專利名稱：重組TRAIL-Fc融合蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及TRAIL-Fc融合蛋白設(shè)計技術(shù)及蛋白表達(dá)純 化技術(shù)，涉及融合蛋白作為腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)，即腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋 亡誘導(dǎo)配體，是TNF超家族中的一員。人TRAIL為一 II型跨膜蛋白，即其C端位于膜外， 而N端位于胞內(nèi)。TRAIL由281個氨基酸組成，分子量為32KD，其胞外區(qū)由243個氨基酸組 成。TRAIL的生理功能為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，雖然TRAIL在許多正常細(xì)胞如心肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 脾細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞和小腸細(xì)胞等均有表達(dá)，但它僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞凋亡，包括腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、白血病、皮膚癌和 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL胞外區(qū)即能行使其生理功能。通過對其胞外區(qū)的 深入研究，發(fā)現(xiàn)許多截短了的胞外區(qū)也具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞如TRAIL95—281 、 TRAL112—281、 TRAIL114—281等，目前TRAIL114—281(AMG655)正在由美國Amgen公司進(jìn)行臨床試驗。
但由于TRAIL在血漿內(nèi)的半衰期只有30分鐘左右，癌癥患者需要每天給藥且給藥 劑量較大(15mg/kg/d)，故有必要延長其在血漿內(nèi)半衰期。重組TRAIL目前均采用大腸桿菌 表達(dá)體系制備，表達(dá)產(chǎn)物是多聚體形式，需要復(fù)性后才具有促腫瘤細(xì)胞凋亡作用。
人IgGlFc為抗體重鏈的絞鏈區(qū)(Hinge)和補體結(jié)合區(qū)(CH2、 CH3)。在重組藥品 的開發(fā)中，通常將其與目的蛋白融合以增加目的蛋白的半衰期。首個獲準(zhǔn)上市的選擇性共 剌激調(diào)節(jié)劑類生物制劑阿巴昔普(Abatac印t)(百時施貴寶公司)即是由人細(xì)胞毒T淋巴 細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)胞外域與人免疫球蛋白IgGl(IgGl)Fc段兩部分結(jié)合而成的一種可 溶性融合蛋白。融入了 IgGlFc后，半衰期達(dá)到兩周。 已證明TRAIL是以其同源二、三聚體的形式發(fā)揮作用。由于在IgGlFc絞鏈區(qū)存在 三個半胱氨酸，IgGlFc極易形成二聚體，當(dāng)目的蛋白與之融合后容易形成二聚體或多聚體。 TRAIL目的蛋白與IgGlFc融合后生物活性會得到提高，半衰期會顯著延長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種具有分子量大、活性高和半衰期長的二聚或三聚體人 TRAIL-Fc融合蛋白。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)該融合蛋白的方法，所述方法為哺乳動物 CH0-kl細(xì)胞表達(dá)。該方法產(chǎn)生的TRAIL-Fc融合蛋白為二聚或三聚體，其純化方法簡單，純 度高，生物活性強。 本發(fā)明的另一目的在于提供該融合蛋白在作為腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的融合蛋白是一個含400個氨基酸的蛋白，該蛋白等電點pl = 8. 34，理論分子量為45535. 30，其氨基酸序列為Seql。 TRAIL-Fc序列中從1_168位為 TRAIL114-281 ，從169-183位為改造過的IgGlFc絞鏈區(qū)，從184-293位為IgGlFc的CH2區(qū)，從294-400位為IgGlFc的CH3區(qū)。
技術(shù)方案 1、構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒pSecTag2A-TRAIL-Fc。 2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，篩選陽性克隆，提取到的質(zhì)粒用HindIII和EcoRI雙酶切鑒定、測序鑒定。結(jié)果證明所得到的陽性克隆與設(shè)計的完全一致。
3、中量提取重組質(zhì)粒pSecTag2A-TRAIL-Fc備用。 4、將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，371:，5% C02培養(yǎng)三天后收集培養(yǎng)上清。用DotBlot和Western Blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況。 5、將重組質(zhì)粒用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染CHO-kl細(xì)胞，以250 y m/mL的Zeocine進(jìn)行加壓篩選，用DotBlot篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)，Western Blot鑒定后，對培養(yǎng)上清進(jìn)行鎳柱親和層析純化，腸激酶酶切，Protein A柱親和層析純化。
6、所得樣品進(jìn)行誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實驗。
7、所得樣品進(jìn)行荷瘤小鼠腫瘤抑制實驗。


附圖l重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，目的基因為載體都經(jīng)HindlII+EcoRI雙酶切后，用T4DNA連接酶連接。 附圖2重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定。1 :pSectag2A，2、3、4 :待測克隆質(zhì)粒，M :DNAMarker。重組質(zhì)粒經(jīng)HindlII+EcoRI雙酶切后，3、4號克隆質(zhì)粒出現(xiàn)一 1. 2kb條帶和一5. 2kb條帶，1. 2kb條帶為目的基因，5. 2kb條帶為載體片段，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
附圖3DotBlot實驗結(jié)果，將瞬時表達(dá)的上清點于PVDF膜，用小鼠抗His-Tag做一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP做二抗，化學(xué)發(fā)光底物顯影柯達(dá)底片。"E"為瞬時表達(dá)結(jié)果，"+ "為陽性對照，"_"為陰性對照。結(jié)果表明有目的蛋白表達(dá)。 附圖4Western Blot實驗，將瞬時表達(dá)的上清點于PVDF膜，用小鼠抗His-Tag做一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP做二抗，化學(xué)發(fā)光底物顯影柯達(dá)底片。1 :樣品通過非還原處理；
2 :樣品通過還原處理；3 :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明目的蛋白自然情況下以聚合體形式存在，在還原情況下以單體形式存在，分子量與理論分子量吻合。 附圖5PBS、 TRAIL114—281和本發(fā)明的TRAIL-Fc處理后的腫瘤大小比較，本發(fā)明的TRAIL-Fc每周注射一次可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長，P < 0. 01。
具體實施例方式
實施例1，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒pSecTag2A-TRAIL-Fc的構(gòu)建。
為了便于純化，在TRAIL-Fc的前面加上標(biāo)簽His X 6_GGGS_DDDDK， GGGS為連接肽，DDDDK為腸激酶切位點，從而形成His X 6-GGGS-DDDDK_TRAIL114—281_Fc序列。cDNA序列的前后酶切位點分別為HindIII和EcoRI。該序列采用人工全合成方式合成，其序列見Seq4。將Seq4和pSecTag2A都經(jīng)HindiII和EcoRI雙酶切后，連接構(gòu)成pSecTag2A-TRAIL-Fc，見附圖1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑取陽性克隆在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做HindlII+EcoRI雙酶切鑒定，見附圖2。進(jìn)一步進(jìn)行DNA測序鑒定。
實施例2， TRAIL-Fc的表達(dá)
1. TRAIL-Fc的瞬時表達(dá)。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，37t:，5% C02培養(yǎng)三天后收集培養(yǎng)上清。用小鼠抗His-Tag抗體做一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP做二抗進(jìn)行DotBlot和Western Blot檢測，以判斷目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見附圖3。
2. TRAIL-Fc在CHO-k細(xì)胞的表達(dá)。確定CH0_k細(xì)胞的Zeocine耐受濃度后用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至CH0-k細(xì)胞，加Zeocine篩選，吸取相應(yīng)細(xì)胞克隆內(nèi)的培養(yǎng)基做DotBlot和Western Blot檢測，取陽性克隆做逐級放大培養(yǎng)至10層CellFactory,用不含谷氨酰胺的匿EM培養(yǎng)一周后換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，收取上清。
實施例3， TRAIL-Fc的純化 將培養(yǎng)上清用超濾法濃縮、置換緩沖液至10mM Tris， lOOmM NaCl (pH 7.2);Ni-Chelating S印harose FF層析柱經(jīng)10mM Tris， lOOmM NaCl (pH 7.2)平衡后上樣，再平衡至基線；用含100mM咪唑，10mM Tris， lOOmM NaCl (pH7. 2)緩沖液洗脫目的蛋白。蛋白洗脫液加腸激酶(1 : 500質(zhì)量比)消化，酶切后樣品經(jīng)Protein A-Agarose層析柱(10mM PB緩沖，pH 7.4)吸附后，用O. 1M Gly(pH 3. 0)緩沖液洗脫目的，收集目的峰時邊收邊加2MTris(pH 7.2)(總量約1/10洗脫體積)中和。透析目的蛋白緩沖液至PBS。
實施例4， TRAIL-Fc殺傷體外腫瘤細(xì)胞實驗 將純化的TRAIL-Fc按100、25、6. 25、 1. 56、0. 39和0. 09ng/mL的濃度處理各種不同的腫瘤細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系(人宮頸癌細(xì)胞)、KU-8細(xì)胞系(人陰莖癌細(xì)胞)、U937細(xì)胞系(人髓樣白血病細(xì)胞)、IM-9細(xì)胞系(人骨髓瘤細(xì)胞)、A549細(xì)胞系(人肺癌細(xì)胞)、MCF-7細(xì)胞系(人乳腺癌細(xì)胞)和Jurkat細(xì)胞系(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)，作用48小時后以MTT法染色，測定570nm吸收值。結(jié)果證明，TRAIL-Fc具有廣泛的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，其中，Jurkat細(xì)胞系和MCF-7細(xì)胞系對TRAIL-Fc的敏感性最高。誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞50%凋亡率的TRAIL-Fc蛋白濃度在2ng/mL左右。
表1TRAIL-Fc對各種腫瘤細(xì)胞的最大抑制率
細(xì)胞系抑制率(％)
TRAIL-Fc
Hela85%
KU-878%
U93783%
IM-981%
A54990%
MCF-794%
Jurkat98% 實施例5， TRAIL-Fc殺傷小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞實驗 實驗用動物Balb/C小鼠，共18只，分成三組，每組6只，一組為PBS陰性對照，一組為TRAIL114—281處理組，另一組TRAIL-Fc處理組。將體外培養(yǎng)的小鼠S180瘤細(xì)胞(4X 106/只)背部皮下注射，同時，皮下注射TRAIL114—281 (100 ii g/只)、TRAIL-Fc (234 y g/只，摩爾比
6相等)或PBS。 TRAIL-Fc每周注射一次，TRAIL114—281每天給藥一次。4周后處死小鼠，測量形成腫瘤的大小和重量，結(jié)果顯示，PBS組的背部均有腫瘤生長，大小均勻；TRAIL114—281組小鼠有三只背部未長腫瘤，二只腫瘤較小，一只腫瘤較大；TRAIL-Fc組小鼠有三只背部未長腫瘤，三只較小。統(tǒng)計學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)TRAIL-Fc每周給藥一次能顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長，P < 0. 01。證明本發(fā)明的TRAIL-Fc具有體內(nèi)長效抗腫瘤作用。序列表〈110〉重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司〈120〉重組TRAIL-Fc §改合蛋白及其制備和應(yīng)用〈130>a〈160>3〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>400〈212>PRT〈213〉人〈400>1ValArgGluArgGlyProGinArgValAlaAlaHislieThrGlyThr151015ArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLys202530AlaLeuGlyArgLyslieAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHis354045SerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGluLeuVallieHis505560GluLysGlyPheTyrTyrlieTyrSerGinThrTyrPheArgPheGin65707580GluGlulieLysGluAsnThrLysAsnAspLysGinMetValGinTyr859095lieTyrLysTyrThrSerTyrProAspProlieLeuLeuMetLysSer100105110AlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGluTyrGlyLeuTyrSer115120125lieTyrGinGlyGlyliePheGluLeuLysGluAsnAspArgliePhe130135140ValSerValThrAsnGluHisLeulieAspMetAspHisGluAlaSer145150155160PhePheGlyAlaPheLeuValGlyGluProLysSerCysAspLysThr165170175HisThrSerProProSerProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSer
180185190ValPheLeuPhe Pro ProLys Pro Lys AspThr Leu Met lie SerArg195200205ThrProGluVal Thr CysVal Val Val AspVal Ser His Glu AspPro210215220GluValLysPhe Asn TrpTyr Val Asp GlyVal Glu Val His AsnAla225230235240LysThrLysPro Arg GluGlu Gin Tyr AsnSer Thr Tyr Arg ValVal245250255SerValLeuThr Val LeuHis Gin Asp TrpLeu Asn Gly Lys GluTyr260265270LysCysLysVal Ser AsnLys Ala Leu ProAla Pro lie Glu LysThr275280285lieSerLysAla Lys GlyGin Pro Arg GluPro Gin Val Tyr ThrLeu290295300ProProSerArg Asp GluLeu Thr Lys AsnGin Val Ser Leu ThrCys305310315320LeuValLysGly Phe TyrPro Ser Asp lieAla Val Glu Trp GluSer325330335AsnGlyGinPro Glu AsnAsn Tyr Lys ThrThr Pro Pro Val LeuAsp340345350SerAspGlySer Phe PheLeu Tyr Ser LysLeu Thr Val Asp LysSer355360365ArgTrpGinGin Gly AsnVal Phe Ser CysSer Val Met His GluAla370375380LeuHisAsnHis Tyr ThrGin Lys Ser LeuSer Leu Ser Pro GlyLys385390395400〈210>2〈211>15〈212>PRT〈213〉人工合成〈400>2Glu Pro LysSer Cys AspLys Thr His ThrSer Pro Pro Ser Pro151015〈210>3〈211>15〈212>PRT〈213〉人工合成〈400>3
His His His His His His Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys 15 10 15 重組TRAILFc專利中的核酸及氨基酸序列中文版.ST25 His His His His His His Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys 15 10 15
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權(quán)利要求
一種重組TRAIL-Fc蛋白，其特征在于該蛋白是一個融合蛋白，由TRAIL114-281氨基酸序列與人IgG1Fc的CH2和CH3片段融合。
2. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，該氨基酸序列為Seql :VALARGGLUARGGLYPROGLNARGVALALAALAHISILETHRGLYTHRARGGLYARGSERASNTHRLEUSERSERPROASNSERLYSASNGLULYSALALEUGLYARGLYSILEASNSERTRPGLUSERSERARGSERGLYHISSERPHELEUSERASNLEUHISLEUARGASNGLYGLULEUVALILEHISGLULYSGLYPHETYRTYRILETYRSERGLNTHRTYRPHEARGPHEGLNGLUGLUILELYSGLUASNTHRLYSASNASPLYSGLNMETVALGLNTYRILETYRLYSTYRTHRSERTYRPROASPPROILELEULEUMETLYSSERALAARGASNSERCYSTRPSERLYSASPALAGLUTYRGLYLEUTYRSERILETYRGLNGLYGLYILEPHEGLULEULYSGLUASNASPARGILEPHEVALSERVALTHRASNGLUHISLEUILEASPMETASPHISGLUALASERPHEPHEGLYALAPHELEUVALGLYGLUPROLYSSERCYSASPLYSTHRHISTHRSERPROPROSERPROALAPROGLULEULEUGLYGLYPROSERVALPHELEUPHEPROPROLYSPROLYSASPTHRLEUMETILESERARGTHRPROGLUVALTHRCYSVALVALVALASPVALSERHISGLUASPPROGLUVALLYSPHEASNTRPTYRVALASPGLYVALGLUVALHISASNALALYSTHRLYSPROARGGLUGLUGLNTYRASNSERTHRTYRARGVALVALSERVALLEUTHRVALLEUHISGLNASPTRPLEUASNGLYLYSGLUTYRLYSCYSLYSVALSERASNLYSALALEUPROALAPROILEGLULYSTHRILESERLYSALALYSGLYGLNPROARGGLUPROGLNVALTYRTHRLEUPROPROSERARGASPGLULEUTHRLYSASNGLNVALSERLEUTHRCYSLEUVALLYSGLYPHETYRPROSERASPILEALAVALGLUTRPGLUSERASNGLYGLNPROGLUASNASNTYRLYSTHRTHRPROPROVALLEUASPSERASPGLYSERPHEPHELEUTYRSERLYSLEUTHRVALASPLYSSERARGTRPGLNGLNGLYASNVALPHESERCYSSERVALMETHISGLUALALEUHISASNHISTYRTHRGLNLYSSERLEUSERLEUSERPROGLYLYS
3. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于人IgGlFc其絞鏈區(qū)第一個氨基酸由纈氨酸Val突變?yōu)楣劝彼酖lu，在整個鉸鏈區(qū)中只保留一個半胱氨酸Cys，其后兩個Cys分別用Ser替代，其絞鏈區(qū)序列為Seq2:GLU PRO LYS SER CYS ASP LYS THR HIS THR SER PRO PRO SER PRO
4. 權(quán)利要求l所述的融合蛋白，在表達(dá)設(shè)計中，成熟蛋白前面引入純化標(biāo)簽HisX6、連接肽GGGS和蛋白酶切位點DDDDK，其序列為Seq3 :HIS HIS HIS HIS HIS HIS GLY GLY GLY SER ASP ASP ASP ASP LYS
5. 權(quán)利要求l所述的融合蛋白所對應(yīng)的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
7. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞CHO細(xì)胞中的表達(dá)。
8. 權(quán)利要求7中的表達(dá)上清，經(jīng)超濾、鎳親和層析、腸激酶酶切和Protein A親和層析的純化工藝。
9.權(quán)利要求1所述的的融合蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白的設(shè)計技術(shù)及蛋白表達(dá)純化技術(shù)，涉及融合蛋白作為腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的特征在于將腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)第114-281位氨基酸與人IgG1Fc融合。融合后的蛋白由400個氨基酸組成，等電點pI＝8.34，理論分子量為45535.30。該蛋白以二聚體或三聚存在，能夠顯著誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，殺死或/和抑制動物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長。與TRAIL相比，本發(fā)明的TRAIL-Fc融合蛋白具有分子量大，活性高，體內(nèi)半衰期長，由哺乳動物細(xì)胞CHO表達(dá)的優(yōu)勢，可作為腫瘤治療藥物。
文檔編號A61P35/00GK101717449SQ20081023282
公開日2010年6月2日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者俞超, 馮強, 范開, 陳勇, 陳海容, 高劍坤 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司