槲皮素在制備治療線粒體功能障礙相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及槲皮素在制備治療線粒體功能障礙相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述槲皮素具有顯著地消除由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞線粒體功能障礙及Ca2+失調(diào)。同時(shí)能夠有力的增加GES-1細(xì)胞中線粒體生物合成，在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激12h顯著地提高PGC-1α表達(dá)。槲皮素還可改善過氧化誘導(dǎo)的下游細(xì)胞凋亡。更進(jìn)一步用小鼠模型驗(yàn)證了槲皮素對(duì)小鼠乙醇氧化應(yīng)激模型胃粘膜損傷具有很好的保護(hù)作用。本發(fā)明說明槲皮素是一種“線粒體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”，可作為線粒體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，制備成治療胃部疾病包括胃炎、胃潰瘍、胃癌的藥物。
【專利說明】槲皮素在制備治療線粒體功能障礙相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及槲皮素在制備治療線粒體功能障礙相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
二、【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是廣泛存在于各種真核細(xì)胞中、具有環(huán)狀DNA、可進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的特殊的細(xì)胞器。線粒體有細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”之稱，通過氧化磷酸化生成ATP，并為細(xì)胞提供90%以上的能量。近年來(lái)研究表明線粒體在能量代謝、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、鈣離子儲(chǔ)庫(kù)和活性氧生成等方面起著重要生物學(xué)作用。
[0003]線粒體功能障礙多指由于線粒體膜受到破壞、呼吸鏈?zhǔn)艿揭种?、酶活性降低、線粒體DNA損傷等引起的能量代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致一系列相互作用的損傷過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡死亡。線粒體功能障礙與炎癥、糖尿病、阿爾茨海默病、癌癥、衰老等多種疾病密切相關(guān)。因此，作用于線粒體能量代謝、自由基生成等基本生物過程，對(duì)于防治多種疾病是一個(gè)新的策略。
[0004]線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的主要部位，也是氧化損傷的靶點(diǎn)。故線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS上升，線粒體跨膜電位(Λ Ψπι)下降，鈣穩(wěn)態(tài)遭到破壞；可通過這些檢測(cè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)線粒體功能狀態(tài)。此外，線粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)也會(huì)隨著體內(nèi)外生理環(huán)境變化，而PGC-1 α是線粒體生物合成的主要調(diào)芐基因，線粒體生物合成對(duì)于線粒體功能恢復(fù)也起至關(guān)作用。
[0005]線粒體營(yíng)養(yǎng)素具有以下功能:①修復(fù)線粒體損傷抑制線粒體中氧化劑產(chǎn)生、滅活氧化劑、增強(qiáng)抗氧化劑；③修復(fù)氧化劑損傷充當(dāng)輔助因子/基質(zhì)保護(hù)線粒體酶和/或刺激酶的活性。本發(fā)明中的槲皮素及含有槲皮素植物制劑具有抑制線粒體功能障礙、提高線粒體生物合成的作用，可作為一種細(xì)胞線粒體營(yíng)養(yǎng)素，在線粒體功能障礙相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮作用。
[0006]胃粘膜炎癥與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙密切相關(guān)，ROS攻擊線粒體導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，進(jìn)一步導(dǎo)致多種物質(zhì)由線粒體內(nèi)釋放和膜電位下降、活性氧產(chǎn)生及鈣穩(wěn)態(tài)遭到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡死亡。本發(fā)明認(rèn)為槲皮素是一種線粒體營(yíng)養(yǎng)素，它可以通過修復(fù)過氧化損傷來(lái)保護(hù)線粒體，并進(jìn)一步提高線粒體功能，因而在胃粘膜炎癥的防治中有作用。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明需要解決的問題:
[0008]本發(fā)明致力解決槲皮素及含有槲皮素植物制劑對(duì)細(xì)胞線粒體功能等生物過程的作用，及其在線粒體功能障礙相關(guān)胃粘膜炎癥中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0010](I)本發(fā)明所述槲皮素及含有槲皮素植物制劑，可以顯著地消除由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞線粒體功能障礙及Ca2+失調(diào)。槲皮素預(yù)處理后能夠顯著地消除由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+上升，Δ Ψπι下降。
[0011](2)本發(fā)明所述槲皮素及含有槲皮素植物制劑，能夠有力的增加GES-1細(xì)胞中線粒體生物合成，并顯著提高氧化應(yīng)激12h時(shí)GES-1的PGC-1 α表達(dá)。
[0012](3)槲皮素對(duì)抗GES-1細(xì)胞氧化損傷。
[0013](4)槲皮素抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠胃粘膜炎癥。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為:
[0015](I)本發(fā)明以槲皮素及含有槲皮素植物制劑為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用藥理學(xué)、生物學(xué)方法，提示槲皮素能夠通過抑制線粒體功能障礙和促進(jìn)線粒體生物合成，從而對(duì)抗細(xì)胞氧化損傷，是一種新型“線粒體營(yíng)養(yǎng)素”。線粒體營(yíng)養(yǎng)素具有以下功能:①修復(fù)線粒體損傷抑制線粒體中氧化劑產(chǎn)生、滅活氧化劑、增強(qiáng)抗氧化劑；③修復(fù)氧化劑損傷；④充當(dāng)輔助因子/基質(zhì)保護(hù)線粒體酶和/或刺激酶的活性。本發(fā)明中的槲皮素及含有槲皮素植物制劑具有抑制線粒體功能障礙、提高線粒體生物合成的作用，可作為一種細(xì)胞線粒體營(yíng)養(yǎng)素，在線粒體功能障礙相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮作用。
[0016](2)胃粘膜炎癥與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙密切相關(guān)，ROS攻擊線粒體導(dǎo)致線粒
體膜通透性改變，進(jìn)一步導(dǎo)致多種物質(zhì)由線粒體內(nèi)釋放和膜電位下降、活性氧產(chǎn)生及鈣穩(wěn)
態(tài)遭到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡死亡。槲皮素是一種線粒體營(yíng)養(yǎng)素，它可以通過修復(fù)過氧化
損傷來(lái)保護(hù)線粒體，并進(jìn)一步提高線粒體功能，因而在胃粘膜炎癥的防治中有作用。本發(fā)明
槲皮素及含有槲皮素植物制劑`是一種新型“線粒體營(yíng)養(yǎng)素”，、可抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠胃粘膜炎
癥。在制備治療線粒體功能障礙相關(guān)疾病藥物中應(yīng)用?？芍苽涑芍委熚覆考膊∪缥秆住⑽?br> 潰瘍、胃癌的藥物。它將對(duì)其他線粒體功能障礙相關(guān)疾病，如糖尿病阿爾茨海默病的治療有 四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1:槲皮素對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS作用。
[0018]圖2:槲皮素對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+作用。
[0019]圖3:槲皮素對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位作用。
[0020]圖4:槲皮素對(duì)線粒體含量的作用。
[0021]圖5:槲皮素對(duì)PGC-1 α表達(dá)量的作用。
[0022]圖6:槲皮素對(duì)抗GES-1細(xì)胞氧化損傷。
[0023]圖7:槲皮素抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠胃粘膜炎癥。
五、【具體實(shí)施方式】
[0024]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)施例的任何限制。
[0025]材料與來(lái)源:
[0026]試劑:DMEM培養(yǎng)基(HyClone 公司);胎牛血清 FBS(HyClone 公司);DCF_DA(Sigma);JC-1 (Sigma) ;Frua_2 (Sigma) ；MitoTracker (Molecular Probes) ；Annexin V-PI (南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；乙醇(南京化學(xué)試劑公司)。
[0027]材料:GES-1細(xì)胞(湖南湘雅醫(yī)學(xué)院)。[0028]器材:酶標(biāo)儀(TECAN公司);流式細(xì)胞儀(BD公司);高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)；Q-PCR 儀(Bio-Rad)。
[0029]實(shí)施例1槲皮素消除GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的ROS水平增高
[0030]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，每8個(gè)孔一組，槲皮素的含量分別為0、25、50、100μ M，37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去含有藥物的培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入ΙΟΟμ 15“1^^!?從，371:孵育301^11，用酶標(biāo)儀以485nm激發(fā)、530nm檢測(cè)來(lái)讀取熒光值。然后再加入終濃度為300 μ M H2O2，作用30min后，用酶標(biāo)儀以485nm激發(fā)、530nm檢測(cè)來(lái)讀取熒光值，計(jì)算H2O2作用之后和作用之前的熒光值增加百分比來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度變化。結(jié)果見圖1。
[0031]圖1結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2刺激30min，ROS顯著地提高2.4倍(ρ〈0.05)。槲皮素濃度為12.5、25 μ M時(shí)能顯著地消除ROS增加，分別降至66.9%、61.3% (ρ〈0.05，ρ〈0.05)。
[0032]實(shí)施例2槲皮素消除GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的Λ Ψπι降低
[0033]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，每8個(gè)孔一組，槲皮素的含量分別為O、25、50、100 μ M。37 °C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后400 μ M H2O2刺激3h，清洗掉含有H2O2的培養(yǎng)基，每孔加入10 μ M JC-1染料100 μ 1，37°C作用30min。棄去染料，用PBS清洗，用酶標(biāo)儀以485nm激發(fā)、535nm檢測(cè)和以550nm激發(fā)、600nm檢測(cè)來(lái)讀取熒光值，以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化情況。結(jié)果見圖2。
[0034]圖2結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2刺激3h細(xì)胞線粒體膜電位下降50% (ρ〈0.05)；用50、100 μ M的槲皮 素預(yù)處理可分別將細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)至72% (ρ〈0.05 )和73%(ρ〈0.05)。這說明槲皮素可以顯著地抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜去極化。
[0035]實(shí)施例3槲皮素消除GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的Ca2+水平增高
[0036]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，每8個(gè)孔一組，槲皮素的含量分別為0、25、50、100μ M，37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去含有藥物的培養(yǎng)液，HBSS沖洗，加入含有2 μ M Fura-2/AM HBSS溶液100 μ 1，37°C孵育30min。用HBSS洗掉染料，加入300 μ M H2O2孵育3h，用酶標(biāo)儀分別以340nm和380nm激發(fā)、510nm檢測(cè)來(lái)讀取熒光值，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。結(jié)果見圖3。
[0037]圖3結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2刺激3h組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著地提高2.6倍(p〈0.05)。槲皮素預(yù)處理24h，與H2O2處理組相比，在槲皮素濃度為25、50 μ M時(shí)能顯著地消除細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，使其濃度分別降至51%、74%(ρ〈0.05)。
[0038]實(shí)施例4槲皮素刺激GES-1細(xì)胞線粒體含量增加
[0039]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，每4個(gè)孔一組，槲皮素的含量分別為O、12.5、25、50、10(^11，371:、5%0)2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。24h后，棄去培養(yǎng)基，用冷PBS沖洗一遍，胰酶消化，收集細(xì)胞，用冷PBS清洗兩遍。最后用含有500 μ LlOOnM MitoTracker-PBS溶液重懸細(xì)胞，室溫避光染色30min。用流式細(xì)胞儀收集分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果見圖4。
[0040]圖4結(jié)果表明，槲皮素刺激線粒體生物合成是濃度依賴性的，與對(duì)照組相比，在槲皮素濃度為50、100 μ M時(shí)能顯著地增加線粒體含量，使MitoTracker熒光強(qiáng)度分別增至116%、128%(ρ〈0.01, ρ〈0.01)。[0041]實(shí)施例5槲皮素刺激GES-1細(xì)胞PGC-1 α表達(dá)量增加
[0042]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后用400 μ M H2O2或PBS處理12h，提取總RNA,具體提取步驟根據(jù)生廠商提供的使用說明書進(jìn)行。取I μ L溶解在無(wú)RNA酶水中的RNA，用99 μ L的TE緩沖液稀釋，BioPhotometer plus檢測(cè)RNA含量。使用2 μ g的RNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA，轉(zhuǎn)錄條件是:42 °C反應(yīng)60min之后70°C反應(yīng)lOmin。
[0043]使用Primer Premier設(shè)計(jì)人PGC-1 α和GAPDH引物。PGC-1 α的相對(duì)表達(dá)量使用實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定，選用的參比基因是GAPDH。Q-PCR條件是首先95°C 5min ；95°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s反應(yīng)40循環(huán)；72°C反應(yīng)10min之后，測(cè)溶解度曲線。PCR反應(yīng)體系是20 μ L，其中含有IyL cDNA模板，10 X PCR緩沖液，20 X Eva Green以及0.2 μ M特異的引物寡核苷酸對(duì)。PGC-Ια的倍增相對(duì)表達(dá)量計(jì)算用比較閾值(CT)方法。結(jié)果見圖5。
[0044]Q-PCR引物如下:
[0045]PGC-1 α: forward5，-GGAGACGTGACCACTGACAATGA-3，，
[0046]backward5> -TGTTGGCTGGTGCCAGTAAGAG-3，；
[0047]GAPDH: forward5，-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，，
[0048]backward5> -TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3，。
[0049]圖5結(jié)果表明，氧化應(yīng)激12h后，與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下調(diào)PGC-1 α的表達(dá)量至43% (ρ〈0.05);與H2O2誘導(dǎo)組相比，槲皮素預(yù)處理顯著地上調(diào)PGC-1 α的表達(dá)量2.4倍。這些結(jié)果說明，槲皮素可以提高GES-1細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的PGC-Ια的表達(dá)量。
[0050]實(shí)施例6槲皮素對(duì)抗GES-1細(xì)胞氧化損傷
[0051]GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中16h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入含有2%FBS的藥物培養(yǎng)基，每8個(gè)孔一組，槲皮素的含量分別為O、12.5、25、50、100 μ M。37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2處后40(^1 H2O2處理lh。加入20μ 15mg/mlMTT，37°C孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入150 μ I DMS0，37°C孵育lOmin，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490nm吸收值，結(jié)果見圖6。
[0052]圖6結(jié)果表明，H2O2刺激lh，細(xì)胞活性降至53% ;用25,50 μ M的槲皮素預(yù)處理可分別將細(xì)胞活性恢復(fù)至75% (ρ〈0.01)和79% (ρ〈0.001)。這說明槲皮素可對(duì)抗細(xì)胞氧化損傷，并呈一定劑量依賴關(guān)系。
[0053]實(shí)施例7槲皮素在小鼠胃粘膜炎癥中的應(yīng)用
[0054](I)健康成熟雄性Balb/c小鼠18只，體重20_25g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)=SCXk (軍)2012-004。小鼠飼料，購(gòu)于南京青紫蘭科技有限公司。
[0055]將槲皮素和奧美拉唑分別用1%DMS0溶解，再溶于生理鹽水，濃度分別為1.25mg/mL和lmg/mL。下面以此溶液為例研究槲皮素對(duì)胃潰瘍的預(yù)防及治療效果。
[0056](2)實(shí)驗(yàn)前將小鼠隨機(jī)分成六組:①正常對(duì)照組；②單純給槲皮素組；③單純給奧美拉唑組；④單純乙醇組；⑤給槲皮素組+乙醇組；?給奧美拉唑組+乙醇組。槲皮素組小鼠每天灌胃給藥25mg/kg, —日一次；奧美拉唑組小鼠每天灌胃給藥20mg/kg, —日一次；正常組和模型組小鼠每天灌胃等量的生理鹽水，一日一次。給藥6天后，小鼠禁食不禁水。第7天給藥Ih后，④⑤⑥組灌胃5mg/kg的無(wú)水乙醇，①②③組灌胃等量的生理鹽水。30min后皮下注射熒光探針L-012，隨后10%水合氯醛麻醉小鼠。30min后小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)用IVISLumina XR采集。然后頸脫位猝死小鼠，將胃取出，沿著大彎打開胃，然后用PBS輕輕沖洗，10%的福爾馬林固定發(fā)炎組織，進(jìn)行H&E染色組織學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。
[0057]圖7A組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明，正常對(duì)照組呈現(xiàn)的是正常生理狀態(tài)下的胃粘膜；單純乙醇處理組小鼠組織切片呈現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)，存在顯著的水腫，中度出血和上皮細(xì)胞脫落；槲皮素預(yù)處理可以抑制乙醇誘導(dǎo)的病理特征，如減少炎癥、抑制水腫、抑制上皮細(xì)胞脫落及其他一些損傷；奧美拉唑預(yù)處理的治療效果和槲皮素的治療效果類似。
[0058]圖7B，C結(jié)果表明，單純乙醇處理組的信號(hào)比正常對(duì)照組的信號(hào)要強(qiáng)69倍。與單純乙醇處理組相比，槲皮素對(duì)乙醇誘導(dǎo)的炎癥的具有極其顯著地作用，能夠?qū)⒒瘜W(xué)熒光信號(hào)減弱82%(p〈0.05)。奧美拉唑能將化學(xué)熒光信號(hào)減弱87%(p〈0.05)。
[0059]這些結(jié)果有力的證明了槲皮素對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠胃黏膜炎癥有保護(hù)作用。可制備成治療胃部疾病如胃炎、胃潰瘍、 胃癌的藥物。
【權(quán)利要求】
1.槲皮素及含有槲皮素植物制劑在制備治療線粒體功能障相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述槲皮素及含有槲皮素植物制劑在制備治療線粒體功能障相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備治療胃炎或胃潰瘍或胃癌藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述槲皮素及含有槲皮素植物制劑在制備治療線粒體功能障相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是槲皮素劑量為25mg/kg體重，對(duì)胃粘膜損傷的修復(fù)作用最佳濃度為50 μ M0`
【文檔編號(hào)】A61P1/04GK103720685SQ201410015002
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】徐琛, 胡新婷, 丁晨 申請(qǐng)人:南京大學(xué)