專利名稱：含有g(shù)lp-1的融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病相關(guān)的藥物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有延長(zhǎng)的胰高血糖素樣肽類的體內(nèi)半衰期的融合蛋白。本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法以及其在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的GLP-I (glucagon-lik印印tide-Ι，以下簡(jiǎn)稱GLP_1)是主要由小腸 L細(xì)胞分泌的一種37個(gè)氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-I (7-37) OH和GLP-I (7-36) NH2 (Mojsov S, J Clin Invest. 1987Feb ；79 (2) :616-9)。GLP-I 明顯減低人用餐后的血糖， 能刺激胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)還能起到一定減肥效應(yīng)，并且不會(huì)引起低血糖癥(Drucker D J， Diabetes. 1998Feb ；47 (2) :159-69)。近期研究還表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec ； 144(12) :5145-8)。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘。針對(duì) GLP-I肽的治療用途，來(lái)自蜥蜴唾液的人的GLP-I類似物Exendin-4的合成物Exenatide， 2005年在美國(guó)作為降糖藥上市，血中的半衰期到2. 5小時(shí)左右，需要每天在早飯及晚飯前注射給藥。每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便，因此，延長(zhǎng)GLP-I類似物的體內(nèi)時(shí)間對(duì)于方便臨床應(yīng)用具有重要的意義。目前已經(jīng)有不少研究采用GLP-I類似物融合蛋白技術(shù)解決GLP-I類似物在體內(nèi)的存留時(shí)間(CN90101167. 3、CN200710018734. 2、CN200410054397. 9、CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、CN200510039265. 3、CN200610127237. 1、CN200910009642. 7)，然而，現(xiàn)
有的技術(shù)與臨床理想的目標(biāo)還有很大距離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白，該融合蛋白具有GLP-I或其類似物 Exendin-4的活性，并且在體內(nèi)的存留時(shí)間長(zhǎng)，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中GLP-I或Exendin-4需要每天多次注射給藥的缺陷。本發(fā)明的另一目的是提供編碼該融合蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的重組載體以及包含該重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備該融合蛋白的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該融合蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含所述融合蛋白有效成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽_GLP_1_連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-1(I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自人血清白蛋白(HSA)或IgG的Fc片段。優(yōu)選地，所述人源蛋白為HSA。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的核酸序列，包含該核酸序列的重組載體，以及包含該重組載體的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供一種上述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括在表達(dá)可檢測(cè)量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯上述核酸序列的步驟。具體來(lái)說(shuō)，上述融合蛋白的制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建所述融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟2、的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。又一方面，本發(fā)明提供了上述的融合蛋白、核酸序列、重組載體或宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。優(yōu)選地，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的目的對(duì)本發(fā)明逐一加以描述。本發(fā)明的通式I的融合蛋白如下述所示GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽_GLP_1_連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-1通式I其中，連接肽優(yōu)選為含有5個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，序列為GGGGS (SEQ IDNO 5)；GLP-I 的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)為:'-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-36人源蛋白為人血清白蛋白或IgG Fc部分。本發(fā)明的通式I的GLP-I融合蛋白是通過(guò)下述方法制備的構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA 本發(fā)明中的融合蛋白可以從各種來(lái)源獲得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如這些蛋白可以從由表達(dá)野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)獲得。本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法對(duì)相關(guān)的融合蛋白的mRNA進(jìn)行篩選，通過(guò)公開(kāi)的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列設(shè)計(jì)引物。本發(fā)明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)優(yōu)選來(lái)源于天然人序列，以減少融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性危險(xiǎn)。本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開(kāi)序列設(shè)計(jì)PCR引物，從人血RNA中釣取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I的DNA 本發(fā)明參考專利CN1363654A中GLP-1中雙鏈DNA全長(zhǎng)的合成方法，進(jìn)行GLP-I雙鏈DNA全長(zhǎng)的合成。本發(fā)明中GLP-I經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的DNA測(cè)序進(jìn)行序列驗(yàn)證。構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I融合蛋白載體利用本領(lǐng)域常規(guī)的PCR突變技術(shù)制備連接有連接短肽的GLP-I用以與蛋白表達(dá)質(zhì)粒的連接。連接技術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明利用PCR將含有連接肽的GLP-I與蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)T4連接酶進(jìn)行連接，得到本發(fā)明中所有融合蛋白的表達(dá)載體。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來(lái)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。隨汰本劍月_輔_一細(xì)去用本發(fā)明中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，用于表達(dá)融合蛋白。參考本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)化本發(fā)明中各種融合蛋白的表達(dá)，用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的原則、技術(shù)(例如培養(yǎng)基、溫度、PH 等)可以參見(jiàn) MammalianCell Biotechnology :A Practical Approach, Μ. Butler。本發(fā)明中的GLP-I融合蛋白的表達(dá)采用本領(lǐng)域常規(guī)的Iac啟動(dòng)子大腸桿菌融合蛋白表達(dá)技術(shù)，使用IPTG啟動(dòng)GLP-I融合蛋白的產(chǎn)生。本發(fā)明融合蛋白的純化:一旦本發(fā)明的融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分離和純化技術(shù)對(duì)本發(fā)明中的融合蛋白進(jìn)行純化。例如根據(jù)融合蛋白表達(dá)載體內(nèi)的標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白的粗提純。本發(fā)明中，純化后的融合蛋白可以通過(guò)超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋白經(jīng)過(guò)紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。本發(fā)明的融合蛋白的表征本發(fā)明中，可以用許多方法表征本發(fā)明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色偶聯(lián)的SDS-PAGE或免疫印跡技術(shù)。本發(fā)明中的融合蛋白通過(guò)免疫印跡的鑒定，例如使用GLP-I的抗體。本發(fā)明的組合物本發(fā)明所的GLP-I融合蛋白，可以與一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料共同制成藥物組合物，這些輔料包括水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等。該藥物組合物可以通過(guò)肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射途經(jīng)進(jìn)行給藥，優(yōu)選的劑型為凍干或溶液注射劑；本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一種或幾種的組合；PH調(diào)節(jié)劑包括枸櫞酸、磷酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨；碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銨鹽、碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸和堿及鹽等一種或幾種的組合；穩(wěn)定劑包括EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。滲透壓調(diào)節(jié)劑包括氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。本發(fā)明提供包含所述融合蛋白的注射制劑，所述注射制劑的制備可以示范性參考以下步驟(1)凍干劑取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得。
(2)溶液注射液取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得。本發(fā)明所的GLP-I融合蛋白具有更長(zhǎng)的體內(nèi)存留時(shí)間，可作為有效成分制備糖尿病治療藥物。其在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的，劑量可由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來(lái)決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)，癥狀的嚴(yán)重程度等。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明活性成分的有效量lX10_7-20mg/kg/天，可以單劑量給藥或分劑量給藥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的存留時(shí)間較長(zhǎng)，避免了同類產(chǎn)品在用于治療時(shí)需要每天多次注射給藥的缺陷，便于臨床應(yīng)用。2、本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選來(lái)源于人的天然序列，減少了融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。3、本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)濃縮至藥用濃度，作為藥物有效成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體等組分制備成藥用組合物，用于糖尿病及肥胖癥等疾病和相關(guān)病癥或疾病的治療中。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，其中圖1顯示了融合蛋白免疫印跡結(jié)果，其中1為GLP_1，2為融合蛋白的GLP-I免疫印跡，3為融合蛋白的HSA免疫印跡；圖2顯示了本發(fā)明的融合蛋白的降血糖功能；圖3顯示了本發(fā)明的融合蛋白的克隆載體構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1 人血清白蛋白編碼DNA的構(gòu)建本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白的公開(kāi)序列設(shè)計(jì)PCR引物(SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2)，從人血RNA中釣取人血清白蛋白的mRNA。在進(jìn)行人血清白蛋白mRNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)PCR引物使人血清白蛋白的編碼DNA末端含有適合與載體連接的酶切位點(diǎn) (KPnI-HSA-NotI)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。SEQ ID NO 1 5TTATA GGT ACC A AG TGG GTA ACC TTT ATT TCCCTT3SEQ ID NO 2 5AATTAT GCG GCC GC TAA GCC TAA GGC AGC TTGACT3將PCR產(chǎn)物進(jìn)行KpnI/NotI雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行純化以去除內(nèi)切酶。實(shí)施例2 :“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-” 編碼 DNA 的構(gòu)建
本專利采用全基因合成方法制備編碼“ GLP-1-GGGGS-GLP-1 _GGGGS_GLP_ 1-GGGG S-”的雙鏈DNA，基因序列為SEQ ID N03。本實(shí)施例中合成的編碼DNA具有以下特征1、5， 端具有NdeI酶切位點(diǎn)，其用于與表達(dá)載體pETMb連接；2、3’端具有KpnI酶切酶切位點(diǎn)， 其用于與HSA的5’端連接。SEQ ID NO 3 5TATATCATATGCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCGGTACCATATT3將產(chǎn)物進(jìn)行(Ndel/Kpnl)雙酶切，并進(jìn)行純化。純化后的DNA與實(shí)例例1中的 HSA(KpnI/NotI酶切后)利用T4連接酶進(jìn)行連接，由此構(gòu)建完畢GLP-1_GGGGS_GLP_I-GGGG S-GLP-I-GGGGS-HSA。實(shí)施例3 “-GGGGS-GLP-l-GGGGS-GLP-l-GGGGS-GLP-l” 編碼 DNA 的構(gòu)津本專利采用全基因合成方法制備編碼“ -GGGGS-GLP-1 _GGGGS_GLP_ 1-GGGGS-GL P-I”的雙鏈DNA，基因序列為SEQ ID NO 4。本實(shí)施例中合成的編碼DNA具有以下特征1、 5’端具有NotI酶切位點(diǎn)，其用于與HSA的3’端連接端；2、3’具有BamHI酶切位點(diǎn)，其用于與表達(dá)載體PETMb連接。SEQ ID NO 4 5TAATTTAGCGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCTAATAAGGATCCATTGATT3將產(chǎn)物進(jìn)行(Notl/BamHI)雙酶切，并進(jìn)行純化。純化后的DNA與實(shí)施例2中的G LP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA 利用 T4 連接酶進(jìn)行連接。由此“ GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS—GLP-1 -GGGGS—HSA—GGGGS—GLP-1-GGGGS—GLP-1 -GGGGS-GLP-1 ” 構(gòu)建完畢。實(shí)施例4 構(gòu)建本發(fā)明中GLP-I融合蛋白表汰載體及融合蛋白的純化將表達(dá)質(zhì)粒pETMb進(jìn)行雙酶切(Ndel/BamHI)，然后與實(shí)施例4中的產(chǎn)物通過(guò) Ndel/BamHI酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來(lái)傳染大腸桿菌，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。 將構(gòu)建完畢的 pETMb [GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-I-GGGG
7S-GLP-l-GGGGS-GLP-1](命名為pET15b6GLPlHSA，示意圖見(jiàn)圖3)以熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入 BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，熱擊轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。將轉(zhuǎn)化后的融合蛋白表達(dá)載體在含有氨芐青霉素抗生素的LB培養(yǎng)平皿上培養(yǎng)篩選具有氨芐青霉素抗性的細(xì)胞。將得到的具有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒提取及純化，質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定完全正確。將過(guò)夜的菌液1 100比例以LB新鮮培養(yǎng)基稀釋，37°C培養(yǎng)菌液直至0D600達(dá)到 0.6，使用IPTG啟動(dòng)融合蛋白的表達(dá)，并將體系溫度降至25°C。融合蛋白表達(dá)16小時(shí)后，將菌液離心，收集后，超聲波破碎菌體，操作程序?yàn)閐Ocycles，15秒/cycle。將破碎后的菌液高速離心，上清液被注入鎳柱。用鎳柱捕獲含6XHIS標(biāo)簽的融合蛋白，并利用咪唑的濃度梯度對(duì)融合蛋白進(jìn)行洗脫。將洗脫的蛋白收集，利用具有IOkDa半透膜的離心管對(duì)收集的蛋白進(jìn)行透析及濃縮。凝血酶處理純化后的融合蛋白用來(lái)切除N末端的6XHIS標(biāo)簽，凝血酶的酶切技術(shù)參考hvitrogen公司的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。利用GelFiltration S-200蛋白純化柱進(jìn)行反應(yīng)混合物的分離，同時(shí)對(duì)目標(biāo)融合蛋白進(jìn)行精純。上述純化后的融合蛋白經(jīng)IOK過(guò)濾膜過(guò)濾濃縮后，紫外線滅菌處理。實(shí)施例5 =GLP-I融合蛋白的免疫印跡鑒定用含1 % SDS和2mg溴酚藍(lán)的PBS稀釋純化后的融合蛋白。煮沸變性后，取20 μ 1 樣品置SDS-PAGA膠上，電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉溫室封閉2小時(shí)，加入鼠抗人GLP-I的單抗(SantaCruz，USA)室溫下孵育1小時(shí)，然后用HRP標(biāo)記的兔抗鼠的多抗進(jìn)行二抗結(jié)合，用ECL試劑盒發(fā)光顯色(Amersham Pharmacia Biotech，USA)。結(jié)果如圖1所示本發(fā)明的融合蛋白得到了較好的表達(dá)。^mm 6 ^m^^mm^m^mmm^取實(shí)施例5的融合蛋白10mg，穩(wěn)定劑精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置于容器中，加注射用水80ml，攪拌使溶解，再加入甘露醇Sg、山梨醇2g，攪拌使溶解，以0. lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 0-8. 0，補(bǔ)加水至100ml。加入0. 3g活性碳，在10-25°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液按每支Iml進(jìn)行分裝。預(yù)凍2小時(shí)后，冷凍下減壓干燥18小時(shí)，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時(shí)，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格IOOug/支。 ^mm τ ^m^^mm^m^mmm^取實(shí)施例5的融合蛋白25mg，加穩(wěn)定劑磷酸氫二鉀0. 05g，氯化鈉0. 9g，置于容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g攪拌使溶解，用0. lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 5-8. 5，補(bǔ)加水至100ml，加入0. 25g活性碳，在10_20°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液按每支2ml進(jìn)行分裝，預(yù)凍2小時(shí)后，冷凍下減壓干燥15 小時(shí)，至樣品溫度到15-20°C后，再干燥5小時(shí)，制得白色疏松塊狀物，封口即得白色凍干粉針，規(guī)格500ug/支。^mm 8 -.^m^m^mmm^mmmmmm^取實(shí)施例5的融合蛋白50mg，加入穩(wěn)定劑三羥甲基氨基甲烷0.2g，焦亞硫酸鈉 0. lg、氯化鈉0. 9g至容器中，加注射用水80ml中攪拌溶解，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH為6_8，補(bǔ)加水至100ml，加入0. 2g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，規(guī)格IOOOug/支。
實(shí)施例9 含融合蛋白的藥物組合物溶液制劑的制備取實(shí)施例5的融合蛋白5mg，穩(wěn)定劑谷氨酸O.Olg、氯化鉀0.09g至容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖Ig攪拌溶解。加氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為7. 0-8.5， 補(bǔ)加水至100ml，加入0. 05g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，以每支Iml灌封、即得融合蛋白注射液，規(guī)格50ug/支。實(shí)施例10 融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)給大鼠注射GLP-I及其融合蛋白(折合含GLP-I為0. 5mg/kg)，分別于注射前及注射后0. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時(shí)后于眼叢靜脈取血約0. 2ml，制備血清備用。GLP-I濃度測(cè)定方法采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中融合蛋白的濃度，操作如下4°C離心分離血漿。用羊抗鼠的GLP-I濃度測(cè)定試劑盒(R&D System Co.，Ltd)對(duì)鼠血漿中的GLP-I融合蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定。將1 1稀釋后的鼠血漿樣品加入96孔板，加入同體積的GLP-I抗體后，37°C孵育1小時(shí)。使用洗液清洗96孔板3次， 加入HRP后孵育30分鐘。同樣的方法對(duì)96孔板進(jìn)行清洗，然后加入50 μ 1底物A及底物 B，37°C孵育10分鐘。用硫酸中止反應(yīng)后測(cè)定450-570nm值，并與標(biāo)準(zhǔn)濃度的GLP-I進(jìn)行比對(duì)及根據(jù)ELISA結(jié)果計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的半衰期較單獨(dú)的GLP-I明顯延長(zhǎng)，具有長(zhǎng)效特性。表1融合蛋白在大鼠體內(nèi)的末相半衰期
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I-連接肽-GLP-I(I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源蛋白為HSA。
3.編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列。
4.包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸序列的重組載體。
5.包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括在表達(dá)可檢測(cè)量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求3所述的核酸序列的步驟。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟幻的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白、權(quán)利要求3所述的核酸序列、權(quán)利要求4所述的重組載體或權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的GLP-1融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-人源蛋白-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1-連接肽-GLP-1(I)其中，連接肽為GGGGS；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。本GLP-1融合蛋白能夠有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因?yàn)榘胨テ诙潭鵁o(wú)法在臨床上使用的現(xiàn)狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領(lǐng)域較有應(yīng)用前景。本發(fā)明還公開(kāi)了所述融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P3/04GK102453095SQ20101052645
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者付剛, 劉鵬, 徐為人, 李心, 湯立達(dá), 王玉麗, 鄭學(xué)敏, 龔珉 申請(qǐng)人:天津藥物研究院