專(zhuān)利名稱(chēng)：α－干擾素質(zhì)粒DNA－脂質(zhì)體制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
HPV引起的生殖器扁平或尖銳濕疣，由于其復(fù)發(fā)率高，因而成為臨床治療的難點(diǎn)。α-干擾素(Interferon，IFN)具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)作用，為FDA批準(zhǔn)的抗HPV藥物，治療效果肯定。目前用IFN治療生殖器疣時(shí)，主要有兩種給藥途徑系統(tǒng)給藥如肌肉注射給藥及病灶內(nèi)直接注射給藥。IFN長(zhǎng)期系統(tǒng)給藥會(huì)引起一系列副作用，如流感樣綜合癥、突發(fā)性聽(tīng)力損失、持續(xù)神經(jīng)毒、甲狀腺機(jī)能異常等，另外全身系統(tǒng)給藥治療生殖器疣勢(shì)必造成藥物的浪費(fèi)，增加成本；病灶內(nèi)直接注射給藥產(chǎn)生的疼痛讓患者難以接受；IFN霜?jiǎng)┚植拷o藥，雖然方便，但I(xiàn)FN分子為生物大分子(15KD或21KD)，較難進(jìn)入皮膚角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮療效，臨床表現(xiàn)為治療效果差，復(fù)發(fā)率高。為了提高療效，方便給藥，降低成本及副作用，人們正致力尋求新的IFN給藥治療途徑。
經(jīng)皮基因傳遞系統(tǒng)(Cutaneous gene delivery system，CGDS)治療由可溶性細(xì)胞因子異常調(diào)控誘發(fā)的許多皮膚疾病時(shí)，為一極具吸引力的基因治療戰(zhàn)略。盡管大分子很難透過(guò)角質(zhì)層，但是皮層泡細(xì)胞及其附近結(jié)構(gòu)不僅能傳遞外部分子進(jìn)入活性皮膚細(xì)胞，而且還可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可溶性蛋白擴(kuò)散進(jìn)入周?chē)Y(jié)構(gòu)及循環(huán)系統(tǒng)。要使基因重組DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)活性皮膚角質(zhì)層內(nèi)的靶細(xì)胞，發(fā)揮皮膚基因治療的目的，就必需有一合適載體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA進(jìn)入具有滲透障礙的角質(zhì)層及其附器。目前，將外源基因轉(zhuǎn)染進(jìn)皮膚細(xì)胞發(fā)揮經(jīng)皮基因治療的方法有基因槍遞藥(Gene gun delivery)，SV40載體系統(tǒng)(如pSG5質(zhì)粒)及病毒載體如腺病毒或皰疹病毒載體等。用基因槍轉(zhuǎn)染外源基因，轉(zhuǎn)染效率低，不能達(dá)到基因治療所需藥物濃度；用病毒載體時(shí)，有較嚴(yán)重的組織炎癥反應(yīng)和組織細(xì)胞毒性；而利用脂質(zhì)體介導(dǎo)，可將目的基因選擇性靶向皮膚角質(zhì)毛囊角質(zhì)細(xì)胞，有較高的轉(zhuǎn)染效率，且不會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性。所以利用脂質(zhì)體介導(dǎo)IFN質(zhì)粒DNA，制備局部透皮轉(zhuǎn)基因制劑，對(duì)治療生殖器疣，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體制劑的制備方法。
本發(fā)明步驟將α-干擾素質(zhì)粒DNA亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pSG5(Stratagene)，制得表達(dá)質(zhì)粒；將甘油二月桂酸酯(GDL)、膽固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和α-生育酚混合后，70℃溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，再加熱至70℃，將70℃無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中，使脂類(lèi)的總濃度達(dá)到≥1g/ml，快速混勻兩相，冷卻至室溫，該脂質(zhì)體儲(chǔ)于4℃?zhèn)溆?；室溫下超聲處理上述脂質(zhì)體，加入含上述表達(dá)質(zhì)?！?.1ng/ml的等體積水溶液，混勻后孵育，得到α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體。
上述本發(fā)明方法中，甘油二月桂酸酯(GDL)、膽固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和α-生育酚各成分之間的比例可以是任意比例，通常為(0.5～10)∶(1～100)∶(1～100)∶(0.1～10)∶(0.1～20)的重量比，優(yōu)選為5∶25∶27∶1∶2的重量比。
上述本發(fā)明方法中，將無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中后，脂類(lèi)的總濃度通常為100～500g/ml。
上述本發(fā)明方法中，所加入的含表達(dá)質(zhì)粒的水溶液中，質(zhì)粒的濃度一般為0.1ng/ml-1g/ml，濃度過(guò)高不限。
上述本發(fā)明方法中，孵育的溫度通常是室溫或36℃-42℃，溫度過(guò)高不限。孵育的時(shí)間通常為1～60分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不限。
本發(fā)明可為臨床提供一種經(jīng)病灶部位透皮給藥后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)抗乳頭瘤病毒(HPV，臨床表現(xiàn)為生殖器疣)的新制劑。
本發(fā)明方法所得到的制劑具有以下有點(diǎn)(1)療效顯著。由于本制劑通過(guò)透皮吸收，直接作用于病灶，作用快速，療效顯著。
(2)使用方便，克服了以往制劑給藥的不方便性。
(3)安全，無(wú)副作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
以下是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例將α-干擾素質(zhì)粒DNA亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pSG5(Stratagene)，制得表達(dá)質(zhì)粒。將甘油二月桂酸酯(GDL)、膽固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE-10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、α-生育酚按重量比45∶25∶27∶1∶2混合后，70℃溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，再加熱至70℃，將適量70℃無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中，使脂類(lèi)的總濃度達(dá)到100g/ml，快速混勻兩相，冷卻至室溫，該脂質(zhì)體儲(chǔ)于4℃?zhèn)溆谩Ｊ覝叵鲁曁幚砩鲜鲋|(zhì)體，加入含上述表達(dá)質(zhì)粒(25mg/m1)的等體積水溶液，混勻后37℃孵育0.5小時(shí)，得到α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體。
權(quán)利要求
1.一種α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體制劑的制備方法，其步驟是將α-干擾素質(zhì)粒DNA亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pSG5，制得表達(dá)質(zhì)粒；將甘油二月桂酸酯、膽固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和α-生育酚混合后，70℃溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，再加熱至70℃，將70℃無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中，使脂類(lèi)的總濃度達(dá)到≥1g/ml，快速混勻兩相，冷卻至室溫，該脂質(zhì)體儲(chǔ)于4℃?zhèn)溆茫皇覝叵鲁曁幚砩鲜鲋|(zhì)體，加入含上述表達(dá)質(zhì)粒0.1ng/ml～1g/ml的等體積水溶液，混勻后孵育，得到α-干擾素質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是甘油二月桂酸酯、膽固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、α-生育酚按(0.5～10)∶(1～100)∶(1～100)∶(0.1～10)∶(0.1～20)的重量比混合。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征是甘油二月桂酸酯、膽固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、α-生育酚按5∶25∶27∶1∶2的重量比混合。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是將無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中后，脂類(lèi)的總濃度為100～500g/ml。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是孵育的溫度為室溫或36℃-42℃，孵育的時(shí)間為1～60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α－干擾素質(zhì)粒DNA－脂質(zhì)體制劑的制備方法。將α－干擾素質(zhì)粒DNA亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pSG5，制得表達(dá)質(zhì)粒。將甘油二月桂酸酯(GDL)、膽固醇(CH)、聚氧乙烯硬脂酸酯(POE－10)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、α－生育酚混合后，70℃溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，再加熱至70℃，將70℃無(wú)菌水緩慢滴入脂混合物中，使脂類(lèi)的總濃度達(dá)到≥1g/ml，快速混勻兩相，冷卻至室溫，該脂質(zhì)體儲(chǔ)于4℃?zhèn)溆?。室溫下超聲處理上述脂質(zhì)體，加入含表達(dá)質(zhì)粒的等體積水溶液，混勻后孵育，得到α－干擾素質(zhì)粒DNA－脂質(zhì)體。本發(fā)明方法可為臨床提供一種經(jīng)病灶部位透皮給藥后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)抗乳頭瘤病毒(HPV，臨床表現(xiàn)為生殖器疣)的新制劑。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1528464SQ03146998
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者蘇薇薇, 季愛(ài)民, 楊立偉, 朱永湘, 吳忠, 王永剛 申請(qǐng)人:中山大學(xué)