專利名稱：一種內(nèi)酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是危害人類健康的大敵。我國每年新發(fā)癌癥病例約有160萬人，每年死于癌癥的約有130萬人，全國因癌癥而死亡的人數(shù)逐年上升，我國為肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的高發(fā)區(qū)域，癌癥死亡率居高不下。
目前尚無有效的藥物治愈大多數(shù)癌癥患者。化療藥物對癌癥雖有一定療效，但毒副作用大，中成藥對癌癥的療效普遍較低，如參蓮膠曩對肺、胃癌的癌灶緩解率僅為3.5％，療效均不理想。
本發(fā)明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的樹皮、枝葉、種子的抗癌有效物質(zhì)和化學(xué)成分，從中提取出多種抗癌單體化合物(活性成分)，經(jīng)抗癌實驗研究表明，對人肝癌細胞、人胃癌細胞、人食管癌細胞和動物移植性腫瘤(如S180、H22和Heps)均有顯著的體外和體內(nèi)抗癌治療效果，并已申請獲得3項抗癌產(chǎn)品發(fā)明專利證書(專利號分別為ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人繼續(xù)提取分離、篩選番荔枝(Annona squamosa Linn)種子的抗癌有效化學(xué)成分，從中又發(fā)現(xiàn)了4種內(nèi)酯單體成分具有特別顯著抗癌活性的抗癌用途(其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶)。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種抗癌活性高、抗癌譜廣的抗癌單體化合物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用。
2、技術(shù)方案本發(fā)明從番荔枝(Annona squamosa Linn)種子提取分離到一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(經(jīng)資料查閱目前還沒有文獻報道該化合物有抗癌活性)，其特征是白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機溶劑。其鑒定為expoxyrolin B，分子式為C36H66O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)。經(jīng)體內(nèi)外抗癌藥理實驗，其對人肝癌細胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶。
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
采用MTT顯色法，取2×104/m1活細胞(人肝癌細胞SMMC-7721或HepG2)接種于96孔板，每孔90ul，設(shè)四復(fù)孔。待細胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預(yù)定時間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調(diào)零孔只含有培養(yǎng)液。細胞活力用加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值)×100％。
結(jié)果顯示，抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)對人肝癌細胞的抑制活性非常高，其對人肝癌細胞的抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
3、有益效果本發(fā)明的一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物?？拱嶒灲Y(jié)果顯示，抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)對癌中之王——肝癌的抑制活性非常高，其對肝癌的體內(nèi)抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。這為提高抗癌臨床療效提供了非常有前景的高效預(yù)選藥物。
具體實施例方式
實施例1一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)提取方法一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)。
實施例2一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征是白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機溶劑。其鑒定為expoxyrolin B，分子式為C36H66O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 實施例3一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)對人肝癌細胞的抑制作用1、細胞培養(yǎng)SMMC-7721或HepG2細胞株接種于培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，每3～5天傳代一次，傳代時用0.25％胰酶消化3min，以培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液后接種。
2、藥物處理取對數(shù)生長期的細胞按2×105/ml接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞完全貼壁(約4小時)后，再換加含藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至預(yù)定時間。實驗藥物是經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)；對照藥物是5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
2、實驗方法采用MTT顯色法，取2×104/ml活細胞接種于96孔板，每孔90ul，設(shè)四復(fù)孔。待細胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預(yù)定時間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT 50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調(diào)零孔只含有培養(yǎng)液。細胞活力用加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值)×100％。
3、實驗結(jié)果結(jié)果如表1、表2顯示，隨著內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)濃度的升高，對人肝癌細胞的抑制率也升高，其對人肝癌細胞的抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
表1 expoxyrolin B對SMMC-7721肝癌細胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較表2 expoxyrolin B對HepG2肝癌細胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實施例4一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)對移植性肝癌的抑制作用1、實驗動物和瘤株雄性健康昆明種小鼠體重，18-22g，鼠齡6-8周，來自本校動物實驗中心，昆明鼠傳代腹水型鼠肝癌Heps瘤株均購自江蘇省腫瘤研究所動物實驗中心。小鼠在南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心的動物實驗房飼養(yǎng)，溫度21～25℃，濕度為45％～55％。
2、造模(移植性肝癌Heps)昆明種雄性小白鼠60只，按比例隨機留10只為陰性對照組，其余50只進行造模。無菌抽取接種Heps瘤種8天的小鼠的腹水，以生理鹽水稀釋10倍，0.02％伊紅染色，滴加到細胞計數(shù)板上計數(shù)后，調(diào)細胞濃度至1×107/ml，迅速地分別將50只小鼠右腋皮膚消毒，每鼠接種0.2mlHeps腫瘤細胞懸液于皮下。整個接種過程須在無菌罩內(nèi)以無菌操作進行，1h內(nèi)完成接種。
接種后隨機分為5組，每組10只，分別為腫瘤模型對照組、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg試驗組、5-fu陽性對照組，另加陰性對照組，共6組。接種瘤細胞24h后，試驗組腹腔注射expoxyrolin B，劑量分別為15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg試驗組，陰性對照組和腫瘤模型對照組等體積注射藥物溶媒，5-FU對照組以生理鹽水為溶劑，劑量為10mg/kg，各組動物均按0.2ml在腹腔注射，連續(xù)給藥8d。末次給藥后次日，進行如下觀察①完整剝離瘤塊，并稱重計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率＝(對照組腫瘤重量-治療組腫瘤重量)/對照組腫瘤重量×100％；②組織學(xué)檢查將腫瘤組織用4％甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后用光鏡檢查，并切取上述各組大鼠腫瘤組織，經(jīng)4％戊二醛及1％四氧化鋨預(yù)固定和后固定后，酒精及丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，作0.5μm厚薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。
3、實驗結(jié)果番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)對小鼠移植性腫瘤Heps的生長抑制作用不同劑量的expoxyrolin B均能顯著抑制小鼠腫瘤的生長(P＜0.01)。番荔枝內(nèi)酯單體化合物(expoxyrolin B)的劑量極小，其抗癌活性是化療藥5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，見表3。
表3 expoxyrolin B對小鼠移植性肝癌Heps作用結(jié)果

腫瘤組織細胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察結(jié)果電鏡觀察是檢測細胞凋亡形態(tài)的重要手段之一，尤其是透射電鏡對細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，為鑒定凋亡提供了最直接和客觀的證據(jù)。番荔枝內(nèi)酯單體化合物用藥組小鼠的腫瘤細胞，電鏡下可見較為典型的凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變，如胞體縮小細胞質(zhì)密度增高，核固縮，細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮并聚集成塊，有邊集現(xiàn)象，并可見到類圓形的凋亡小體，核碎裂，線粒體空泡樣變等；5-Fu化療對照組則主要表現(xiàn)為細胞壞死，凋亡少見。
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征在于該內(nèi)酯單體化合物鑒定為expoxyrolin B，分子式為C36H66O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征在于該內(nèi)酯單體化合物為白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿。
3.權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯單體化合物expoxyrolin B在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌內(nèi)酯單體化合物expoxyrolin B。其制備方法是番荔枝種子風干后，粉碎成粗粉，先用石油醚冷浸提??；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物。經(jīng)體內(nèi)外抗癌藥理實驗，其對人肝癌細胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5－氟脲嘧啶。
文檔編號A61P35/00GK1861597SQ20061008544
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者章永紅 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)