility)的7周齡雌性C57BL/6(H₂K^b)和BALB/c(H₂K^d)小鼠維持在無特定病原體的設(shè)施中，并根據(jù)由NCI動(dòng)物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)的批準(zhǔn)動(dòng)物方案處理。用950cGy全身輻照條件化BALB/c小鼠，然后用單獨(dú)的或與200萬個(gè)經(jīng)Treg消耗的泛-T細(xì)胞一起的來自C57BL/6小鼠的1000萬個(gè)T細(xì)胞消耗的骨髓細(xì)胞重建。使用來自Miltenyi Biotec的試劑盒，用抗CD90[Thy1.2]微珠(總T細(xì)胞消耗)或抗CD25(Treg消耗)進(jìn)行T細(xì)胞消耗。另外，用Fc4或H9-RETR-Fc4(100μg i.p.兩次/天，持續(xù)10天)處理接受泛-T細(xì)胞的小鼠。全身輻照后，飲用水從第-1天至第+14天補(bǔ)充環(huán)丙沙星。監(jiān)測存活和體重減輕。根據(jù)Kaplan-Meier法分析存活，并使用對數(shù)秩檢驗(yàn)比較存活曲線。使用GraphPad Prism 4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

其它實(shí)施方案

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)描述進(jìn)行了描述，但是前面描述旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，其由所附權(quán)利要求書的范圍限定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。例如，盡管在整個(gè)說明書中提及IL-2，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文中所述的方法和組合物同樣適用于具有此特性的其它細(xì)胞因子，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6或IL-15。因此，本發(fā)明還包括與野生型相比對其各自的受體具有增加的結(jié)合親和力的GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6和IL-15的突變體，以及用于鑒定和使用那些突變體的方法。