專利名稱：三聚IL-1Ra的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由白介素1介導(dǎo)的疾病的治療。更具體地，本發(fā)明涉及可用于治療這 些疾病的白介素1受體拮抗劑(IL-IRa)。
背景技術(shù)：
IL-I家族是先天免疫系統(tǒng)的重要部分，其是適應(yīng)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑。局部組織中 IL-I和IL-IRa之間的平衡影響炎癥性疾病可能的發(fā)展，并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損傷。在存在過(guò)量IL-I 時(shí)，炎癥性和自免疫疾病可以在關(guān)節(jié)、肺、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或血管中發(fā)展。已經(jīng) 通過(guò)注射重組IL-IRa或通過(guò)基因療法途徑用IL-IRa進(jìn)行人類疾病的治療。已經(jīng)證明用重 組IL-IRa可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，并且正在進(jìn)行對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎(OA)的二期研究。過(guò)去的10年間，已經(jīng)描述了 IL-I在很多人類疾病中重要的促炎作用。已經(jīng)在多 種動(dòng)物疾病模型中深入研究了 IL-I和IL-IRa之間的平衡，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān) 節(jié)炎(OA)、炎癥性腸病(IBD)、肉芽腫和纖維化肺疾病、腎疾病、肝臟和胰臟疾病、移植物抗 宿主疾病(GVHD)、白血病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染性疾病和動(dòng) 脈疾病。在每種疾病中，局部過(guò)量產(chǎn)生IL-I和/或過(guò)少產(chǎn)生IL-IRa使受試對(duì)象容易患上 疾病。IL-IRa的治療已經(jīng)表明可有效預(yù)防組織損失(參見(jiàn)W.P.ArencbCytokine & Growth Factor Reviews,13(2002)pp. 323—240)。IL-I家族由下述組成兩種激動(dòng)劑，IL-I α和IL-I β ；特異性受體拮抗劑 IL-IRa ；和三種不同的受體，I 型 IL-IR(IL-IRI)、II 型 IL-IR(IL-IRII)和 IL-1 受體輔 助蛋白(IL-IRAcP)。IL-IRl是包括215個(gè)殘基的長(zhǎng)胞質(zhì)域的SOkDa蛋白質(zhì)。生物惰性的 IL-IRII是包括29個(gè)殘基的短胞質(zhì)域的60kDa蛋白質(zhì)。在將IL-I α或IL-I β結(jié)合至單鏈 IL-IRl后，將IL-IR AcP募集至復(fù)合物。由接近的IL-IRl和IL-IR AcP的胞質(zhì)域活化的信 號(hào)傳導(dǎo)通路包括NF- κ B、JNK/AP-1和ρ38ΜΑΡ激酶途徑。IL-IRII作為誘殺受體，在質(zhì)膜上 結(jié)合IL-1，并且作為流體相中的可溶受體，從而防止IL-I與具有功能的IL-IRI相互作用。IL-I家族中的第三種配體，IL-IRa,是IL-I的結(jié)構(gòu)變體，其可結(jié)合IL-1R，但是不 能活化細(xì)胞。IL-IRa是與IL-I α有18%氨基酸同源性并與IL_1 β有26%同源性的17kDa 蛋白質(zhì)。IL-IRa最早描述的同工型分泌自單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性細(xì)胞和其它細(xì)胞，并 且現(xiàn)在稱為sIL-IRa。至今為止已經(jīng)描述了 IL-IRa的三個(gè)其它細(xì)胞內(nèi)同工型。IL-IRa的 ISkDa型，由可選的轉(zhuǎn)錄拼接機(jī)制從上游外顯子產(chǎn)生，稱為icIL-lRal，并且在角化細(xì)胞和 其它上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)?？寺∽匀税籽?的IL-IRa cDNA包含額外的63bp序列，作為cDNA的5，區(qū)域的插入序列。在單核細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞、中性細(xì)胞和肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 IL-IRa的15kDa同工型，稱為icIL_lRa3，并且其可以通過(guò)可選的轉(zhuǎn)錄拼接以及通過(guò)可選的翻譯起始而產(chǎn)生?？扇艿腎L-IRa和icIL_lRal同樣很好地與IL-1R結(jié)合，但是icIL_lRa3表現(xiàn)出弱 的受體結(jié)合。IL-IRa通過(guò)結(jié)合IL-IRl但是防止IL-IR AcP與IL-IRI關(guān)聯(lián)而作為特異性的 受體拮抗劑，其導(dǎo)致不能啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)通路。誘殺受體IL-IRII結(jié)合質(zhì)膜上并作為流體相中可溶受體的IL-1，防止IL-I與具有 功能的IL-IRI相互作用。因此，可溶的IL-IRII和IL-IRa能共同抑制IL-I。可溶的IL-Rl 能與IL-I以及IL-IRa結(jié)合，但是由于IL-I和IL-IRa之間的平衡，可溶的IL-IRI似乎作 為促炎劑而作用。KINERET .是來(lái)自Amgen的由大腸桿菌產(chǎn)生的IL_lRa，其已經(jīng)表明對(duì)于活動(dòng)性風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎的患者有益。KINERET 需皮下注射，一日一次。皮下給藥時(shí)，KINERET‘ 的半衰期 從4至6小時(shí)；對(duì)于i. v.給藥，半衰期約為2. 5小時(shí)。通過(guò)腎清除而清除IL-IRa。KINERET 是IL-I的特異性受體拮抗劑，其通過(guò)存在的甲硫氨酸基團(tuán)與天然發(fā)生的IL-I受體拮抗劑 相區(qū)別。在單獨(dú)使用或與甲氨蝶呤組合使用時(shí)，由于臨床征兆和癥狀的改善、放射學(xué)進(jìn)展的 減緩和患者功能、疼痛與疲勞的改善，KINERET 已經(jīng)表明對(duì)于患者有益。如臨床試驗(yàn)所證 明的，KINERET⑧具有相當(dāng)安全的特性。已經(jīng)進(jìn)行了幾種嘗試來(lái)改善IL-IRa較差的藥物動(dòng)力學(xué)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了僅靶向 IL-I β的抗體。然而，與IL-Ira相反，這些只阻斷IL-I β，但是不能阻斷IL-I α的作用。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了本領(lǐng)域中對(duì)于傳遞ILl-Ra的改善方法的需要，所述方法可 提供分子更長(zhǎng)的半衰期，并提供相當(dāng)安全的特性。


圖1表示四連蛋白家族的三聚結(jié)構(gòu)元件的氨基酸序列比對(duì)。對(duì)應(yīng)于殘基V17至 Κ52的氨基酸序列(單字母編碼)包含外顯子2和人四連蛋白的外顯子3的第一個(gè)三殘基 (SEQ ID NO 59)；鼠科動(dòng)物四連蛋白(SEQ ID NO 60)；分離自礁鯊軟骨的四連蛋白同源蛋 白質(zhì)(SEQ IDNO 61)和分離自牛軟骨的四連蛋白同源蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :62)。七重復(fù)序 列中a和d位置的殘基用黑體列出。列出的四連蛋白家族三聚結(jié)構(gòu)元件的保守序列包括七 重復(fù)序列中a和d位置的殘基，除了區(qū)域中其它保守殘基之外，圖中還表示出所述七重復(fù)序 列?！癶y”表示脂肪族疏水殘基。圖2表示通過(guò)透析重折疊CII-H6-GrB-TripK-IL-lRa的結(jié)果。圖 3 顯示在 NiNTA 上捕捉 CII-H6-GrB-TripK-IL_lRa。圖 4 是表示 GG-TripV-IL-IRa (trip V-IL-IRa)、GG-TripK-IL-IRa (trip K-IL-IRa) ,GG-TripT-IL-IRa (trip T-IL-lRa)和 GG-TripT-IL-lRa (trip T-IL-lRa)抑制 U937細(xì)胞中IL8的IL-I誘導(dǎo)的能力的圖。圖5是表示與非聚乙二醇形式和KINERET⑧相比，聚乙二醇TripT和TripV抑制 U937細(xì)胞中IL-8的IL-I誘導(dǎo)能力的圖。圖 6 是表示 PK 研究中使用的 TripT-IL-IRa、IlO-TripT-IL-IRa 和 V17-TripT-IL-lRa抑制U937細(xì)胞中IL-8的IL-1誘導(dǎo)的能力的圖。圖 7 是表示在大鼠中 i. v.注射 100mg/kg 后 TripT-IL-IRa、IIO-TripT-IL-IRa 和 V17-TripT-IL-lRa的血濃度的圖。
圖 8 表示對(duì)于多批次 Met-I IO-TrpT-IL-IRa (LM022 和 LM023)和 GG-V17-TrpT-IL-1 Ra(CF019 和 CF020)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的 SDS-PAGE 分析。圖 9 表示 Met-IlO-TrpT-IL-IRa 和 GG_V17-TrpT-IL_lRa 蛋白質(zhì)產(chǎn)量的分析 SEC結(jié)果。圖10表示大鼠CIA研究的結(jié)果。在用載體(IOmM磷酸緩沖液pH7. 4)處理，或 施用等摩爾數(shù)量的IL-Ira(或者是單聚IL-Ira(100mg/kg KINERET )，或者是三聚IL lra(120mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra，或 120mg/kg GG-V17_TripT_IL Ira))之后，測(cè)量患 有II類膠原關(guān)節(jié)炎的雌性Lewis大鼠的腳踝直徑。圖11表示與用載體處理的疾病對(duì)照動(dòng)物相比，用KINERET 、 Met-IlO-TripT-ILlra QD或GG-V17-TripT_ILlra QD治療的大鼠最終的爪重量降低的研允。
(K)圖12表示在每天i. p.施用I IO-TripT-ILl-Ra或KINERET'后觀察到的血液葡萄 糖水平的降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供包含三聚域和可抑制IL-I活性的IL-IRa多肽序列的融合蛋白。在一 個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包括IL-IRa序列，其包含可抑制IL-I活性的SEQ ID NO 38的變 體或片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包括與SEQ ID NO :38至少85%相同的IL-IRa 多肽序列。融合蛋白可以包括聚乙二醇。融合蛋白的三聚域可以源自四連蛋白。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的三個(gè)融合蛋白的三聚復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，三 聚復(fù)合物包括三聚域，其為四連蛋白三聚結(jié)構(gòu)元件(TTSE)。在一個(gè)實(shí)施方案中，三聚復(fù)合物 包括與SEQ ID NO 1至少66%相同的三聚域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，三聚復(fù)合物包括至少 一個(gè)選自下組的融合蛋白TripK-IL-Ira (SEQ ID NO 39) ；TripV-IL-Ira (SEQ IDNO 40)； TripT-IL-Ira(SEQ ID NO 41) ；TripQ-IL-Ira (SEQ ID NO 42) ；110-TripK-IL-lra(SEQ ID N0:43) ；I10-TripV-IL-lra(SEQ ID NO :44) ； 110-TripT-IL-lra(SEQ ID NO: 45) ；I10-TripQ-IL-lra(SEQ ID NO :46) ;V17_TripT_ILlRa (SEQ ID NO 55)； V17-TripK-IL-lRa (SEQ ID NO :56) ;Vl7_TripV_IL-1RA (SEQ ID NO 57)禾口 V17-TripQ-ILlRA(SEQ IDNO 58)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三聚體和至少一個(gè)可藥用的賦形劑的藥 物組合物。甚至更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及治療由白介素1介導(dǎo)的疾病的方法。所述方法包括 對(duì)有需要的患者施用本發(fā)明的藥物組合物。疾病可以是炎癥性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿 病。方法還包括對(duì)患者同時(shí)或順序施用抗炎劑。本發(fā)明還提供融合蛋白，其進(jìn)一步包括與融合蛋白共價(jià)連接的抗炎劑。本發(fā)明的這些和其它方面在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及用于治療由IL-I介導(dǎo)的疾病的化合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉 及IL-IRa多肽序列與三聚或多聚域融合而成的融合蛋白。三個(gè)或更多的融合蛋白可以三聚或多聚，從而提供比單獨(dú)的IL-IRa穩(wěn)定性更強(qiáng)、藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)更好的組合物，并且提 供相當(dāng)安全的特性。在其他方面，本發(fā)明提供核酸，其編碼任一個(gè)上述多肽，以及在允許特異性表達(dá)和 回收的條件下制備這些多肽的方法。本發(fā)明的多肽可以能夠用于制備藥物組合物，所述藥物組合物用于治療具有由 IL-I介導(dǎo)的病理學(xué)的受試對(duì)象，比如通過(guò)對(duì)受試對(duì)象施用有效量的藥物組合物而治療炎癥 性疾病的方法。如本文所使用的，如果自發(fā)或?qū)嶒?yàn)疾病或身體狀況與體液或組織中IL-I水平升 高有關(guān)，或者取自身體的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的IL-I水平升高，則認(rèn)為疾病或身體 狀況是“白介素-1介導(dǎo)疾病”或“由白介素-1介導(dǎo)的疾病”。在很多情況下，這些白介素-ι 介導(dǎo)的疾病還通過(guò)下述另外兩個(gè)條件識(shí)別(1)與疾病或身體狀況相關(guān)的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)能通 過(guò)施用IL-I而在動(dòng)物中通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M；和(2)在疾病或身體狀況的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中誘導(dǎo)的 病理學(xué)能通過(guò)用可抑制IL-I作用的藥劑治療而抑制或消除。在大多數(shù)IL-I介導(dǎo)的疾病中， 至少符合三個(gè)條件中的兩個(gè)，并且在很多IL-I介導(dǎo)的疾病中，符合全部三個(gè)條件。急性和 慢性IL-I介導(dǎo)的炎癥性疾病的非獨(dú)占性列表包括但不限于下述痛風(fēng)；急性胰腺炎；ALS ； 老年癡呆癥；惡病質(zhì)/厭食；哮喘；動(dòng)脈硬化；急性疲勞綜合癥；發(fā)燒；糖尿病(例如，胰島 素糖尿病)；血管球性腎炎；移植物抗宿主排斥；出血性休克；痛覺(jué)過(guò)敏、炎性腸道疾病 ’關(guān) 節(jié)炎癥，包括骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、幼年型關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；缺血性損傷，包括腦 缺血(例如，外傷、癲癇、出血或中風(fēng)引起的腦部損傷，均可引起神經(jīng)退行性疾病)；肺部疾 病(例如，ARDS)；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性硬化；骨髓性(例如，AML和CML)和其它白血?。患?肉疾病(例如，肌蛋白代謝，特別是敗血癥)；骨質(zhì)疏松癥；帕金森?。惶弁?；早產(chǎn)；牛皮癬； 再灌注損傷；感染性休克；放射療法的副作用、暫時(shí)顎關(guān)節(jié)疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移；或者由于拉傷、 扭傷、軟骨損傷、外傷、矯形外科、感染或其它疾病過(guò)程和與cryopyrin相關(guān)的周期綜合癥， 包括Muckle-WelIs綜合征、家族感冒自發(fā)炎癥綜合征和新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“多聚域”表示包含功能性(functionality)的氨基酸序 列，所述功能性可以與兩個(gè)或多個(gè)其它氨基酸序列關(guān)聯(lián)，形成三聚或其它多聚復(fù)合物。在一 個(gè)實(shí)例中，融合蛋白包含氨基酸序列-三聚域-其與兩個(gè)其它三聚域形成三聚復(fù)合物。三 聚域能與相同氨基酸序列的其它三聚域(同三聚體)，或不同氨基酸序列的三聚域(異三 聚體)關(guān)聯(lián)。這種相互作用可以由三聚域組分之間的共價(jià)鍵以及通過(guò)氫鍵力、疏水力、范德 華力和鹽橋而引起。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，多聚域是二聚域、三聚域、四聚域、五聚域 等。這些域能形成本發(fā)明的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或多個(gè)融合蛋白的多肽復(fù)合物。本發(fā)明的融合蛋白的三聚域可以來(lái)自如美國(guó)專利申請(qǐng)No. 2007/0154901 ( ‘901申 請(qǐng))所述的四連蛋白，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部并入本文。本文以SEQ ID N0:63提供全長(zhǎng)人 四連蛋白多肽序列。四連蛋白三聚域的實(shí)例包括氨基酸SEQ ID NO :63的17至49、17至 50、17至51和17-52，其代表由人四連蛋白基因的外顯子2編碼的氨基酸，和可選地由所述 基因的外顯子3編碼的第一個(gè)單、雙或三氨基酸。其它實(shí)例包括氨基酸1至49，1至50，1 至51和1至52，其代表全部的外顯子1和2，和可選地由所述基于的外顯子3編碼的第一 個(gè)單、雙或三氨基酸。或者，三聚域中包括外顯子1編碼的部分氨基酸序列。具體地，三聚 域的 N 末端可以在 SEQ ID NO 63 的殘基 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 和17中的任何一個(gè)開(kāi)始。在具體的實(shí)施方案中，N末端是IlO或V17，并且C末端是Q47、T48、 V49、C(S)50、L51 或 K52(根據(jù) SEQ ID NO :63 編號(hào))。在本發(fā)明的一個(gè)方面，三聚域是包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的四連蛋白 三聚結(jié)構(gòu)元件(“TTSE”)，所述序列是四連蛋白家族三聚結(jié)構(gòu)元件的保守性序列，如US 2007/00154901中更加完整地描述的。如圖1所示，TTSE包含蛋白質(zhì)的四連蛋白家族中天然 發(fā)生的成員的變體，并且具體為已經(jīng)在氨基酸序列中進(jìn)行修飾的變體，其實(shí)質(zhì)上未對(duì)TTSE 形成α螺旋卷軸螺旋三聚體的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。在本發(fā)明的各個(gè)方面中，根據(jù)本發(fā)明的 三聚多肽包括作為三聚域的TTSE，其與SEQ IDNO 1的保守性序列具有至少66%的氨基酸 序列同一性；例如與SEQ IDNO 1的保守性序列具有至少73%，至少80%，至少86%或至少 92%的序列同一性(僅計(jì)算確定(而不是Xaa)的殘基)。即，SEQ ID NO=I中確定氨基酸 的至少一個(gè)，至少兩個(gè)，至少三個(gè)，至少四個(gè)，或者至少五個(gè)可以被取代。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，SEQ ID NO 63的位置50的半胱氨酸(C50)可以有利 地突變成絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸殘基，以避免形成不理想的鏈間二硫 橋，所述鏈間二硫橋能導(dǎo)致不理想的多聚合。其它已知的變體包括選自氨基酸殘基6、21、 22、24、25、27、28、31、32、35、39、41 和 42(根據(jù) SEQ ID NO :63 編號(hào))的至少一個(gè)氨基酸殘 基，其可由任何非螺旋斷裂氨基酸殘基取代。這些殘基已經(jīng)表現(xiàn)出不直接參與分子間的相 互作用，所述作用可穩(wěn)定天然四連蛋白單體的TTSE之間的三聚復(fù)合物。在圖1所示的一個(gè) 方面，TTSE包括重復(fù)的七殘基，其式為a-b-C-d-e-f-g(N至C)，其中殘基a和d(即，位置 26、33、37、40、44、47和51)可以是任何疏水氨基酸(根據(jù)權(quán)利要求63編號(hào))。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，TTSE三聚域可以通過(guò)摻入聚組氨酸序列和/或蛋白酶分 解位點(diǎn)如血凝因子X(jué)a或顆粒酶B (參見(jiàn)US2005/0199251，其通過(guò)引用并入本文)，并且包括 C末端KG或KGS序列而進(jìn)行修飾。此外，為了幫助純化，位置2的脯氨酸可以用甘氨酸取代 以幫助純化。TTSE截短和變體的具體非限定性實(shí)例如下面的表1所示。表 1 US 6，190，886(全部并入本文)中公開(kāi)了三聚域的另一個(gè)實(shí)例，其描述了包括膠 原凝集素頸區(qū)的多肽。然后可以在合適的條件下，用包含膠原凝集素頸區(qū)氨基酸序列的三 個(gè)多肽產(chǎn)生三聚物。三聚域的另一個(gè)實(shí)例是MBP三聚域，如本發(fā)明的代理人于2007年9月7日提交的 美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/996，288中所述，其通過(guò)引用全部并入本文。這個(gè)三聚域甚至能 進(jìn)一步低聚，并產(chǎn)生更高階的多聚復(fù)合物。本發(fā)明的IL-IRa多肽可以連接至三聚域的N或C末端氨基酸殘基?？蛇x地，可 以在代表IL-IRa的多肽和三聚域之間，并且共價(jià)連接，放置靈活的分子接頭(linker)。優(yōu) 選地，接頭是約1至20，2至10，或3至7個(gè)氨基酸殘基的多肽序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，接頭是不產(chǎn)生免疫性的，不易由蛋白水解作用分解，并且不包含已知可與其它殘基相互 作用的氨基酸殘基(例如半胱氨酸殘基)。如本文所使用的，“IL-IRa”指包含如下所示的氨基酸序列的多肽RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAAC
PGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE(SEQ ID NO 38)“IL-IRa”定義中還包括SEQ ID NO :38的變體和片段，其可提供與IL-1R的IL-IRa結(jié)合，并且優(yōu)選提供IL-IR抑制活性。與全長(zhǎng)天然IL-IRa蛋白質(zhì)相比，這些片段可以在 IL-IRa的N末端或C末端截短，或者可以缺少內(nèi)部殘基。某些片段可以缺少根據(jù)本發(fā)明對(duì) 于三聚IL-IRa蛋白質(zhì)的理想生物活性不是必需的氨基酸殘基。例如，Evans等人(J.Biol. Chem. 1995，19 11477-11483)通過(guò)定點(diǎn)突變證明只有Trpl6、Gln20、Tyr34、Gln36和Tyrl47 對(duì)于與IL-IR的結(jié)合是關(guān)鍵的，并且其它氨基酸位置可以改變，同時(shí)仍能保持功能性分子。 此外，如Dahlen等人所示(J. Immunotoxicology 5 189-199 (2008))，通過(guò)將結(jié)合區(qū)域之外 的氨基酸突變，增加IL-IRa預(yù)期受體的環(huán)狀相互作用，可以改善IL-IRa與其受體之間的親 和性。這可以通過(guò)突變IL-IRa受體結(jié)合區(qū)域之外的氨基酸而完成，并且特別地，例如突變 D47N、E52R、E90Y、P38Y、H54R、Q129L 和 M136N。同上。此外，存在天然的 IL-IRa 變體，可以 使用任何這類變體。將IL-IRa的ISkDa形式稱作icIL_lRal，其通過(guò)來(lái)自上游外顯子的另 一種轉(zhuǎn)錄拼接機(jī)制產(chǎn)生，并且發(fā)現(xiàn)存在于角化細(xì)胞和其它上皮細(xì)胞中。由人白血球克隆的 IL-IRa cDNA包含額外的63bp作為cDNA的5，區(qū)域中的插入序列。在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 中性細(xì)胞和肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了名為icIL-lRa3的IL-IRa的15kDa同工型，并且其可以通過(guò)另 一種轉(zhuǎn)錄拼接以及可選的翻譯起始產(chǎn)生?？捎米鞅景l(fā)明的融合蛋白的IL-IRa肽包括與SEQ ID NO :38至少65%、至少70%、 至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90%或者至少95 %相同的多肽。在具體的實(shí)施方 案中，融合蛋白包括與SEQ ID NO :3885%相同，并且具有IL-IR結(jié)合活性，和優(yōu)選地具有 IL-IRa抑制活性的IL-IRa肽序列。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，融合蛋白包括與SEQID NO :3890%相同，并且具有IL-IR結(jié)合活性，和優(yōu)選地具有IL-IRa抑制活性的IL-IRa肽序 列。在這些實(shí)施方案中，多肽包含Trp 16, Gln20、Tyr34、Gln36和Tyrl47，所述編號(hào)根據(jù) SEQ ID N0:38的編號(hào)。這些多肽可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代D47N、E52R、E90Y、 P38Y、H54R、Q129L和M136N(根據(jù)SEQ ID NO :38編號(hào))。此外，IL-IRa多肽的變體可以通 過(guò)用具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸例如保守氨基酸取 代而完成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白選自IL-I受體拮抗劑，其選自下 述TripK-IL-IraEGPTQKPKKIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQ A L Q T V S L K RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGY LQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETR LQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFL CTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 39)；TripY-IL-IraEGPTQKPKKIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQAL QTV RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQG PNVNLEEKIDVVPEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQL EAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTA MEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 40)；TripT-IL-IraEGPTQKPKKIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQAL Q T RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLE AVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTA MEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 41)TRipQ-IL-IraMVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEGGSHHH HHHG S IEPDGGEGPTQKPKK I VNAKKDVVNTKMFEELK S RLDTLAQEVALLKEQQAL q_RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQ
GPNVNLEEKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQ LEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCT AMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 42)IlO-TripK-ILlraIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEYALLKEQQALQTYSLK H PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLE EKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNIT DLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQ PVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO :43)；I IO-Tr ipV-IL-lralVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTV RPSH RKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKI DVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVS LTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO :44)；IlO-TripT-IL-IraIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQT RPSGR KSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKID WPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSE NRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSL TNMPDEGVMVTKFYFQEDE (seq ID NO :45)；IlO-TripQ-IL-IraIYNAKKDYYNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQ RPSGRK SSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDV VPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSEN RKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLT NMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 46)；其中標(biāo)下劃線的部分表示三聚單元，并且黑體部分表示IL-IRa部分。融合蛋白的產(chǎn)生本發(fā)明的三聚IL-IRa可以化學(xué)合成或在任何合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。 優(yōu)選地，蛋白表達(dá)系統(tǒng)是易于從中分離期望蛋白并體外重折疊的系統(tǒng)。優(yōu)選原核表達(dá)系統(tǒng)， 因?yàn)榭梢垣@得較高的蛋白產(chǎn)量，并且具備有效的純化和重折疊策略。也可以使用真核表達(dá) 系統(tǒng)。因此，技術(shù)人員能判斷如何選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。相似地，一旦選擇了本發(fā)明融合蛋 白的一級(jí)氨基酸序列，考慮這些因素如所選宿主中的密碼子偏好性，宿主中分泌信號(hào)序列 的需要，信號(hào)序列中蛋白酶分解位點(diǎn)的引入等，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能輕松地設(shè)計(jì)合適的編碼期望蛋白的重組DNA構(gòu)建體?？梢詫⑦@些重組DNA構(gòu)建體框內(nèi)插入任何數(shù)量的對(duì)所 選宿主合適的表達(dá)載體中。優(yōu)選地，表達(dá)載體將包括強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)重組構(gòu)建體的表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)在使融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用編碼融合蛋白的 載體轉(zhuǎn)化的宿主，在任何合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。優(yōu)選地，表達(dá)系統(tǒng)是是易于從中 分離期望蛋白并體外重折疊的系統(tǒng)。通常地，優(yōu)選原核表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)榭梢垣@得較高的蛋白 產(chǎn)量，并且具備有效的純化和重折疊策略。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能選擇合適的表達(dá)系統(tǒng) (包括載體和細(xì)胞類型)。相似地，一旦選擇了本發(fā)明融合蛋白的一級(jí)氨基酸序列，考慮這 些因素如所選宿主中的密碼子偏好性，宿主中分泌信號(hào)序列的需要，信號(hào)序列中蛋白酶分 解位點(diǎn)的引入等，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能輕松地設(shè)計(jì)合適的編碼期望蛋白的重組DNA構(gòu) 建體?？梢詫⑦@些重組DNA構(gòu)建體框內(nèi)插入任何數(shù)量的對(duì)所選宿主合適的表達(dá)載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多核苷酸編碼本發(fā)明的融合蛋白。在其它實(shí)施方案中， IL-IRa多肽和三聚域由不連續(xù)的多核苷酸序列編碼。因此，在一些實(shí)施方案中，分別表達(dá)、 分離并純化IL-IRa多肽，并融合在一起形成本發(fā)明的融合蛋白。這些重組DNA構(gòu)建體可以框內(nèi)插入任何對(duì)于所選宿主合適的多個(gè)表達(dá)載體中。在 某些實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)包含控制重組融合蛋白構(gòu)建體表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。當(dāng)使用重組表 達(dá)策略產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白時(shí)，可以使用本領(lǐng)域公知的合適的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程分離并純化得到 的融合蛋白，并且可選地對(duì)融合蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的處理如凍干?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行重組DNA分子、蛋白質(zhì)和融合蛋白的生產(chǎn)，以及用于組織 培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。參見(jiàn),例如Sambrook等人(下文)或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al. , eds. , GreenPublishers Inc. and Wiley and Sons 1994)。通 常根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行純化技術(shù)，或者如本領(lǐng)域中通常使用常規(guī)技術(shù)如Sambrook等人 (MolecularCloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY (1989)所提出的或如本文所述而完成。除非特別說(shuō)明，否則與實(shí)驗(yàn) 室過(guò)程相連使用的術(shù)語(yǔ)，和本文所述涉及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)和藥物/制劑化 學(xué)的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知和常用的?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行生物化學(xué)合成，生物化學(xué)分析， 藥物制備、配制和傳遞，和患者的治療。應(yīng)了解的是，彈性分子接頭可選地可以放置于IL-IRa多肽和三聚域之間，并將兩 者共價(jià)連接。在某些實(shí)施方案中，接頭是約1-20個(gè)氨基酸殘基的多肽序列。接頭可以少于 10個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地，五個(gè)、四個(gè)、三個(gè)、兩個(gè)或一個(gè)氨基酸。在某些情況下，九個(gè)、八個(gè)、 七個(gè)或六個(gè)氨基酸是合適的。在有用的實(shí)施方案中，接頭基本不產(chǎn)生免疫性，不容易由蛋白 質(zhì)分解作用所分解，并且不包括已知可以與其它殘基反應(yīng)的氨基酸殘基(例如半胱氨酸殘 基)。下文的描述還涉及產(chǎn)生融合蛋白和共價(jià)附著(下文稱作“共軛結(jié)合”)于一個(gè)或 多個(gè)化學(xué)基團(tuán)上的三聚復(fù)合物的方法。適用于這些共軛物的化學(xué)基團(tuán)優(yōu)選沒(méi)有顯著的毒性 或產(chǎn)生免疫性。可選地選擇化學(xué)基團(tuán)，以產(chǎn)生能在適于保存的條件下保存并使用的共軛物。 本領(lǐng)域中已知能與多肽共軛結(jié)合的各種示例性化學(xué)基團(tuán)，包括例如碳水化合物，比如天然 存在于糖蛋白上的那些碳水化合物、聚谷氨酸，和不含蛋白的聚合物，比如多元醇(參見(jiàn)， 例如美國(guó)專利No. 6，245，901)。例如，多元醇可以與本發(fā)明的融合蛋白在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基共軛結(jié)合，包括賴氨酸殘基，如WO 93/00109，見(jiàn)上文中所公開(kāi)的。使用的多元醇可以是任何可溶于水的聚 烯化氧聚合物，并且包含直鏈或支鏈。合適的多元醇包括那些在一個(gè)或多個(gè)羥基位置用化 學(xué)基團(tuán)取代的多元醇，比如用具有一個(gè)和四個(gè)碳之間的烷基基團(tuán)取代。通常地，多元醇是聚 烯化氧，比如聚乙二醇(PEG)，并且因此，為了方便描述，討論的其余部分涉及示例性實(shí)施方 案，其中使用的多元醇是PEG，并且將多元醇與多肽共軛結(jié)合的過(guò)程稱作“聚乙二醇化”。然 而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到能使用本文所述針對(duì)PEG的用于共軛結(jié)合的技術(shù)，使用 其它多元醇，比如，例如，聚丙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物IL-IRa的聚乙二醇化中使用的PEG的平均分子量可以變化，并且通常在從約500 至約30，000道爾頓的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，PEG的平均分子量從約1，000至約25，000D，并 且更優(yōu)選地從約1，000至約5，000D。在一個(gè)實(shí)施方案中，用平均分子量為約1，000D的PEG 進(jìn)行聚乙二醇化?？蛇x地，PEG均聚物未取代，但是也可以在一個(gè)末端用烷基基團(tuán)取代。優(yōu)選 地，烷基基團(tuán)是C1-C4烷基基團(tuán)，并且最優(yōu)選地為甲基基團(tuán)。PEG制備物可以由商業(yè)提供，并 且通常地，適用于本發(fā)明中的那些PEG制備物是根據(jù)平均分子量銷售的非均一制備物。例 如，商業(yè)提供的PEG(5000)制備物通常包含的分子在分子量上略有不同，經(jīng)常相差士500D。 本發(fā)明的融合蛋白可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)一步修飾，比如，與小分子化合物共軛結(jié) 合(例如，化學(xué)療法)；與信號(hào)分子(例如，熒光團(tuán))共軛結(jié)合；與特異性結(jié)合對(duì)(例如，生 物素/鏈霉親和素，抗體/抗原)的分子共軛結(jié)合；或者通過(guò)糖基化、PEG化而穩(wěn)定，或者進(jìn) 一步融合至穩(wěn)定域(例如，F(xiàn)c域)。本領(lǐng)域已知多種將蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法。產(chǎn)生與PEG結(jié)合的蛋白質(zhì)的具體方 法包括美國(guó)專利No. 4，179，337、4，935，465和5，849，535中所述的方法。通常地，通過(guò)蛋白 質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基將蛋白質(zhì)與聚合物上的末端反應(yīng)活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，主要依賴 于反應(yīng)條件、聚合物的分子量等。在本文中具有反應(yīng)活性基團(tuán)的聚合物稱作活化聚合物。反 應(yīng)活性基團(tuán)選擇性地與蛋白質(zhì)上的自由氨基或其它反應(yīng)活性基團(tuán)反應(yīng)。PEG聚合物可以以 隨機(jī)或定點(diǎn)方式偶聯(lián)至氨基或其它反應(yīng)活性基團(tuán)。然而，應(yīng)理解的是，為獲得最優(yōu)結(jié)果而所 選擇的反應(yīng)活性基團(tuán)的類型和量，以及使用的聚合物的類型，將取決于使用的具體蛋白質(zhì) 或蛋白變體，以避免反應(yīng)活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)上過(guò)多活性基團(tuán)反應(yīng)。因?yàn)椴豢赡芡耆苊?，?以建議通常使用從約0. 1-1000摩爾，優(yōu)選2-200摩爾的活化聚合物每摩爾蛋白質(zhì)，依賴于 蛋白質(zhì)濃度。最終的每摩爾蛋白質(zhì)的活化聚合物的量是一個(gè)平衡，保持最優(yōu)活性，同時(shí)盡可 能優(yōu)化蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多元醇“廣義地表示多羥基醇化合物。多元醇可以是任何水 溶性的例如聚烯化氧聚合物，并且能包含直鏈或支鏈。優(yōu)選的多元醇包括那些用化學(xué)基團(tuán) 在一個(gè)或多個(gè)羥基位置取代的多元醇，比如用一和四碳之間的烷基取代。通常地，多元醇是 聚烷基二醇，優(yōu)選聚乙二醇(PEG)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到能用本文所述針對(duì) PEG的結(jié)合技術(shù)而使用的其它多元醇，比如，例如，聚丙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。 本發(fā)明的多元醇包括本領(lǐng)域中公知和公開(kāi)提供如從商業(yè)提供來(lái)源提供的那些。此外，可以將其它可延長(zhǎng)半衰期的分子附著于三聚域的N或C末端，包括血清白蛋 白結(jié)合肽、FcRn-結(jié)合肽或IgG結(jié)合肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)本發(fā)明的三聚IL-IRa蛋 白質(zhì)，并可選地將其連接至第三個(gè)多肽即第三個(gè)融合伴侶上。因此，可以通過(guò)向本發(fā)明的三聚IL-IRa蛋白加入這種第三個(gè)融合伴侶，獲得高產(chǎn)量的三聚IL-IRa蛋白。第三個(gè)融合伴 侶可以是任何合適的肽、寡肽、多肽或蛋白，包括二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在某些情況 下，融合伴侶可以是單個(gè)氨基酸。可以選擇融合伴侶，使其賦予融合蛋白對(duì)蛋白降解更強(qiáng) 的耐受性，促進(jìn)融合蛋白的表達(dá)和分泌增強(qiáng)，提高溶解度，和/或允許之后親和純化融合蛋 白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白(即IL-IRa部分和三聚域)和第三個(gè)融合 蛋白伴侶如泛素之間的交界區(qū)域，包括顆粒酶B蛋白酶分解位點(diǎn)，比如US 2005/0199251中 所述的人顆粒酶B (E. C. 3. 4. 21. 79)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第三個(gè)融合伴侶可以偶聯(lián)親和標(biāo)簽。這種親和標(biāo)簽可以 是允許融合蛋白在親和樹(shù)脂上純化的親和域。親和標(biāo)簽可以是聚組氨酸標(biāo)簽如六組氨酸標(biāo) 簽、聚精氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、S標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié) 合肽、幾丁質(zhì)結(jié)合域、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，或麥芽糖結(jié)合蛋白。本發(fā)明的方法可以在分離步驟中用于分離三聚IL-IRa蛋白，其由將已通過(guò)使用 上述親和標(biāo)簽系統(tǒng)而固定化的融合蛋白酶解而形成。這個(gè)分離步驟可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已 知用于蛋白質(zhì)分離的合適方法進(jìn)行，包括使用離子交換和根據(jù)尺度分級(jí)分離，方法的選擇 依賴于融合蛋白的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三個(gè)融合伴侶和包含三聚域與IL-IRa的區(qū) 域之間的區(qū)域與人絲氨酸蛋白酶顆粒酶B接觸，在顆粒酶B蛋白酶分解位點(diǎn)分解融合蛋白， 獲得本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明還提供包含至少一種上述核酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒?？梢赃x擇或 構(gòu)建包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的合適載體，所述序列包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、聚腺苷酸 化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和合適的其它序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒、噬菌體或噬菌 粒(MolecularCloning :a Laboratory Manual :2nd edition，Sambrook et al.，1989， ColdSpring Harbor Laboratory Press)0本發(fā)明還提供包含至少一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì) 胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)?？捎糜诒磉_(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、倉(cāng)鼠幼鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞和很多其它細(xì) 胞。優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌(E.coli)。藥物組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明融合蛋白和 可藥用的載體或賦形劑。如本文所使用的，“可藥用的載體”或“可藥用的賦形劑”包括任 何和所有生理相容的溶劑，分散介質(zhì)，涂層劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等壓和吸附延遲劑，等 等?？伤幱玫妮d體或賦形劑的實(shí)例包括一種或多種水、鹽、磷酸緩沖鹽、右旋糖、甘油、乙醇 等，以及它們的組合。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包括等壓劑，例如，糖，多元醇如甘露醇、 山梨醇，或氯化鈉。也可以包括可藥用的物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或最少量的輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕或乳化 劑、防腐劑或緩沖液，其可以延長(zhǎng)抗體或抗體部分的保存期或者增強(qiáng)其效果?？蛇x地，可以 包括崩解劑，比如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、瓊脂、海藻酸或其鹽，比如海藻酸鈉等。除了賦形 劑，藥物組合物可以包括下述一個(gè)或多個(gè)成分載體蛋白如血清白蛋白、緩沖液、結(jié)合劑、甜 味劑和其它增味劑；著色劑和聚乙二醇。組合物可以是多種形式，包括，例如，液體、半固體和固體劑型，比如液體溶液(例如可注射和可輸注的溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式 依賴于意欲施用的途徑和治療應(yīng)用。在實(shí)施方案中，組合物的形式為可注射或可輸注的溶 液，比如與人用抗體被動(dòng)免疫所使用的組合物相似。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用模式為腸胃外 (例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)輸液或注射施用融 合蛋白(或三聚復(fù)合物)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)肌肉內(nèi)或皮下施用融合蛋白或三聚復(fù) 合物。對(duì)于藥物組合物的其它合適的施用途徑包括，但不限于，口服、直腸、經(jīng)皮、陰道、 粘膜或腸給藥。在生產(chǎn)和保存條件下，治療組合物通常無(wú)菌并且穩(wěn)定。組合物可以配制成溶液、微 乳液、分散劑、脂質(zhì)體，或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)?？梢匀缦轮苽錈o(wú)菌注射溶液通 過(guò)將需要量的活性化合物(即融合蛋白或三聚復(fù)合物)摻入合適的包含上文列舉的一個(gè)組 分或組分組合的溶劑中，然后過(guò)濾除菌。通常，通過(guò)將活性混合物摻入包含基本分散介質(zhì)和 上文列舉的其它必需成分的無(wú)菌載體而制備分散劑。對(duì)于無(wú)菌粉劑，對(duì)于無(wú)菌注射溶液的 制備，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前過(guò)濾除菌的溶液中獲得活性成分加 任何其它期望成分的粉末?？梢员３秩芤旱恼_流動(dòng)性，例如，通過(guò)使用涂層如卵磷脂，對(duì) 于分散劑則通過(guò)保持所需的粒度，并且通過(guò)使用表面活性劑。通過(guò)在組合物中包括可延遲 吸附的試劑，例如，單硬脂酸鹽和明膠，使注射組合物的吸附延遲。生產(chǎn)物質(zhì)如包含治療本文所述疾病中有用的治療劑的試劑盒包括至少一個(gè)容器 和標(biāo)記。適當(dāng)?shù)娜萜靼ǎ?，瓶、小瓶、注射劑和試管。容器可以由多種材料形成，比如 玻璃或塑料。容器上或與其相關(guān)的標(biāo)記表明使用制劑治療所選擇的病癥。生產(chǎn)物質(zhì)可以進(jìn) 一步包括包含可藥用的緩沖液的容器，所述緩沖液如磷酸緩沖鹽、Ringer溶液和右旋糖溶 液。可以進(jìn)一步包括從商業(yè)和使用者角度期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋液、過(guò)濾 器、針、注射器和包含使用說(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。生產(chǎn)物質(zhì)還可以包括包含上述另一個(gè)活性劑 的容器。通常地，制劑中使用適量的可藥用的鹽賦予制劑等壓性?？伤幱玫柠}的實(shí)例包括 鹽、Ringer溶液和右旋糖溶液。制劑的pH優(yōu)選從約6至約9，并且更優(yōu)選從約7至約7. 5。 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，某些載體可以更優(yōu)選，依賴于，例如，施用途徑和治療 劑的濃度?？梢酝ㄟ^(guò)將具有適當(dāng)純度的期望分子與可選的可藥用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混 合(Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A. ed. (1980))，以凍 干制劑、含水溶液或含水懸浮液的形式制備治療組合物?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑使 用的劑量和濃度優(yōu)選對(duì)接受者無(wú)毒，并且包括緩沖液如Tris、HEPES、PIPES、磷酸、檸檬酸和 其它有機(jī)酸；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(比如十八烷基二甲基芐基氯 化銨；氯化六烴季銨；苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁醇或芐醇；烷基苯甲酸酯如甲基或丙基 苯甲酸酯；苯鄰二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘 基)多肽；蛋白質(zhì)，比如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；疏水性聚合物如聚乙烯吡咯烷；氨 基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合 物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；可形成鹽的抗衡 離子如鈉；和/或無(wú)毒表面活性劑如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。
這種載體的其它實(shí)例包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人 血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、 水、鹽或電解質(zhì)如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯 吡咯烷和基于纖維素的物質(zhì)。用于局部或基于凝膠形式的載體包括多糖如羧甲基纖維素鈉 或甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷、聚丙烯酸酯、聚氧化乙烯_聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二 醇和木蠟醇。對(duì)于所有施用，適當(dāng)使用常規(guī)庫(kù)存形式。這些形式包括，例如，微膠囊、納米膠 囊、脂質(zhì)體、石膏、吸入劑形式、鼻腔噴霧、舌下片和緩釋制劑。用于體內(nèi)施用的制劑應(yīng)無(wú)菌。這可以通過(guò)在凍干和重構(gòu)之前或之后由無(wú)菌過(guò)濾膜 過(guò)濾而很容易地實(shí)現(xiàn)。制劑可以以凍干形式保存，或者如果全身用藥，可以以溶液形式保 存。如果以凍干形式，通常與其它成分組合配制，用于在使用時(shí)與合適的稀釋劑重構(gòu)。液體 制劑的實(shí)例是填充在用于皮下注射的單劑量小瓶中的無(wú)菌、澄清、無(wú)色的無(wú)防腐劑溶液。治療制劑通常放在具有無(wú)菌入口的容器內(nèi)，例如，靜脈注射溶液袋或具有可由皮 下注射針刺穿的塞子的小瓶。制劑優(yōu)選以重復(fù)進(jìn)行的靜脈(i.V.)、皮下(S. C.)、肌肉內(nèi) (i.m.)注射或輸液的方式施用，或者以適于鼻內(nèi)或肺內(nèi)傳遞的噴霧形式施用(對(duì)于肺內(nèi)傳 遞，參見(jiàn)，例如，EP 257，956)。本文公開(kāi)的分子也可以以緩釋制劑的形式施用。緩釋制劑的合適的實(shí)例包括包 含蛋白質(zhì)的固體疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成型材質(zhì)的形式，例如，薄膜或微 膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，如Langer等人，J. Biomed. Mater. Res.， 15 167-277 (1981)和 Langer，Chem. Tech. , 12 :98_105 (1982)所述的聚(2-輕基乙基-甲 基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國(guó)專利No. 3，773，919，EP 58，481)、L-谷氨酸 和Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22 :547_556 (1983))、不可降 解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer，等人，見(jiàn)上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)，和聚-D- (-) -3-羥基 丁酸(EP133, 988)。治療方法本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療由IL-IRa介導(dǎo)的疾病的方法。方法包括用治療有 效量的本發(fā)明的藥物組合物治療受此類疾病困擾的受試對(duì)象。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及組合療法。通過(guò)本發(fā)明還提供包含治療劑的制劑。人們 相信這種制劑特別適合保存以及治療施用。制劑可以通過(guò)已知技術(shù)制備。例如，制劑可以 通過(guò)凝膠過(guò)濾柱上的緩沖液交換而制備。藥物組合物可以按照已知方法施用，比如作為大丸劑靜脈用藥或通過(guò)肌肉內(nèi)、腹 膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、口服、局部或吸入途徑，歷時(shí)一段時(shí)間連續(xù)輸液?？?選地，可以使用多種商業(yè)提供的設(shè)備，通過(guò)微型泵輸液而進(jìn)行施用。可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定施用三聚IL-IRa的有效劑量和計(jì)劃，并使確定的方案在本領(lǐng) 域技術(shù)內(nèi)?？梢允褂脝我换蚨喾N劑量。目前相信單獨(dú)使用的三聚IL-IRa的有效劑量或量 可以從每天約lyg/kg至100mg/kg體重或更多。劑量的種間放大可以以本領(lǐng)域已知的方 式，例如，如 Mordenti 等人，Pharmaceut. Res.，8 1351 (1991)所公開(kāi)的進(jìn)行。在體內(nèi)施用IL-IRa融合蛋白時(shí)，正常劑量可以從約lOng/kg至高達(dá)100mg/kg哺 乳動(dòng)物體重或更多每天不等，優(yōu)選約1 μ g/kg/天-50mg/kg/天，依賴于施用途徑。文獻(xiàn)中以具體劑量和傳遞方法提供了指導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No. 4，657，760 ；5, 206，344 ；或 5，225，212)。一名技術(shù)人員應(yīng)了解的是，不同劑量將對(duì)不同治療化合物和不同疾病有效，例 如，用藥靶向的一種組織或器官可以使傳遞方式不同于另一種組織或器官。本領(lǐng)域的那些 技術(shù)人員將理解，必須施用的三聚IL-IRa的劑量依賴于，例如，接受三聚IL-IRa的哺乳動(dòng) 物、施用途徑，和待用于所述哺乳動(dòng)物的其它藥物或療法而不同?？梢酝瑫r(shí)或順序施用三聚復(fù)合物和其它治療劑(和一種或多種其它療法)。在具 體的實(shí)施方案中，同時(shí)施用融合蛋白或三聚復(fù)合物和治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用 治療劑前施用融合蛋白或三聚復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用融合蛋白或三聚復(fù)合 物之前使用治療劑。施用后，可以分析體外治療的細(xì)胞。在進(jìn)行體內(nèi)治療時(shí)，可以通過(guò)技術(shù) 人員已知的多種方法檢測(cè)治療的哺乳動(dòng)物。例如，可以分析血清細(xì)胞因子響應(yīng)。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與用于治療或預(yù)防本文所述疾病和病癥的任何 一種或多種TNF抑制劑組合使用(治療前、治療后或治療同時(shí))，所述抑制劑比如但不限 于，所有形式的可溶TNF受體，包括依那西普(比如ENBREL )，以及所有形式的單體或多 聚體的P75和/或p55TNF受體分子及其片段；抗-人TNF抗體，比如但不限于，因福利美 (比如REMICADE )，和D2E7(比如HUMIRA )，等等。這種TNF抑制劑包括可以阻斷TNF 的體內(nèi)合成或細(xì)胞外釋放的化合物和蛋白質(zhì)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-17RA IL-IRa融合蛋白與任何一種或多種下述TNF抑制劑組合使用(治療前、治療后或治療同 時(shí))TNF結(jié)合蛋白(可溶TNF I類受體和可溶TNF II類受體(“sTNFR”)，如本文所定義 的)，抗-TNF抗體，粒性白細(xì)胞菌落刺激因子；薩力多胺；BN 50730;替尼達(dá)普；E 5531 ；替 帕芬特(tiapafant)PCA4248 ；尼美舒利；帕拉威爾；咯利普蘭；RP 73401 ；肽T ;MDL 201， 449A ； (1R，3S)-順式_1-[9-(2，6_ 二氨基嘌呤基)]_3_羥基-4-環(huán)戊烯氫氯化物；(1R， 3R)-反式-1-(9- (2,6- 二氨基)嘌呤)-3-乙酰氧基環(huán)戊烯；(1R，3R)-反式-I- [9-腺嘌呤 基]-3-疊氮基環(huán)戊烯氫氯化物和(1R，3R)-反式-1- (6-羥基-嘌呤-9-基)-3-疊氮基環(huán) 戊烯。TNF 結(jié)合蛋白在本領(lǐng)域中公開(kāi)(EP 308378,EP 422 339,GB 2 218 10UEP 393 438、 WO 90/13575、EP 398 327、EP 412 486、WO 91/03553、EP 418 014、JP 127，800/1991、EP 433 900、美國(guó)專利 No. 5，136，021、GB 2 246 569,EP 464 533,WO 92/01002,WO 92/13095、 WO 92/16221、EP 512 528、EP 526 905、WO 93/07863、EP 568 928、WO 93/21946、WO 93/19777, EP 417 563, WO 94/06476、和 PCT 國(guó)際申請(qǐng) No. PCT/US97/12244)。例如，EP 393438和EP 422339教導(dǎo)可溶TNF I類受體(也稱作“sTNFR-1”或 "30kDa TNF抑制劑”和可溶TNF II類受體(也稱作“sTNFR-II”或“40kDa TNF抑制劑”) (統(tǒng)稱為“sTNFR”)的氨基酸和核酸序列，以及其修飾形式(例如，片段、功能衍生物和變 體)。EP393438和EP 422339還公開(kāi)了用于分離負(fù)責(zé)編碼抑制劑的基因，在合適的載體和 細(xì)胞類型中克隆基因并表達(dá)基因產(chǎn)生抑制劑的方法。此外，還公開(kāi)了 sTNFR-1和sTNFR-II 的多價(jià)形式(即，包含不止一個(gè)活性部分的分子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)將至少一 個(gè)TNF抑制劑和另一個(gè)部分與任何臨床可接受的接頭，例如聚乙二醇(W0 92/16221和WO 95/34326)化學(xué)偶聯(lián)，通過(guò)肽接頭(Neve等人(1996)，Cytokine，8 (5) :365_370)，通過(guò)化學(xué) 偶聯(lián)至生物素然后結(jié)合至親和素(W091/03553)并且，最后，通過(guò)合并嵌合的抗體分子(美 國(guó)專利 No. 5，116,964，WO 89/09622，WO 89/09622，WO 91/16437 和 EP 315062)而構(gòu)建多 價(jià)形式。
抗-TNF抗體包括 MAK 195F 抗體(Holler 等人(1993)，IstInternational Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147) ；CDP 571 抗 _TNF 單 克隆抗體(Rankin 等人(1995)，British Journalof Rheumatology, 34 334-342) ；BAY X 1351鼠抗-腫瘤凋亡因子單克隆抗體(Kieft等人(1995), 7th European Congress of Clinical Microbiologyand Infectious Diseases,第 9 頁(yè))；CenTNF cA2 抗-TNF 單克隆 抗體(Elliott 等人(1994)，Lancet, 344 1125-1127and Elliott et al. (1994)，Lancet, 344 1105-1110)。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的IL-17抑制劑(例如抗-IL17受體 抗體，Amgen ；抗-IL-17A，抗-IL17F)、RORc抑制劑組合使用。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的⑶28抑制劑組合使用，比如但不限 于，阿巴西普(例如ORENCIA )。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的IL_6和/或IL_6受體抑制劑組合 使用，比如但不限于，托珠單抗(Tocilizumab)(例如ACTEMRA )。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的抗-IL-18化合物如IL-18BP或衍生 物，IL-18trap、抗-IL-18、抗-IL-18R1 或抗-IL-18-RAcP 組合使用。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的抗-IL22如抗-IL22或抗IL22R組
合使用。本文所述IL-IRa融合蛋白額可以與所有形式的抗-IL-23和或IL-12如抗-pl9、 抗-p40 (烏特津單抗(Ustekinumab))、抗-IL-23R組合使用。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的抗-IL21如抗-IL21或抗-IL21R組
合使用。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與所有形式的抗-TGF-β組合使用。IL-IRa融合蛋白可以與一種或多種細(xì)胞因子、淋巴因子、成血因子和/或抗炎劑 組合使用。本文所述疾病和病癥的治療可以包括使用用于控制疼痛和炎癥的一線藥物 和用一種或多種本文提供的IL-IRa融合蛋白治療的組合(治療前、治療后或治療同 時(shí))。這些藥物被劃分為非留體抗炎藥物(NSAID)。二級(jí)治療包括皮質(zhì)類固醇、慢作用 抗風(fēng)濕藥物(SAARD)，或病癥改善(DM)藥物。關(guān)于下述化合物的信息可以在The Merck Manualof Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Merck, Sharp & DohmeResearch Laboratories, Merck & Co. , Rahway, N. J. (1992)禾口 Pharmaprojects, PJB Publications Ltd中找到。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與用于治療本文所述疾病和病癥的一種或多種 NSAID組合使用。NSAID至少進(jìn)行部分抗炎作用，抑制前列腺素合成(Goodman and Gilman in" The Pharmacological Basis ofTherapeutics, " MacMillan 7th Edition(1985))。 NSAID可以分為至少九組⑴水楊酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；⑷芬那 酸衍生物；(5)羧酸衍生物；(6) 丁酸衍生物；(7)昔康類(oxicam) ； (8)吡唑和(9)吡唑啉 酮。本文所述IL-IRa融合蛋白可以與任何一種或多種水楊酸衍生物、前藥酯或其可 藥用的鹽組合使用(治療前、治療后或治療同時(shí))。這些水楊酸衍生物、前藥酯或其可藥用的鹽包括醋氨沙洛、阿洛普令、阿司匹林、撲炎痛、溴水楊醇、乙酰水楊酸鈣、三水楊酸膽堿 鎂、水楊酸鎂、水楊酸膽堿、二氟尼柳(diflusinal)、伊特柳酯、芬度柳、龍膽酸、水楊酸乙二 醇酯、水楊酸咪唑、賴氨酸乙酰水楊酸、氨水楊酸、水楊酸嗎啉、1-萘基水楊酸、奧沙拉秦、帕 沙米特、苯基乙酰水楊酸、苯基水楊酸、醋水楊胺、鄰氨甲?；窖跻宜?、雙水楊酯、水楊酸 鈉和柳氮磺胺吡啶。結(jié)構(gòu)相關(guān)、具有相似的止痛和抗炎性質(zhì)的水楊酸衍生物也意欲包括在 這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)丙 酸衍生物、前藥酯或其可藥用的鹽組合(治療前、治療后或治療同時(shí))的用途。丙酸衍生物、 前藥酯和其可藥用的鹽包括阿洛明芬、苯惡洛芬、布氯酸、卡洛芬、右吲哚洛芬、非諾洛芬、 氟諾洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、呋洛芬、布洛芬、布洛芬鋁、異丁普生、吲哚洛芬、異洛芬、酮洛 芬、氯索洛芬、咪洛芬、萘普生、萘普生鈉、奧沙普秦、吡酮洛芬、吡啶洛芬(pimeprofen)、吡 咯洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、吡哆洛芬(pyridoxiprofen)、舒洛芬、噻洛芬酸和硫惡洛芬。 具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)丙酸衍生物也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa與任何一個(gè)或多個(gè)乙酸衍生物、 前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))。乙酸衍生物、前藥酯，和 其可藥用的鹽包括阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羥酸、桂美辛、氯吡酸、地美辛、雙氯 芬酸鈉、依托度酸、聯(lián)苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、呋羅芬酸、葡美辛、異丁 芬酸、消炎痛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、奧沙美辛、奧克品那(oxpinac)、吡美 辛、丙谷美辛、蘇靈大、他美辛、噻拉米特、硫平酸、甲苯酰吡啶乙酸、甲苯酰吡啶乙酸鈉、齊 多美辛和佐美酸。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)乙酸衍生物也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)芬 那酸衍生物、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))。芬那酸衍 生物、前藥酯和其可藥用的鹽包括因法來(lái)酸、依托芬那酯、氟芬那酸、異尼克辛、甲氯芬那 酸、甲氯芬那酸鈉、medofenamic acid、甲滅酸、尼氟酸、他尼氟酯、特羅氨酯、鄰甲氯滅酸和 烏芬那酯。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)芬那酸衍生物也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)羧 酸衍生物、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))。羧酸衍生物、 前藥酯和其可藥用的鹽包括環(huán)氯茚酸、二氟尼柳、氟苯柳、因諾立定(inoridine)、酮咯酸 和替諾立定。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)羧酸衍生物也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)丁 酸衍生物、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))丁酸衍生物、 前藥酯和其可藥用的鹽包括布地馬宗、布替布芬、芬布芬和聯(lián)苯丁酸。具有相似鎮(zhèn)痛和抗 炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)丁酸衍生物也意欲包括在這組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)昔康、前藥 酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))。昔康、前藥酯和其可藥用的 鹽包括屈惡昔康、依諾利康、伊索昔康、吡羅昔康、舒多昔康、替諾昔康和4-羥基-1，2-苯 并噻嗪1，1- 二氧-4-(N-苯基)_酰胺。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)昔康也意欲 包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)吡唑、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))?？梢允褂玫倪吝?、前 藥酯或其可藥用的鹽包括二苯咪唑和依匹唑。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)吡唑 也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)吡 唑啉酮、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用途(治療前、治療后或治療同時(shí))?？梢允褂玫?吡唑啉酮、前藥酯和其可藥用的鹽包括阿扎丙宗、阿扎丙酮、芐哌立隆(benzpiperylon)、 非普拉宗、莫非保松、瑪拉宗、羥基得泰松、苯基丁氮酮、哌保松、丙基安替比林 (propylphenazone)、雷米那酮、琥保松和噻唑保泰松(thiazolinobutazone)。具有相似鎮(zhèn) 痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)吡唑啉酮也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一個(gè)或多個(gè)下 述NSAID組合的用途(治療前、治療后或治療同時(shí))ζ _乙酰氨基己酸、S-腺苷-甲硫 氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、阿尼扎芬、安曲非寧、芐達(dá)酸、芐達(dá)酸賴氨酸酯、芐 達(dá)明、比普欽(b印rozin)、溴哌莫、布可隆、丁苯唑酸、環(huán)丙喹宗、氯可昔酯(cloximate)、 達(dá)奇胺、地波沙美、地托咪定、聯(lián)苯吡胺(difenpiramide)、聯(lián)苯吡胺(difenpyramide)、 difisalamine、地他唑、依莫法宗、甲磺酸法奈替唑、吩氟咪唑、氟喹氨苯酯、氟咪唑、氟尼 辛、氟丙喹宗、伏哌托寧、磷柳酸、胍美柳、guaiazolene, isonixirn、鹽酸利非他明、來(lái)氟米 特、洛非咪唑、氯替法唑、lysin clonixinate、美西拉宗、萘丁美酮、尼克吲哚、尼美舒立、 奧古蛋白、奧帕諾辛、奧沙西羅、奧沙帕朵、瑞尼托林、派立索唑、檸檬酸派立索唑、派福肟、 萘普生哌嗪酸、吡拉唑酸、吡非尼酮、普羅喹宗、普羅沙唑、thielavin B、替氟咪唑、替美加 定、托美丁、托帕朵、tryptamid和那些由公司代碼號(hào)如480156S、AA861、AD1590, AFP802、 AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC, BW540C、CHIN0IN 121、CN100、EB382、EL508、F1044、 FK-506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、0N03144、PR823、 PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、 TA60、TAI-901 (4-苯甲酰-1-茚酸)、TVX2706、U60257、UR2301 和 WY41770 命名的那些。具 有與NSAID相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)NSAID也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一種或多種 皮質(zhì)類固醇、前藥酯或其可藥用的鹽的組合用于治療本文所述疾病和病癥的用途(治療 前、治療后或治療同時(shí))，所述疾病或病癥包括急性和慢性炎癥如風(fēng)濕性疾病、移植物抗 宿主疾病和多發(fā)性硬化。皮質(zhì)類固醇、前藥酯和其可藥用的鹽包括氫化可的松和源自氫 化可的松的化合物，比如21-醋酸基娠烯醇酮、alclomerasone、阿爾孕酮、安西奈德、倍 氯米松、倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、氯潑尼松、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他 松、丁酸氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酯酮、可的松、可的伐唑、deflazacon、羥潑 尼縮松、desoximerasone、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、甘草次酸、氟扎可 特、氟氯奈德、氟米松、三甲基乙酸氟米松、丙酮化氟新龍、氟尼縮松、氟輕松醋酸酯、丁基 氟可丁、氟可龍、己酸氟可龍、戊酸氟可龍、氟甲龍、乙酸氟培龍、乙酸氟潑尼定、氟潑尼龍、 f Iurandeno 1 i de、福莫可他、哈西縮松、鹵米松、乙酸鹵潑尼松、hydro_cortamate、氫化可的 松、乙酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、磷酸氫化可的松、氫化可的松21-琥珀酸鈉、氫化可 的松叔丁乙酯、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼松、甲強(qiáng)龍、糠酸莫米他松、帕拉米松、潑尼卡酯、 強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松龍21-diedryaminoacetate、強(qiáng)的松龍21-磷酸鈉、強(qiáng)的松龍21-琥珀酸鈉、強(qiáng)的松龍21-間磺苯甲酸鈉、強(qiáng)的松龍21-硬脂酰甘醇酸鈉、強(qiáng)的松龍叔丁乙酯、三甲基 乙酸強(qiáng)的松龍21、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍戊酸酯、潑尼立定、潑尼立定21-二乙胺乙酸酯、替可的 松、去炎松、曲安奈德、苯曲安縮松和己曲安縮松。具有與相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān) 皮質(zhì)類固醇也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一種或多種慢 作用抗風(fēng)濕藥物(SAARD)或病情緩解抗風(fēng)濕藥物(DMARD)、前藥酯或其可藥用的鹽組合用 于治療本文所述疾病和病癥的用途(治療前、治療后或治療同時(shí))，所述疾病包括急性和 慢性炎癥如風(fēng)濕性疾病、移植物抗宿主疾病和多發(fā)性硬化。SAARD或DMARDS、前藥酯和其 可藥用的鹽包括阿洛酮鈉、金諾芬、金硫葡糖、金硫醋苯胺、咪唑硫嘌呤、布喹那鈉、布西拉 明、3-金硫-2-丙醇-1-磺酸鈣、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁扎利、銅克索林、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢 素、氨苯砜、15-脫氧格埃林、雙醋瑞因、葡萄糖胺、金鹽(例如、環(huán)喹金鹽、硫代蘋(píng)果酸金鈉、 硫代硫酸金鈉)、羥基氯喹、硫酸羥基氯喹、羥基脲、酮保泰松、左旋咪唑、氯苯扎利、蜂毒素、 6-巰嘌呤、甲氨蝶呤、咪唑立賓、霉酚酸酯、myoral、氮芥、D-青霉胺、pyridinolimidazole 如SKNF86002和SB203580、雷帕霉素、硫醇、促胸腺生成素和長(zhǎng)春新堿。具有與相似鎮(zhèn)痛和 抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)SAARD或DMARD也意欲包括在這組中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一種或多種 C0X2抑制劑、前藥酯或其可藥用的鹽組合用于本文所述疾病和病癥的治療的用途(治療 前、治療后或治療同時(shí))，所述疾病和病癥包括急性和慢性炎癥。C0X2抑制劑、前藥酯或其 可藥用的鹽的實(shí)例包括，例如，賽來(lái)昔布。具有相似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)C0X2也意 欲包括在這組中。C0X-2選擇性抑制劑的實(shí)例包括但不限于依托考昔、伐地昔布、賽來(lái)昔布、 立克飛龍、羅美昔布(lumiracoxib)、羅非昔布等等。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及IL-IRa融合蛋白與任何一種或多種抗 細(xì)菌劑、前藥酯或其可藥用的鹽組合用于治療本文所述基本和病癥的用途(治療前、治療 后或治療同時(shí))，所述疾病或病癥包括急性和慢性炎癥?？辜?xì)菌劑包括，例如，各種類型的 青霉素，頭孢菌素和其它內(nèi)酰胺，氨基糖苷，唑類，喹諾酮。青霉素包括，但不限于青霉 素G、青霉素V、甲氧西林、萘夫西林、新青二、氯灑西林、雙氯青霉素、氟氯青霉素、氨芐青霉 素、氨芐青霉素/舒巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、海他西林、環(huán)青霉素、氨芐青霉 素甲戊酯、羧芐青霉素、羧茚青霉素、羧基噻吩青霉素、羧基噻吩青霉素/克拉維酸、阿洛西 林、meziocillin、哌拉西林和美西林。頭孢菌素和其它β _內(nèi)酰胺包括，但不限于先鋒霉 素、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢拉啶、頭孢唑啉、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢羥唑、頭孢替坦、 頭孢西丁、ceruroxime、頭孢尼西、ceforadine、頭孢克肟、頭孢噻肟、拉氧頭孢、頭孢唑肟、 頭孢曲松、⑶phoperazone、頭孢他啶、亞胺培南和氨曲南。氨基糖苷包括，但不限于氯霉素、 慶大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、奈替米星、卡那霉素和新霉素。唑類包括，但不限于氟 康唑。喹諾酮包括，但不限于萘啶酮酸、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星 和替馬沙星。大環(huán)內(nèi)酯包括，但不限于紅霉素、螺旋霉素和阿奇霉素。利福霉素包括，但不 限于利福平。四環(huán)素包括，但不限于spicycline、氯四環(huán)素、氯莫環(huán)素、地美環(huán)素、去氧土霉 素、胍甲環(huán)素、賴甲環(huán)素、甲氯環(huán)素、甲烯土霉素、二甲胺四環(huán)素、氧四環(huán)素、青哌環(huán)素、匹哌 環(huán)素、羅利環(huán)素、山環(huán)素、senociclin和四環(huán)素?；前钒ǎ幌抻诨前?、新諾明、磺胺醋 酰、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑和復(fù)方磺胺甲噁唑(甲氧芐胺嘧啶/新諾明)。林可胺包括，但不限于氯林肯霉素和林肯霉素。多粘菌素(多肽)包括，但不限于多粘菌素B和粘菌素。應(yīng)注意的是，本文使用的小節(jié)標(biāo)題僅用于組織，不應(yīng)理解為以任何方式限定所述 主題。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全部并入本文。下述實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明某些實(shí)施方案的闡述，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā) 明由所附的權(quán)利要求所限定。實(shí)施例實(shí)施例1 三聚IL-IRa的形式、產(chǎn)牛和純化先前已經(jīng)顯示，IL-IRa能作為大腸桿菌中的重組蛋白而產(chǎn)生(Steinkasserer等 人1992.FEBS 310:63-65)。蛋白非常穩(wěn)定并且有效地重折疊。也已經(jīng)描述了在N-末端 具有其它氨基酸的IL-IRa的同工型(Haskill等人1991，PNAS 88 :3681_3685 ；Muzio等人 1995，JEM 182,623-628)。這些分子結(jié)合IL-IR以及成熟分泌形式，表明可能將多余的肽與 拮抗劑的N-末端融合，而不影響與受體的結(jié)合。對(duì)與IL-IR相互反應(yīng)的IL-IRa的晶體進(jìn) 行的結(jié)構(gòu)分析也支持N-末端變化不影響與ILlR的相互作用(Schreuder等人1997，Nature 386 190-194)。從源自骨髓和/或人胎盤(pán)的人cDNA文庫(kù)克隆IL_lRa。三聚IL-IRa經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，與Trip-三聚單元進(jìn)行C-末端融合。設(shè)計(jì)了八個(gè)不同 的融合蛋白，四個(gè)具有全長(zhǎng)三聚單元(Trip)，四個(gè)具有三聚單元的九個(gè)氨基酸的截短型 (IlOTrip)0然后使用四個(gè)不同的C-末端融合，將IL-Ira與任一個(gè)三聚單元融合。名為 Trip V、Trip Τ、Trip Q和Trip K的C-末端變體允許在三聚域上唯一呈現(xiàn)CTLD。Trip K 變體是最長(zhǎng)的構(gòu)建體，并且在CTLD和三聚域之間包含最長(zhǎng)并且最靈活的連接頭。Trip V、 Trip T、Trip Q代表直接位于三聚模塊上而沒(méi)有任何結(jié)構(gòu)靈活性的CTLD分子的融合體，而 且將三分之一的CTLD分子從TripV到Trip Τ,并從Trip T到Trip Q0這是由于這些氨基 酸中的每個(gè)都為α “螺旋旋轉(zhuǎn)，并且完整旋轉(zhuǎn)需要3. 2aa0以BL21AI細(xì)菌中的顆粒酶B可分裂融合蛋白的形式產(chǎn)生下述蛋白。帶下劃線的 部分表示三聚單元，并且黑體字部分表示IL-IRa部分CII-H6-GrB-GG-TripK-IL-lra MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEGGSHHHHHHGSIEP DGGEGPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVSL
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LQGPNVNLEEKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRL QLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCT AMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 47)；CII-H6-GrB-GG-TripV-IL-lra :MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKT AEGGSHHHHHHGSIEPDGGEGPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQAL QTV RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQG PNVNLEEKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLE AVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAME ADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO 48)；CII-H6-GrB-GG-TripT-IL-lra :MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEGGSHHHHHHGSIEPDGGEGPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQ T_RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGP
NVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEA VNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAME adqpvsltnmpdegvmvtkfyfqede (seq id no 49)；CII-H6-GrB-GG-TripQ-IL-lra :MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKT AEGGSHHHHHHGSIEPDGGEGPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQAL qRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPN VNLEEKIDVyPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEA dqpvsltnmpdegvmvtkfyfqede (seq id no 50)；CII-H6-GrB-1 IO-TripK-IL-IraMVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKT AEGGSHHHHHHGSIEPDIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVSLK RP SGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEE KIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSL
tnmpdegvmvtkfyfqede (seq id no :5l)；CII-H6-GrB-110-Tr i ρV-1L-1raMVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEGGSHHHHHHGS IEPDIYNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTY RPSGR KSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDV VPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENR KQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNM pdegvmvtkfyfqede (seq id no :52)；CII-H6-GrB-1 IO-TripT-IL-Ira :MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKT AEGGSHHHHHHGSIEPDIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQT RPSGRK SSKMQAFRIWDyNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVV PIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRK QDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMP degvmvtkfyfqede (seq id no :53)；和CII-H6-GrB-I IO-TripQ-IL-Ira :MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTA EGGSHHHHHHGSIEPDIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQ RPSGRKS SKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVP IEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQ DKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPD egvmvtkfyfqede (seq id no 54)在NiNTA Superflow(Qiagen)上捕捉所有構(gòu)建體，重折疊并進(jìn)一步在 SP-Sepharose FF (GE Heathcare)上純化。根據(jù)搖瓶中的表達(dá)或三聚ILl-Ra的發(fā)酵結(jié)果，純化包涵體。將密實(shí)的細(xì)胞團(tuán)在裂解緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0，25w/v%蔗糖，ImM EDTA) 中通過(guò)超聲均質(zhì)化(50g濕細(xì)胞團(tuán)每IOOmL裂解緩沖液)。然后加入IOOmg溶菌酶每IOOmL 裂解緩沖液并混合，之后將樣品在室溫放置15分鐘。然后將樣品和其中的混合物一起超聲 2-5分鐘。加入清潔緩沖液(0. 2M NaCl、lw/v%脫氧膽酸鹽、Na鹽、lw/v% Nonidet P40、 20mM Tris-HCl、pH7. 5，2mM EDTA)并與樣品混合，之后再次超聲。通過(guò)在8000rpm，4°C離 心25分鐘而回收包涵體。在4°C保存上清并將細(xì)胞團(tuán)重懸于100mLTRIT0N X-100緩沖液 (0. 5w/v% TRIT0N X-100UmM EDTA，pH8)每 50g初始細(xì)胞團(tuán)中。通過(guò)在 8000rpm，4°C離心 25分鐘而回收包涵體，并在4°C保存上清。再重復(fù)一次TRIT0N X-100緩沖液洗滌，并通過(guò) 在12000rpm，4°C離心5分鐘而回收包涵體。將包涵體在28°C在30mL變性緩沖液/克初始細(xì)胞糊(6M尿素、IOmM EDTA、20mM Tris/HCl和20πιΜβ -巰基乙醇，pH8. 0)中重懸2小時(shí)。在7500g將懸浮液離心15分鐘，去 除不溶物。然后加入CaCl2至終濃度20mM，并將溶液應(yīng)用于IOOmL Ni-NTA Superflow柱， 其在NTA緩沖液(8M尿素；IOOOmM NaCl ；50mM Tris HCl pH8. 0 ；5πιΜβ-巰基乙醇)中平衡 并洗滌，直至獲得穩(wěn)定基線。用250mL鹽酸胍、50mMTris-HCl ρΗ8. 0、5πιΜβ -巰基乙醇進(jìn)一 步洗滌，然后用IOOmL緩沖液NTA洗滌。已經(jīng)使用了兩種重折疊的方法，透析重折疊和柱上重折疊都獲得了純的可溶蛋 白。對(duì)于透析重折疊，重懸的包涵體可直接用于過(guò)夜透析進(jìn)入包含3Μ尿素、ImM EDTA的 IX PBS, ρΗ7. 2。透析次日繼續(xù)透析進(jìn)入包含OM尿素、ImM EDTA的1XPBS，ρΗ7. 2。對(duì)于柱上重折疊，洗滌已結(jié)合蛋白的Ni-NTA Superflow柱，用包含3Μ尿素的4CV ml IXPBS，pH7. 2洗滌樹(shù)脂，之后運(yùn)行線性梯度，其為包含3M尿素的IOCV lXPBS，pH7. 2和 包含OM尿素的10CVlXPBS，pH7. 2。為了回收重折疊的三聚IL_lra，用1 XPBS，IOmMEDTA， PH6.0洗脫柱并收集各部分。 重折疊后，如下進(jìn)行用重組人顆粒酶B的分裂通過(guò)用NaOH將洗脫液中的pH調(diào)至 7.5，然后以1 400的比例(顆粒酶/蛋白)加入顆粒酶B，并在25°C過(guò)夜孵育。之后進(jìn) 行 SDS-PAGE。最后，使用SP-S印harose FF(GE Healthcare)陰離子交換步驟純化分裂的蛋白 質(zhì)。填充約50mL SP-Sepharose FF，并在緩沖液A(lxPBS，ImM EDTA pH5，5)中平衡直至獲得 穩(wěn)定基線。用緩沖液A 1 3稀釋分裂反應(yīng)物，并載入柱上，然后用緩沖液A洗滌直至監(jiān)測(cè) 到穩(wěn)定基線。建立從IOCV緩沖液A到IOCV緩沖液B (IXPBSUmM EDTA+0. 5M NaCl ρΗ5· 5) 的梯度，并收集各部分5mL。在合并蛋白產(chǎn)物前在SDS-PAGE上分析包含各部分的蛋白?；蛘?，使用來(lái)自上述包涵體制備物的上清純化蛋白。在用緩沖液A (20mM TrisHCL, 50mM NaCl pH8. 0)平衡的Ni-NTA Superflow(Qiagen)柱上純化上清中的可溶三聚 ILl-ra。合并包涵體純化的洗滌液，并在IOOOOrpm離心10分鐘，然后加入CaCl2至5mM， 并加入Tris-HCl至20mM，并用HCl/NaOH將pH調(diào)至6. 0。將合并物載入柱上并用緩沖液 A洗滌，直至獲得穩(wěn)定基序。在緩沖液A+1M NaCl洗滌直至基線穩(wěn)定后，用緩沖液A+20mM EDTA洗脫已結(jié)合蛋白，并收集各部分。此后用顆粒酶B分裂蛋白合并物，并如上所述在 SP-Sepharose FF柱上精制。來(lái)自3L表達(dá)培養(yǎng)物的CII-H6-GrB-GG-TripK-IL-lra的可溶 部分的最終產(chǎn)量為 95mg TripK-IL-IRa(在捕捉 Ni-NTA Superflow(Qiagen)后約 250mg CII-H6-GrB-TripK-IL-IRa)。因?yàn)閬?lái)自可溶部分的蛋白產(chǎn)量和純度顯著優(yōu)于重折疊，所以
24選擇這種方法進(jìn)行初始構(gòu)建體測(cè)試。在 Biacore 300(Biacore, Uppsala, Sweden)上分析重折疊蛋白與 IL-I 受體 1 結(jié) 合的能力，其中小鼠ILl-RI/Fc與CM5傳感器芯片偶聯(lián)，并且測(cè)定可溶TripK-IL-Ira與 IL-IRI蛋白的結(jié)合。通過(guò)透析重折疊未分裂CII-H6-GrB-TripK-IL-lra的結(jié)果示于圖2， 并且未分裂CII-H6-GrB-TripK-IL-lra柱上NiNTA重折疊示于圖3。分裂和純化分析方法 產(chǎn)生SEQ ID NO 47-54的三聚IL-IRa化合物。實(shí)施例2 三聚IL-IRa化合物在U937細(xì)胞中抑制IL-8的IL-1誘導(dǎo)的能力進(jìn)一步分析GG-TripV-IL-Ira (trip V-ILlRa) ,GG-TripK-IL-Ira (tripK-ILIRa)、 GG-TripT-IL-Ira(trip Τ-ILlRa)和 CII-H6-GrB-GG-TripT-IL-lra (trip Q-ILlRa)在 U937細(xì)胞中抑制IL-8的IL-I誘導(dǎo)的能力。結(jié)果示于圖4中?；衔飳?duì)于阻斷響應(yīng)基本同樣有效，并且全部表現(xiàn)為和KINERET (在w/w上比 較)一樣有效。由于在實(shí)驗(yàn)中的緩沖作用，在使用的最高蛋白濃度(100g/mL)，IL-8的產(chǎn)生 增加而不是繼續(xù)下降。根據(jù)幾種體外效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以及Biacore檢測(cè)，根據(jù)阻斷和結(jié)合效 率以及產(chǎn)量，確定TripT ILlRa是最佳的化合物。實(shí)施例3 聚乙二醇三聚IL-IRa化合物因?yàn)轶w內(nèi)半衰期是KINERET ’ 效率中的關(guān)鍵參數(shù)(KINERET’ .在人體中的半衰期 只有4-6小時(shí)，并且因此可每天用一次)，所以測(cè)試通過(guò)N-末端聚乙二醇化將TripT ILlRa 聚乙二醇化的能力。在N末端將三聚ILl-Ra聚乙二醇化。使用上述純化過(guò)程最后一步后 的三聚ILl-Ra拮抗劑蛋白作為聚乙二醇化的起點(diǎn)。將緩沖液換成PBS緩沖液pH6.0，進(jìn)行 聚乙二醇化反應(yīng)。反應(yīng)物中的蛋白濃度為0. 5-3. 5mg/ml，并且使用補(bǔ)加20mM氰硼氫鈉的過(guò) 量5-10摩爾的mPeg5K-乙醛或mPeg20K-乙醛(Nektar)。在20°C進(jìn)行16小時(shí)反應(yīng)。反應(yīng) 后，將混合物用于SourCel5S柱(GE Healtcare)，純化單聚乙二醇化形式。如圖5所示，與 未聚乙二醇化蛋白相比，聚乙二醇化形式蛋白的拮抗活性下降。然而，聚乙二醇化蛋白仍然 具有好的ILl阻斷效果。實(shí)施例4 :i. v.灃射后雄件Lewis大鼠中三聚ILlRa蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)分析選擇前面實(shí)施例中描述的三種三聚ILlRa多肽進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。構(gòu)建體中的 差異在三聚域的N-末端全長(zhǎng)(FL)、前九個(gè)氨基酸截短(IlO)和前16個(gè)氨基酸截短(V17)。 IlO構(gòu)建體代表三聚域天然發(fā)生缺失的變體，并且缺少在Thr 4的0-糖苷化。V17衍生物 代表缺失編碼三聚域的第一個(gè)外顯子，并且缺少肝素結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)位點(diǎn)在IlO構(gòu)建體中 也部分去除。如圖6所示，在U937細(xì)胞分析中確認(rèn)了 IL-IRa分子的體外效果。在靜脈內(nèi)(i.v.)注射后，分析Lewis大鼠中這三種構(gòu)建體多肽的藥代動(dòng)力學(xué) 譜。獲得的譜與同樣實(shí)驗(yàn)中KINERET 的藥代動(dòng)力學(xué)譜相比較。使用四只雄性Lewis大 鼠每組進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，并且使用的構(gòu)建體為FL IL-IRa, IlOIL-IRa, V17IL-lRa和 KINERET1 。對(duì)動(dòng)物每次i.v.劑量為100mg/kg。測(cè)試化合物溶于載體(4.4mM檸檬酸鈉， pH6. 5,93. 8mM NaCl,0. 33mM EDTA，0.7g TffEEN‘ -80)中，并通過(guò)尾部靜脈(骶正中靜脈) 或后爪靜脈(隱靜脈)施用。然后在基線(0小時(shí))和用藥后0. 5、1、2、4、8、12、24、48、72小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從 四只動(dòng)物收集血液。在Microtainers 中，從尾尖收集約100μ 1的血液樣本。收集血漿并 轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中。然后在-70°C儲(chǔ)存血漿樣本，直至進(jìn)行測(cè)量。然后通過(guò)吸入CO2而殺死動(dòng)物，并棄去尸體而不進(jìn)行病原檢查。然后通過(guò)ELISA測(cè)定血漿中的IL-IRa化合物水平和 KINERET 水平。每只大鼠的平均體重為250克。假設(shè)大鼠平均血體積為16. 5mL，在i. v.注射后， 計(jì)算得到化合物的理論最大初始濃度為1500000ng/mL。這些濃度示于圖7中。使用這一起 始水平為分析的起始值。在動(dòng)物體中未觀察到副作用或變化。在上述時(shí)間點(diǎn)取血液樣本后，使用ELISA方法測(cè)定血液樣本中注射的蛋白質(zhì)。根 據(jù)這些ELISA結(jié)果，使用曲線下面積(AUC)作為藥物暴露的量度，并使用標(biāo)準(zhǔn)軟件計(jì)算血菜 半衰期。曲線下面積示于表2中，并且蛋白質(zhì)的血漿半衰期示于表3中。表2 表 3 這些i.v.數(shù)據(jù)表明，與KINERET :相比，三聚化合物的血漿半衰期更長(zhǎng)。 KINERET ’ 的半衰期約為1. 2分鐘，同時(shí)V17ILlRa三聚化合物在i. v.注射后的半衰期約 為69分鐘。依賴于分析中所使用的標(biāo)準(zhǔn)，AUC的相對(duì)增加在兩倍(FL ILlRa三聚物)和五 倍(V17 ILlRa三聚物)之間，表明與KINERET 相比，使用三聚變體的藥物暴露得到充分
蛋白質(zhì)AUC ins/mL*h)AUC蛋白/ AUC KINERET FL ILlRa8092921.89IlOILlRa16378663.82Vl7 ILlRa21777815.08KINERET 4284141 兩種分子均由BL21AI細(xì)菌在IOL發(fā)酵罐中使用2XTY培養(yǎng)基 (Met-IlO-TripT-IL-Ira)或化學(xué)合成最小培養(yǎng)基(GG_V17-TripT-IL_lra)產(chǎn)生。通 過(guò)以5887Xg離心20分鐘而獲得細(xì)胞團(tuán)，然后重懸于IOmMNa2HPO4 pH6中。對(duì)于
實(shí)施例 5 :Met-I IO-TripT-ILlra 和 GG-V17_TripT_ILlra 和大鼠 CIA 模型的產(chǎn)生
改善。
Met-110-TripT-IL-lra，通過(guò)高壓均質(zhì)化(2X 17. OOOpsi)而獲得包括目的蛋白的可 溶細(xì)胞部分，然后以10. OOOXg離心10分鐘。用IOmM Na2HPO4 pH7.4稀釋上清，并在 SP-Sepharose FF柱(陽(yáng)離子交換，GE Healthcare)上跑樣，然后使用AKTA fPLC在 Q-Sepharose FF (陰離子交換，GE Healthcare)上跑樣。在最后一步，使蛋白通過(guò)Mustang E過(guò)濾器(Pall)以去除內(nèi)毒素，然后通過(guò)緩沖液交換進(jìn)入PBS pH7. 4中，并濃縮至50mg/mL。 以包括N-末端加強(qiáng)域、噬菌體CII蛋白的融合蛋白之后加入人顆粒酶B分裂位點(diǎn)的形式表 達(dá)GG-V17-TripT-IL-lRa蛋白。通過(guò)在包含裂解酶的裂解緩沖液中均質(zhì)化，然后以8000rpm 離心25分鐘而從發(fā)酵細(xì)胞團(tuán)中純化GG-V17-TripT-IL-lRa。然后使上清通過(guò)Fractogel EMD Chelate(M)柱(EMD Chemicals Inc.)，并將洗脫液通過(guò)緩沖液交換進(jìn)入20mM Tris pH7.5,150mM NaCl。然后用重組人顆粒酶B (產(chǎn)自小鼠，參照專利)消化蛋白部分。在用 PBS pH6稀釋后，使用SP Sepharose FF純化蛋白，然后用Mustang E過(guò)濾和Fractogel EMD Chelate(M)柱，以流動(dòng)模式去除融合標(biāo)簽和人顆粒酶B。最后，將蛋白通過(guò)緩沖液交 換進(jìn)入 PBS pH7. 4，并濃縮至 50mg/mL。Met-IlO-TripT-IL-lra 和 GG_V17-TripT-IL_lra 蛋白的得率均為3-5g/L，純度> 95 %，如由SDS-PAGE (圖8)、RP-HPLC和MS所確定的。內(nèi) 毒素水平< 3EU/mg，如使用LAL分析(Lonza)所確定的。聚集物< 0. 5%，如由分析SEC 所確定的(圖9)，并且宿主細(xì)胞蛋白< 6ng/mL。上述分析中測(cè)試了兩批(LM022，LM023) Met-IlO-TripT-IL-Ira 和兩批(CFO19, CF020) GG_V17-TripT-IL_lra。對(duì)已形成4天II類膠原關(guān)節(jié)炎的雌性Lewis大鼠在患關(guān)節(jié)炎后第1_3天， 每天(QD)用載體(IOmM磷酸緩沖液pH7. 4)或等摩爾量的IL-Ira進(jìn)行皮下(SC)處 理，其中 IL-Ira 可以使用單體 IL-lra(lOOmg/kgKINERET )，或三局 ILlra(120mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra,或 120mg/kgGG-V17-TripT_ILlra)。為了 只設(shè)一組對(duì)照，QD 組 中的所有大鼠在第二次和第三次施用是分別施用載體(IOmM磷酸緩沖液pH7. 4，或?qū)τ?KINERET 是檸檬酸鈉緩沖液pH6. 5)，以保持操作恒定。在關(guān)節(jié)炎第4天結(jié)束動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)腳踝卡尺測(cè)量結(jié)果進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，用曲線下面積(AUC)、后爪末端重量和體重表示 (Bendele 等人 2000，Arthritis+Rheumatism 43:2648-2659)。所有動(dòng)物均存活至研究結(jié) 束。用KINERET1 或其載體(CSEP)注射的大鼠在注射過(guò)程中發(fā)出叫聲，從而表示發(fā)生皮下 刺激。任何其它注射沒(méi)有發(fā)出聲音。將動(dòng)物(關(guān)節(jié)炎組8/組，正常組4/組)，4只/籠，用異氟烷麻醉，并用包含2mg/ ml牛II類膠原(彈性蛋白產(chǎn)品，Owensville, Missouri)的300 μ 1 Freund不完全佐劑 (Difco,Detroit,MI)在尾巴根部和背部?jī)商?，在?天和第6天皮下/皮膚內(nèi)(SC/ID)注 射。通過(guò)皮下途徑施用(每隔24小時(shí)QD)在關(guān)節(jié)炎第1天開(kāi)始，并持續(xù)至第3天。實(shí)驗(yàn)組 示于表4中。表4 在關(guān)節(jié)炎的第0-4天為大鼠稱重，并從關(guān)節(jié)炎第0天(第9個(gè)研究日)開(kāi)始每天 進(jìn)行腳踝的卡尺測(cè)量。在最后一次體重測(cè)量后，使動(dòng)物無(wú)痛死亡，并在內(nèi)踝和外踝水平橫 切后爪，并稱重(兩次)。與用載體處理的疾病對(duì)照動(dòng)物相比，在用100mg/kg KINERET QD(d3-4)、120mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra QD (d2_4)或 120mg/kgGG-V17-TripT_ILlra QD(d3-4)處理的大鼠中見(jiàn)到腳踝直徑的明顯減小。與用載體處理的疾病對(duì)照動(dòng)物相比， 用 100mg/kg KINERET QD(34% ) U20mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra QD(54% )或 120mg/ kgGG-V17-TripT-ILlra QD(49 處理的大鼠中腳踝直徑AUC的減小非常明顯。與 KINERET QD處理相比，Met-I IO-TripT-ILlra QD處理使腳踝直徑AUC顯著減小(研究結(jié) 束時(shí)ρ < 0.035)。此外，與KINERET QD處理相比，研究結(jié)束時(shí)GG-V17-TripT-ILlra QD 處理使腳踝直徑AUC顯著減小(ρ < 0. 001)。(圖10)與用載體處理的疾病對(duì)照動(dòng)物相比，用100mg/kg KINERET QD (61 % )、120mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra QD (79% )或 120mg/kgGG-V17-TripT-ILlra QD (91% )處理的大鼠 中后爪重量的減小非常明顯。與KINERET QD處理相比，GG_V17-TripT_ILlra QD處理使 后爪重量顯著降低(圖11)。與用載體處理的疾病對(duì)照動(dòng)物相比，用100mg/kg KINERET QD (54% )、120mg/kg Met-IlO-TripT-ILlra QD (49% )或 120mg/kgGG-V17-TripT-ILlra QD (65% )處理的大鼠 體重的變化顯著朝正常情況增加。實(shí)施例6 鏈脲菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病模型對(duì)禁食C57BL/6J 雄性小鼠，以 50mg/kg i. p.每日施用一次 STZ(SigmaAldrich)， 連續(xù)五天。從第一天到第四天，小鼠逐漸發(fā)展出較高水平的血糖濃度。在STZ誘導(dǎo)期間，血 糖水平從6. 9nmol/L升至13. lnmol/L。在最后一次施用STZ后五天(第四天)，將小鼠隨 機(jī)分成10個(gè)處理組，每組包含正常狀況的10只小鼠。從這天起在糖尿病發(fā)作前開(kāi)始處理， 并繼續(xù)進(jìn)行至病發(fā)。處理組示于表5中。表 5 研究時(shí)間為28天，并且在處理期間，將小鼠每周稱重一次。在研究期間，每隔一 天測(cè)定血糖水平，以監(jiān)控糖尿病的發(fā)展。通過(guò)尾靜脈學(xué)收集一滴全血，并放在Ascensia ELITE .血糖測(cè)試條上，并用AscensiaELITE 血糖儀(Bayer)分析。記錄數(shù)值，并計(jì)算與 處理初期的水平相比任何指定組中增加的倍數(shù)。每天觀察臨床癥狀，或者在出現(xiàn)副作用癥 狀時(shí)進(jìn)行適當(dāng)觀察。如圖12所示，在以100和30mg/kg的劑量，每天i.p.施用IlO-TripT-ILl-Ra 或KINERET 后，均觀察到血糖水平顯著下降。此外，每周施用兩次100mg/kg IIO-TripT-ILlRa和每日施用100mg/kgKINERETl 同樣有效。這些數(shù)據(jù)證明三聚IL-IRa是 實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)糖尿病的有效治療手段。上述實(shí)驗(yàn)僅用于闡述目的，不意味著本發(fā)明所有可能實(shí)施方案、應(yīng)用或修改的窮 盡式列表。因此，在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明上述方法和系統(tǒng)的各種修 改和變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。盡管已經(jīng)于具體的實(shí)施方案一起描述了本 發(fā)明，但是可以理解的是，如所要求的權(quán)利，本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限定為這些具體的實(shí)施方案。 事實(shí)上，進(jìn)行本發(fā)明的所述模式的各種修改，其對(duì)于分子生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)或 相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，意欲落入所附權(quán)利要求的范圍中?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明不限定于本文所述的特定方法、方案和試劑等，因?yàn)檫@些變 化可以由技術(shù)人員識(shí)別。還可以理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定的實(shí)施方案， 不意欲限定本發(fā)明的范圍。還應(yīng)注意的是，如本文和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式包 括復(fù)數(shù)，除非明確指出。因此，例如，對(duì)于“接頭”的描述指一個(gè)或多個(gè)接頭，和本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的等同物。除非特別定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的意義相同。本發(fā)明的實(shí)施方案及其各種特色和優(yōu)勢(shì)細(xì)節(jié)參照非限定性實(shí)施方案 和/或附圖所述及下文所詳細(xì)指出的，更全面地進(jìn)行解釋。應(yīng)注意的是，附圖所闡述的特 點(diǎn)不需要按比例繪制，并且一個(gè)實(shí)施方案的特點(diǎn)可以如技術(shù)人員所識(shí)別的用于其它實(shí)施方 案，即使本文未明確說(shuō)明。本文引用的任何數(shù)值包括從較小值到較大值的以一個(gè)單位遞增的全部數(shù)值，只要任何較小值和較大值之間有至少兩個(gè)單位的間隔。作為實(shí)例，如果說(shuō)明組分的濃度或過(guò)程 變量的數(shù)值如，例如，尺寸、角度大小、壓力、時(shí)間等，為，例如，1-90，具體為20-80，更具體為 30-70，其意欲在這種規(guī)格中列舉數(shù)值如15-85，22-68，43-51，30-32等。對(duì)于小于一的數(shù) 值，適當(dāng)時(shí)認(rèn)為一個(gè)單位是0. 0001、0. 001、0. 01或0. 1。這些僅是具體意欲表示的實(shí)例，并 且最小值和最大值之間的數(shù)值的全部組合認(rèn)為以相似方式在本申請(qǐng)中表示。
描述了具體的方法、設(shè)備和材料，盡管于本文所述相似或等同的任何方法和材料 可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用。對(duì)于上文引用的所有參考文獻(xiàn)和出版物的公開(kāi)通過(guò)引 用全部并入本文，與各自單獨(dú)并入本文的程度相同。
權(quán)利要求
融合蛋白，其包含三聚域和可抑制IL-1活性的IL-1Ra多肽。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中由于保守氨基酸取代，IL-IRa多肽與SEQIDNO 38至 少 85%相同，并且包含 Trpl6、Gln20、Tyr34、Gln36 和 Tyrl47。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中IL-IRa多肽與SEQID NO 38至少95%相同。
4.權(quán)利要求2的融合蛋白，其還包含選自下組的至少一個(gè)突變D47N、E52R、E90Y、 P38Y、H54R、Q129L 和 M136N。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述三聚域源自人四連蛋白。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述三聚域是四連蛋白三聚結(jié)構(gòu)元件。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述三聚域與SEQID NO 1至少66%相同。
8.包含三個(gè)權(quán)利要求5的融合蛋白的三聚復(fù)合物，其中所述融合蛋白相同或不同。
9.包含三個(gè)權(quán)利要求6的融合蛋白的三聚復(fù)合物，其中所述融合蛋白相同或不同。
10.權(quán)利要求1的融合蛋白，其還包括聚乙二醇。
11.權(quán)利要求1的融合蛋白，其還包括IL-IRa多肽和三聚域之間的接頭。
12.包含三個(gè)融合蛋白的三聚復(fù)合物，其中每個(gè)融合蛋白包含權(quán)利要求1的 融合蛋白，并且其中至少一個(gè)融合蛋白選自下組=TripK-IL-Ira (SEQ ID NO 39)； TripV-IL-Ira (SEQ ID NO 40) ；TripT-IL-Ira(SEQ ID NO 41) ；TripQ-IL-Ira (SEQ ID NO 42) ；I10-TripK-IL-lra(SEQ ID NO 43) ； I IO-TripV-IL-lra(SEQ IDNO 44) ；I10-TripT-IL-lra(SEQ ID NO 45) ； 110-TripQ_IL-Ira(SEQ ID NO: 46) ；V17-TripT-ILlRa(SEQ ID NO :55) ;V17-TripK-IL_lRa(SEQ ID NO 56)； V17-TripV-IL-lRA(SEQ ID NO 57)和 V17_TripQ_ILlRA(SEQ ID NO :58)。
13.編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的多核苷酸。
14.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的載體。
15.包含權(quán)利要求14的載體的宿主細(xì)胞。
16.包含權(quán)利要求1的融合蛋白和至少一種可藥用的賦形劑的藥物組合物。
17.包含權(quán)利要求7的三聚復(fù)合物和至少一種可藥用的賦形劑的藥物組合物。
18.治療由白介素1介導(dǎo)的疾病的方法，包括對(duì)有需要的患者施用權(quán)利要求17的藥物 組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病是炎癥性疾病。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述炎癥性疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述炎癥性疾病是糖尿病。
22.權(quán)利要求19的方法，其還包括同時(shí)或順序向患者施用抗炎劑。
23.權(quán)利要求1的融合蛋白，其還包含與融合蛋白共價(jià)連接的抗炎劑。
24.權(quán)利要求19的方法，其中至少一個(gè)融合蛋白與抗炎劑共價(jià)連接。
25.包含至少兩個(gè)權(quán)利要求1的融合蛋白的多肽復(fù)合物。
26.權(quán)利要求25的多肽復(fù)合物，其包含至少四個(gè)所述融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明包括融合蛋白的白介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)，所述融合蛋白包含三聚域和IL-1Ra多肽序列。所述融合蛋白是三聚復(fù)合物的一部分，所述復(fù)合物可用在治療由IL-1介導(dǎo)的疾病的藥物組合物中。本發(fā)明描述了對(duì)炎癥性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病的有效治療。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101889022SQ200880119741
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日
發(fā)明者米凱爾·H·安德森, 索爾·L·霍爾蒂特, 約瑟夫斯·D·尼蘭 申請(qǐng)人:阿納福公司