專利名稱：用于預(yù)防癌癥的羥基烏臺樹脂酚的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類癌癥、某些非癌癥激素依賴型疾病和/或心血管疾病的預(yù)防方法，該方法基于給予所述病人羥基烏臺樹脂酚。本發(fā)明還涉及通過增加所述病人血清中腸內(nèi)酯或其他羥基烏臺樹脂酚代謝物的水平，以預(yù)防人類癌癥或某些非癌癥激素依賴型疾病的方法，該方法基于給予所述病人羥基烏臺樹脂酚。此外，本發(fā)明涉及含有羥基烏臺樹脂酚的藥用制劑、食品添加劑和食品。
木酚素的定義為一類具有2，3-二芐基丁烷骨架的酚類化合物。它們由稱作前體的單體單元諸如肉桂酸、二羥基肉桂酸、阿魏酸、羥苯基丙烯酸和沒食子酸偶聯(lián)形成(Ayres和Loike，1990)。木酚素在植物中分布甚廣。在不同的部位(根、葉、莖、種子、果實(shí))都能找到木酚素但是量很少。發(fā)現(xiàn)許多來源(種子、果實(shí))的木酚素是與植物纖維組分結(jié)合的配糖共軛物形式。最常見的哺乳動物木酚素前體膳食來源是非精制谷物食品。在可食性植物中發(fā)現(xiàn)濃度最高的是亞麻子，其次是非精制谷物產(chǎn)品，尤其是黑麥。不同植物食品的哺乳動物木酚素產(chǎn)量見表1。
在松柏樹中也存在大量木酚素。不同品種的樹中含有的木酚素類型不同，在樹的不同部位含有的木酚素的量也不相同。云杉(挪威云杉(Picea abies))心材中的典型木酚素是羥基烏臺樹脂酚(HMR)、α-鐵杉內(nèi)酯、鐵杉內(nèi)酯酸、烏臺樹脂酚、異落葉松樹脂醇、開環(huán)異落葉松樹脂酚、liovile、云杉樹脂醇、落葉松樹脂酚和松脂酚(Ekman1979)。云杉中最豐富的木酚素單一組分是HMR，約占木酚素總量的60％，主要以非共軛游離式存在。在粗根中木酚素的濃度是2％-3％。在樹枝心木(5-10％)和twists中木酚素含量豐富，特別是在枝節(jié)處木酚素的量可以高出10％以上(Ekman，1976和1979)。這樣的濃度是以富含木酚素材料而著稱的地麻粉的上百倍。
羥基烏臺樹脂酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 可以從諸如壓縮木材纖維中分離出木酚素。這些纖維來源于樹干的壓縮木材，而枝節(jié)(超大木片)會降低紙張的質(zhì)量(Ekman，1976)。
諸如的烏臺樹脂酚和開環(huán)異落葉松樹脂酚的植物木酚素通過腸內(nèi)微生物菌叢轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的哺乳動物的木酚素即腸內(nèi)酯和腸二醇(Axelson等1982)。它們經(jīng)過腸肝循環(huán)，并以葡糖苷酸共軛物的形式排泄到尿中(Axelson和Setchell，1981)。作為木酚素化學(xué)預(yù)防作用的實(shí)驗證據(jù)，補(bǔ)給富含木酚素的亞麻子粉(5％或10％)或亞麻子木酚素(開環(huán)異落葉松樹脂酚-二配糖物，SDG)的高脂肪食物可以預(yù)防非雌激素敏感型二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌(Serraino和Thompson 1991和1992；Thompson等1996a和1996b)。它們降低上皮細(xì)胞的增殖、核畸變、腫瘤的生長及新腫瘤的發(fā)生。高攝取量的木酚素還可以保護(hù)預(yù)防實(shí)驗性的前列腺癌和結(jié)腸癌。膳食性黑麥(含有木酚素)防止移植入大鼠的Dunning R3327前列腺癌的早期生長(Zhang等1997；Landstrm等1998)。攜帶可觸及腫瘤動物的百分比、所述腫瘤的體積和生長速度大大降低。此外，亞麻子或者SDG的補(bǔ)給抑制化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸異常隱窩的形成(Serraino和Thompson1992；Jenab和Thompson 1996)。因此所述抗腫瘤作用的可能解釋為微弱的雌激素-抗雌激素樣特性和/或其他機(jī)制，具體機(jī)制尚未弄清。
在診斷患有乳腺癌的女性中腸內(nèi)酯分泌到尿中和血清濃度低(Ingram等1997；Hultén et al.1998)，暗示木酚素具有化學(xué)預(yù)防作用。假設(shè)認(rèn)為哺乳動物的木酚素(腸內(nèi)酯和腸二醇)可調(diào)節(jié)諸如乳腺癌的激素相關(guān)性癌癥，因為它們的結(jié)構(gòu)與雌激素相似。腸內(nèi)酯對MCF-7細(xì)胞具有微弱的雌激素作用(Mousavi和Adlercreutz 1992)，但在小鼠子宮重量上沒有雌激素反應(yīng)(Setchell等1981)。作為雌激素樣活性的作用，在大鼠妊娠和哺乳期內(nèi)喂食SDG增加斷奶時子宮重量，但在后期階段所述作用不明顯(Tou等1998)。可能的抗腫瘤作用也與它們的抗雌激素作用有關(guān)(waters和Knowler，1982)。哺乳動物木酚素腸內(nèi)酯對芳構(gòu)酶(aromatase)的抑制作用暗示，通過某種機(jī)制攝食富含木酚素的植物食品可能有助于緩解諸如乳腺癌雌激素依賴型疾病(Adlercreutz等1993，Wang等1994)。木酚素潛在的抗氧化活性還可能代表某種與木酚素在預(yù)防癌癥發(fā)生方面的作用有關(guān)的機(jī)制。此外，已經(jīng)證實(shí)哺乳動物的木酚素在人體可達(dá)到的濃度下抑制睪丸激素轉(zhuǎn)化為5α-二氫睪丸激素(DHT)即有效細(xì)胞內(nèi)雄激素的作用(Evans等1995)。DHT濃度的下降可以減少前列腺癌(PC)和良性前列腺增生(BPH)的風(fēng)險。
木酚素作為腸內(nèi)酯的前體也可以減輕下泌尿道癥狀(lower urinarytract symptoms，LUTS)和男子乳房發(fā)育癥。根據(jù)用動物模型獲得的實(shí)驗結(jié)果，我們認(rèn)為雌激素在涉及表現(xiàn)為膀胱頸協(xié)同失調(diào)或者外括約肌假性協(xié)同失調(diào)(pseudodyssynergia)的尿道協(xié)同失調(diào)性肌肉功能異常方面具有重要的作用(Streng等未正式發(fā)表的觀測結(jié)果)。神經(jīng)肌肉的此類變化至少被芳構(gòu)酶抑制劑(MPV-2213ad)部分逆轉(zhuǎn)，這證實(shí)了雌激素的作用。此外，服用雌激素或雌激素與雄激素比例增加導(dǎo)致的男子乳房發(fā)育癥可以用芳構(gòu)酶抑制劑成功治愈。木酚素抑制5α-還原酶和/或芳構(gòu)酶的能力和其潛在的抗氧化活性，可能代表木酚素在預(yù)防雄性生物發(fā)生激素相關(guān)性疾病方面與之相關(guān)的機(jī)制。
木酚素在人體的作用沒有有效的數(shù)據(jù)。目前已從關(guān)于補(bǔ)充有亞麻子產(chǎn)品(即木酚素)膳食的作用的研究得出關(guān)于木酚素在人體的作用理論。女性膳食中的亞麻子導(dǎo)致月經(jīng)周期的變化(Phipps等1993)。所述研究對象為月經(jīng)周期正常的女性，當(dāng)她們在日常飲食外每天服用10g的亞麻子粉時，發(fā)現(xiàn)其黃體期的平均長度增加，而且在黃體期內(nèi)血清中黃體酮/17β-雌二醇的比例也升高(Phipps等1993)。沒有發(fā)現(xiàn)服用亞麻子組和對照組的月經(jīng)周期或者雌酮、17β-雌二醇中任一種的濃度存在顯著差異。絕經(jīng)后女性服用亞麻子組和對照組的血清雌激素濃度也沒有顯著差異(Brzezinski等1997)。補(bǔ)充亞麻子增加血清SHBG(與雌二醇高效結(jié)合的蛋白)的濃度。這是一種對肝組織的典型雌激素作用。另一方面，SHBG的濃度增加降低了內(nèi)源雌激素的生物利用率。在健康年輕男性中，短期(6周)在飲食中補(bǔ)充亞麻子(10g/天，亞麻子混與松餅中)對血漿睪酮濃度沒有明顯作用(Shultz等1991)，這說明在男性生物缺乏雌激素作用(estrogenicity)。總的來說，這些研究表明木酚素可能有微弱的激素(雌激素和抗雌激素)作用，但是其作用機(jī)制不能完全說成是激素的作用。
總之，此前不能獲得足量的分離哺乳動物木酚素用于動物試驗或臨床試驗，而增加木酚素攝取量的唯一可能性是增加富含纖維素食品諸如亞麻子的攝取?？捎行мD(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯和大量生產(chǎn)/分離的HMR或其他任何木酚素在開發(fā)藥用制劑和諸如功能食品的食品上具有重要價值，以用于化學(xué)預(yù)防癌癥和其他激素相關(guān)性疾病以及心血管疾病。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)防人體癌癥、某些非癌癥激素依賴型疾病和/或心血管疾病的方法，該方法包括給予所述病人有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
另一方面，本發(fā)明涉及一種增加人體血清腸內(nèi)酯或羥基烏臺樹脂酚的其他代謝物的水平、從而預(yù)防人體癌癥或某些非癌癥激素依賴型疾病的方法，該方法包括給予所述病人有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
第三方面，本發(fā)明涉及包含有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的載體的藥用制劑。
第四方面，本發(fā)明涉及一種包含富含羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的液體或固體材料的產(chǎn)品，以用作食品添加劑。
第五方面，本發(fā)明涉及一種包含有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的食品。
再一方面，本發(fā)明涉及一種增加食品穩(wěn)定性的方法，該方法包括在所述食品中加入有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
圖2圖示存在或缺乏HMR的MCF-7細(xì)胞增殖。
圖3圖示以HMR或芳構(gòu)酶抑制劑處理的未成熟大鼠的子宮濕重。
圖4圖示HMR對雌性大鼠的抗DMRA誘導(dǎo)的乳腺腫瘤的抗腫瘤活性。
圖5圖示以不同劑量HMR處理的大鼠尿中的腸內(nèi)酯的排泄。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過將木酚素羥基烏臺樹脂酚(HMR)加入食品中或?qū)⑵溆米魉幱弥苿┒盟鯤MR預(yù)防癌癥、非癌癥激素依賴型疾病和心血管疾病。令人驚奇的是，HMR在體內(nèi)代謝為腸內(nèi)酯，腸內(nèi)酯至少是木酚素抗腫瘤特性的部分原因。HMR在體外的抗氧化活性很強(qiáng)，而且這一性質(zhì)說明HMR也可以通過針對體內(nèi)有害性氧自由基的保護(hù)作用而預(yù)防心血管疾病。本發(fā)明還涉及利用HMR作為食品添加劑以增加食品穩(wěn)定性(即抑制脂類和色素氧化及維生素的過氧化作用，這些氧化作用可導(dǎo)致食品失去營養(yǎng)價值及產(chǎn)生臭味)。
根據(jù)本發(fā)明的方法在預(yù)防癌癥(諸如乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌)、非癌癥激素依賴型疾病(諸如下泌尿道癥狀、尿道協(xié)同失調(diào)、膀胱不穩(wěn)定狀態(tài)、膀胱出口梗阻、良性前列腺增生和男子乳房發(fā)育癥)以及血清中氧化LDL導(dǎo)致的心血管疾病方面特別有效。
根據(jù)本發(fā)明的藥用制劑優(yōu)選為口服制劑。所述活性化合物(HMR)的需要量根據(jù)所預(yù)防的具體病癥而不同。常規(guī)劑量范圍每個成人每天約10mg至約100mg。
本發(fā)明的食品添加劑中，富集羥基烏臺樹脂酚的材料可以是任何適合與HMR混合而不影響其性質(zhì)的可食無毒固體或液體材料。所述材料的作用主要是便于確定HMR的精確劑量。舉例來說，合適的HMR濃度是每100g的富集材料中含有100mg至1g的HMR。
根據(jù)本發(fā)明的食品特別為功能食品、營養(yǎng)添加劑(nutritionalsupplement)、營養(yǎng)劑、藥用食品、營養(yǎng)藥品(nutraceutical)、健康食品、防癌食品(designer food)或任何食品。舉例來說，所述食品中HMR的合適濃度是每100g的食品中含有1至20mg的HMR。
根據(jù)本發(fā)明的功能食品可以是例如以下形式奶油、人造奶油、餅干、面包、蛋糕、糖果、甜食、酸奶或其他發(fā)酵奶制品、或谷類糧食如muesli。
添加羥基烏臺樹脂酚對增加食品穩(wěn)定性特別有用，目的是抑制使食品失去營養(yǎng)價值且產(chǎn)生臭味的脂類、維生素和色素氧化。舉例來說，用于目的的HMR合適濃度為大約0.1％。
用于本發(fā)明的HMR可以從壓縮木材的超大木片(含有樹枝、扭枝(twist)和枝節(jié))中分離獲得，而且HMR用來預(yù)防疾病，例如癌癥和心血管疾病。
用以下7種不同的測定來研究HMR的特性1.測定體外抗氧化能力2.測定對JEG-3細(xì)胞芳構(gòu)酶的抑制能力3.測定對MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)物的雌激素和抗雌激素活性4.通過子宮生長生物測定評價雌激素和抗雌激素活性5.以成年雄性大鼠評價雌激素和抗雌激素活性6.以DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型研究抗腫瘤活性7.給予不同劑量HMR后分析大鼠尿中的代謝產(chǎn)物以前不能分離和純化足量HMR供生物試驗用，因為它是木酚素中較少特征鑒定的組分。對HMR在云杉不同部位作用的了解(Ekman1976和1979)為細(xì)致研究木酚素尤其是HMR提供了機(jī)會。
已發(fā)現(xiàn)在HMR的劑量和尿中腸內(nèi)酯的量之間存在線性關(guān)系。腸內(nèi)酯是一種眾所周知的哺乳動物木酚素，通過腸道細(xì)菌由烏臺樹脂酚或通過氧化腸二醇形成(Axelson和Setchell 1981；Axelson等1982)。在尿中發(fā)現(xiàn)只有微量的未被代謝的HMR和其他代謝物(腸二醇和7-羥基腸內(nèi)酯)。當(dāng)HMR的日劑量增加時，其量仍保持不變。這些發(fā)現(xiàn)說明HMR被代謝為腸內(nèi)酯，而HMR通過去甲基和去羥基步驟形成的腸內(nèi)酯不能轉(zhuǎn)化為腸二醇?；贖MR的結(jié)構(gòu)，有人曾經(jīng)預(yù)測7-羥基腸內(nèi)酯是HMR的主要代謝產(chǎn)物，但事實(shí)并非如此。在代謝過程中這個羥基基團(tuán)被去除。HMR的代謝與SDG的代謝不同。SDG代謝生成的腸二醇被部分氧化為腸內(nèi)酯(Rickard等1996；Lampe等1994)。因此HMR作為腸內(nèi)酯的直接前體優(yōu)于SDG。
如果HMR對大鼠子宮或雄性生物具有任何雌激素作用在話，其作用也很弱。它對MCF-7細(xì)胞具有弱而不顯著的雌激素樣活性。HMR的抗雌激素活性沒有得到證明。所以，如圖2所示，它在DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型中有高度顯著的抗腫瘤活性是令人驚訝的。HMR的活性可能是HMR本身的作用或者是腸內(nèi)酯的作用。但是，給DMBA處理后的大鼠使用兩種不同劑量的HMR(3和15mg/kg)，沒有發(fā)現(xiàn)HMR的化學(xué)預(yù)防作用與劑量的相關(guān)性。因而HMR不需要轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯才能起到抗腫瘤的作用或者較小劑量的這些木酚素足以達(dá)到最大的化學(xué)預(yù)防效果。
如表2和表3所示，HMR是非常有效的抗氧化劑。它是公認(rèn)最有效的脂類過氧化抑制劑之一以及良好的LDL氧化抑制劑。因為認(rèn)為血清氧化LDL濃度是心血管疾病例如動脈粥樣硬化的最佳預(yù)測指標(biāo)，所以認(rèn)為抑制LDL氧化作用對人體特別重要。HMR可以用作食品添加劑以增加食品的穩(wěn)定性(亦即抑制維生素、脂類和色素的氧化，該氧化作用可導(dǎo)致食品失去營養(yǎng)價值及產(chǎn)生臭味)，因為HMR是很好的過氧化物陰離子和過氧自由基(peroxyl radical)清除劑，大大優(yōu)于眾所周知的通常用于增加食品穩(wěn)定性的抗氧化劑叔丁對甲氧酚(BHA)和丁基化羥基甲苯(BHT)。實(shí)驗化學(xué)品體外測試各種木酚素的雌激素性、抗雌激素性、抑制芳構(gòu)化的能力及其抗氧化特性。所述用于測試的化合物從以下來源購得腸二醇和腸內(nèi)酯得自英國倫敦的Plantech公司，包含兩種7-OH對映異構(gòu)體的7-羥基腸內(nèi)酯由芬蘭赫爾辛基大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系的KristinaWhl博士贈與。從木材中提取HMRHMR提取物按照Ekman，1976和Ekman 1979所述方法由挪威云杉(Picea abies)分離而得。簡單地說，凍干的地面心材用己烷進(jìn)行索格利特萃取，去除非極性的親脂萃取物。該木材試樣用丙酮/水(9∶1體積比)在相同的裝置中再萃取，得到木酚素粗提物。羥基烏臺樹脂酚(HMR)及其異構(gòu)體用XAD-樹脂分離及再次用色譜法分析以進(jìn)一步純化。體外抗氧化能力測定用四種不同的方法評估木酚素的抗氧化能力1)抑制脂類過氧化，2)抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化，3)清除過氧化物陰離子，4)清除過氧自由基測定。
根據(jù)木酚素抑制體外大鼠肝臟微粒體中過氧化氫叔丁基誘導(dǎo)的脂類過氧化反應(yīng)(t-BuOOH-LP)的能力，評價它們對脂類過氧化的抑制能力(Ahotupa等1997)。如下測試t-BuOOH-LP用移液管吸取0.8ml體積的緩沖溶液(50mM碳酸鈉，pH10.2，0.1mM EDTA)置于發(fā)光計的比色杯中。加入二十微升稀釋的肝微粒體，使最終濃度達(dá)到1.5mg蛋白/ml，然后加入6ml氨基苯二酰一肼(0.5mg/ml)和試驗化學(xué)品。在溫育混合液中加入以乙醇或二甲亞砜稀釋(2％的溫育液體積)的微量體積的所述試驗化合物，然后與介質(zhì)(乙醇或二甲亞砜)的脂類過氧化能力對比。該反應(yīng)于33℃由0.05ml 0.9mM的過氧化氫叔丁基(t-BuOOH)啟動。每分鐘測一次化學(xué)發(fā)光值，連續(xù)測約45分鐘，然后計算曲線下面積(積分)。化學(xué)發(fā)光值的測量使用連接到個人電腦的Bio-Orbit 1251型發(fā)光計(芬蘭土爾庫的Bio-Orbit公司)，所述電腦裝有本測定的專用軟件。
按Ahotupa等1996所述方法評價木酚素對LDL氧化的抑制能力。簡要介紹如下以緩沖肝素沉淀分離LDL。用磷酸鹽緩沖液將之重新懸浮后，加入20mM CuCl2，將該混合液于37℃溫育3小時。然后用氯仿-甲醇萃取LDL脂類，氮?dú)庀赂稍铮偃芙庥诃h(huán)己烷中，用分光光度計分析其234nm處的吸光度。該吸光度可表示LDL的氧化程度。為了測試不同化合物阻止LDL氧化的能力，在加入CuCl2之前先將所述化合物加入至溫育混合液中。通過測定溫育前和溫育后234nm處的光吸收來排除所述測定程序?qū)κ茉嚮衔锏目赡芨蓴_。對那些初始濃度(0.1mM)就表現(xiàn)出抗氧化效力的化合物，測定其IC-50值(即受試化合物抑制LDL氧化50％時的濃度)。
過氧化物陰離子的清除方法基于黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)在控制條件下產(chǎn)生過氧化物陰離子和用發(fā)光計檢測產(chǎn)生的活性氧類型(Ahotupa等1997)。測定受試化合物減少化學(xué)發(fā)光的能力。計算IC-50濃度(抑制化學(xué)發(fā)光50％的濃度)。
過氧自由基清除測定基于2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)HCl的熱分解產(chǎn)生過氧自由基和通過化學(xué)發(fā)光對其進(jìn)行檢測(Ahotupa等1997)。結(jié)果以化學(xué)計量系數(shù)(stochiometric factor)計算，即1摩爾受試化合物能清除多少摩爾的過氧自由基。抑制JEG-3細(xì)胞芳構(gòu)酶能力的測定研究HMR和結(jié)構(gòu)相關(guān)的木酚素(腸內(nèi)酯、腸二醇和7-羥基腸內(nèi)酯)對JEG-3細(xì)胞由3H-雄甾烯二酮形成3H-17β-雌二醇的影響，JEG-3細(xì)胞為人絨膜癌細(xì)胞系。JEG-3絨膜癌細(xì)胞為有用的芳構(gòu)酶模型，使得能夠體外研究對芳構(gòu)酶的抑制作用(Krekels等1991)。細(xì)胞以含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM維持。培養(yǎng)混合物包含50μl3H-雄甾-4-烯，3，17-二酮(0.5nM)、50μl未標(biāo)記的雄甾烯二酮(0.5nM)，100μl受試化合物(10mM)和800μl細(xì)胞懸浮液(1百萬個細(xì)胞)。培養(yǎng)4小時后，加入未標(biāo)記的載體(雄甾烯二酮、睪丸激素、17β-雌二醇和雌激素酮)。用3.0ml的二氯甲烷萃取甾族化合物兩次。如前所述(MKel等1995)，以高效液相色譜分離和定量放射性標(biāo)記的3H-17β-雌二醇。柱系統(tǒng)包括一個保護(hù)柱，后接一個C18 150×3.9mm內(nèi)徑的分析柱(英國來郡，wellington House；Technopak 10 C18 HPLC Techonology)。其流動相是乙腈/水(35/65)混合液，流速是1.2ml/min。為了連續(xù)檢測放射性代謝物，將HPLC柱的洗脫液連續(xù)地混入液體閃爍劑中，然后以放射性探測儀連續(xù)監(jiān)控。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)物中的雌激素和抗雌激素活性的測定MCF-7細(xì)胞系(人乳腺癌細(xì)胞)儲用培養(yǎng)物在T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中不含酚紅的RPMI培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、10μg/ml的胰島素和1nM17β-雌二醇。每星期更換三次新鮮的培養(yǎng)基。用胰蛋白酶消化收獲該儲用培養(yǎng)物，將之懸浮于10ml不含酚紅的凡爾生(versene)溶液中，然后800rpm離心5分鐘。小心地將細(xì)胞沉淀重新懸浮于補(bǔ)充有5％葡聚糖活性碳解吸的胎牛血清(dsFCS)的RPMI培養(yǎng)基中，然后以50000個細(xì)胞/3.0ml培養(yǎng)基/孔的量接種至6孔板上。培養(yǎng)的第二天更換培養(yǎng)基并加入受試化合物。為了測定木酚素化合物的雌激素活性，將它們用乙醇稀釋，以1.0M的終濃度加入至細(xì)胞培養(yǎng)物中。每次增殖測定都用1.0nM 17β-雌二醇的乙醇溶液作為雌激素反應(yīng)的陽性對照。在對照孔中都加入相同量的乙醇。為測試抗雌激素活性，在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入17β-雌二醇和木酚素。所述細(xì)胞在所述受試化合物存在下培養(yǎng)5至7天，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞增殖以Coulter計數(shù)器計數(shù)釋放的細(xì)胞核進(jìn)行定量。以未成年大鼠親子宮試驗評價雌激素和抗雌激素活性如前所述進(jìn)行未成年大鼠親子宮測定(Jordan等1977)評價HMR的雌激素活性，僅將參考試驗中的3天處理時間改為7天。將處理時間延長是因為預(yù)料受試化合物的雌激素活性微弱。以抑制雌二醇生物合成的芳構(gòu)酶抑制劑(MPV-2213ad)處理的未成年大鼠，作為無雌激素刺激子宮的方法對照。以成年雄性大鼠評價雌激素和抗雌激素活性HMR的雌激素(抗雄激素)作用和抗雌激素作用相應(yīng)地以正常和雄激素不足的Noble品種雄性大鼠(6-9月齡)加以研究。通過新生雌激素化作用(即出生后1-5天以10.0μg/kg體重皮下注射溶于菜油中的二乙基己烯雌酚)誘發(fā)包括雄性生殖道結(jié)構(gòu)和功能改變的慢性雄激素不足狀態(tài)。已知這些變化通過包括MPV-2213ad日劑量為10mg-30mg/kg體重的芳構(gòu)酶抑制劑治療可部分逆轉(zhuǎn)(Streng等未發(fā)表的觀測結(jié)果)。
喂食所述動物不含大豆的基本飼料(SDS，Whitham Essex，England)，并讓它們自由飲水。以50mg/kg體重的日劑量提供溶于菜油中的HMR給正常和雄激素不足的兩組共12只雄性大鼠。向兩組動物模型的另外12只雄性大鼠提供作為安慰劑治療的菜油。四星期的療程后處死所有動物。測量睪丸和副性腺(腹前列腺、精囊和凝固腺(coagulating gland))的重量。通過免疫測定法測量血清和睪丸的睪酮及垂體和血清的促黃體生成激素(LH)的水平(Haavisto等1993)。以DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型研究抗腫瘤活性如前所述(Kangas等1986)，研究HMR對大鼠乳腺癌的抗腫瘤活性。對50天齡雌性Sprague-Dawley大鼠管飼法(cavage)給予12.0mg的DMBA(二甲基苯并[a]蒽)。大約6周后可檢測到可觸及的腫瘤，之后每周測量一次腫瘤的寬度(w)和長度(l)，根據(jù)公式V＝(πw2l)/12確定腫瘤的體積。還對大鼠每周稱重一次。大鼠分為不同的3組，使得每組的腫瘤總數(shù)在試驗開始時大致相同(1)對照組8只大鼠，(2)HMR 3.0mg/kg 7只大鼠，(3)HMR 15.0mg/kg 7只大鼠，其中一只必須在試驗結(jié)束前殺死。
在DMBA誘導(dǎo)后9周，即出現(xiàn)可觸及腫瘤后3周，開始口服給與HMR，持續(xù)每天給與共7.5周。在試驗結(jié)束時，將各組的腫瘤按其生長方式分類1.腫瘤生長(PD＝疾病惡化)；2.腫瘤無生長、穩(wěn)定(SD＝疾病穩(wěn)定，腫瘤體積無變化或腫瘤縮小低于75％)；3.腫瘤縮小(PR＝部分有效，腫瘤體積縮小大于75％)；4.腫瘤消失(CR＝完全有效，無可觸及腫瘤)。接受不同劑量HMR后大鼠尿中的代謝產(chǎn)物分析以十只Sprague-Dawley雄性大鼠(4月齡)研究HMR的體內(nèi)代謝。代謝研究期間將實(shí)驗動物成對關(guān)養(yǎng)，按光照黑暗各12小時的周期循環(huán)，并使其可自由飲水和進(jìn)食不含大豆的基本飼料(SDS，WhithamEssex，England)。
將溶于10％乙醇的聚乙二醇溶液的HMR分別以3，15，25和50mg/kg體重的劑量管飼大鼠，每天一次，持續(xù)兩天。在第二次管飼后以代謝籠將24小時尿收集在一個罐中，所述收集罐內(nèi)含有用作防腐劑的120μl 0.56M抗壞血酸和120μl 0.15M疊氮化鈉。離心后測量尿的體積并將之保存在-20℃。在3.0ml解凍尿等分試樣中加入750μl0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.0±0.1)進(jìn)行預(yù)處理。Sep-Pak C18柱(100mg硅基樹脂/柱)用于尿提取。該柱用3.0ml水、3.0ml甲醇和3.0ml乙酸鹽緩沖液預(yù)處理。尿過柱后用3.0ml乙酸鹽緩沖液洗柱，然后用3.0ml甲醇洗脫polyphenolics。洗出液在氮環(huán)境下的+45℃水浴中蒸發(fā)至干，然后將干渣重新溶解于3.0ml 0.2M的乙酸鹽緩沖液中。加入30μl Helix pomatia酶混合液，然后將上述溶液在37℃下溫育以同時水解葡萄糖醛酸化物和硫酸酯。在水解試樣中加入300μl的黃酮貯液(100μg/ml溶于乙醇中)。然后用C-18柱提純上述試樣液，按前面所述方法蒸發(fā)至干后保存于-20℃，備用氣相色譜-質(zhì)譜分析。
將蒸發(fā)后的尿樣重新溶于吡啶中，然后加入BSTFA∶TMCS(10∶1)甲硅烷基化試劑進(jìn)行硅烷化處理。甲硅烷基化的尿樣用HP 6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。氣相色譜柱是HP-1交聯(lián)聚甲基硅氧烷柱(15m×0.25mm內(nèi)徑，膜厚0.25μm)。氦作為氣相載體，流速為1ml/min。設(shè)置氣相色譜烘箱以8℃/min的升溫率從60℃升至290℃。氣相色譜的進(jìn)樣器設(shè)置為1∶15分流比的分流模式。進(jìn)樣器溫度為250℃。根據(jù)質(zhì)譜鑒定化合物。根據(jù)目標(biāo)組分相對于內(nèi)標(biāo)的未校正峰面積進(jìn)行定量計算。結(jié)果體外抗氧化能力的評定在我們的試驗中，HMR比任何其他木酚素或類黃酮具有更強(qiáng)的脂類過氧化作用能力(表2)。HMR與眾所周知的抗氧化劑TROLOX、BHA和BHT的抑制脂類過氧化、抑制LDL氧化以及清除過氧化物和過氧自由基的能力相當(dāng)，其中TROLOX是水溶性維生素E衍生物(表3)。總體上HMR是最強(qiáng)的抗氧化劑，在所有測定中均比BHA或BHT更有效，在除了脂類過氧化抑制測定外的所有試驗中均強(qiáng)于TROLOX，脂類過氧化作用的抑制測定中所有化合物幾乎具有相等的活性。抑制JEG-3細(xì)胞芳構(gòu)酶的能力測試不同濃度的HMR對用G-3細(xì)胞由3H-雄甾烯二酮形成3H-17β-雌二醇的抑制作用。HMR的抑制能力與腸內(nèi)酯、7-羥基腸內(nèi)酯和腸二醇相當(dāng)。腸內(nèi)酯在1.0至10.0μM的濃度范圍內(nèi)對芳構(gòu)化作用產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用。實(shí)驗結(jié)果還表明腸二醇無抑制能力，這說明內(nèi)酯環(huán)是產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵。7-羥基腸內(nèi)酯和羥基烏臺樹脂酚沒有抑制作用(圖2)，這說明木酚素分子中羥基的數(shù)量和位置對抑制芳構(gòu)酶是重要的。對MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)物的雌激素和抗雌激素活性如圖2所示，在MCF-7細(xì)胞增殖測定中HMR具有非常微弱的、未達(dá)到統(tǒng)計水平的雌激素和抗雌激素活性。以未成年大鼠親子宮試驗評價雌激素和抗雌激素活性圖3說明HMR對未成年大鼠子宮生長的作用。HMR對未成年大鼠的子宮重量增加沒有顯著的雌激素作用。HMR也沒有使子宮重量下降，說明沒有抗雌激素作用。正如預(yù)料，芳構(gòu)酶抑制劑抑制子宮重量的增加，說明對芳構(gòu)酶抑制劑的測定方法是合適的。對成年雄性大鼠的雌激素和抗雌激素活性評價以HMR處理4周后，觀察到對照和雄激素不足動物的副性腺和睪丸重量無顯著變化(表4)。睪酮和促黃體生成激素的濃度也沒有顯著變化(表5)。這些結(jié)果說明，HMR在雄性生物中不是完全的雌激素激動劑，因為它對下丘腦-垂體-性腺軸沒有典型的雌激素活性(抑制促黃體生成激素和雄激素的分泌)。HMR也不是抗雌激素，因為它沒有逆轉(zhuǎn)雄性大鼠新生雌激素化作用誘導(dǎo)的變化。以DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型研究抗腫瘤活性圖4圖示腫瘤生長(PD)與腫瘤穩(wěn)定(SD)、腫瘤消退(PR)和腫瘤消失(CR)的相對數(shù)量。發(fā)現(xiàn)HMR的抗腫瘤作用具有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。在本模型中抗腫瘤作用沒有明顯的劑量相關(guān)性。因此可將HMR的抗氧化和促腫瘤消退特性與體內(nèi)的抗腫瘤活性聯(lián)系起來。HMR的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制還不清楚。使用不同劑量的HMR后鼠尿中的代謝產(chǎn)物分析圖5說明HMR在大鼠中的主要排泄代謝物是可能為生物活性化合物的腸內(nèi)酯?？紤]到HMR的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這是令人驚訝的，因為人們會認(rèn)為羥基腸內(nèi)酯是主要的代謝物。HMR轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯的代謝機(jī)制可能是通過腸道菌叢催化而不是通過大鼠肝催化。結(jié)論羥基烏臺樹脂酚(HMR)以未改變的化合物和/或轉(zhuǎn)化為腸內(nèi)酯后在DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型中都具有抗腫瘤活性。因此HMR具有在乳腺癌(BC)、前列腺癌(PC)、結(jié)腸癌或良性前列腺增生(BPH)的風(fēng)險人群中發(fā)揮有益作用的潛力。HMR在體外代謝生成可抑制芳構(gòu)化的腸內(nèi)酯。HMR還可以作為芳構(gòu)酶抑制劑的前體防止發(fā)生下泌尿道癥狀(LUTS)、膀胱不穩(wěn)定狀態(tài)、膀胱出口梗阻、尿道協(xié)同失調(diào)和男子乳房發(fā)育癥。HMR還有很強(qiáng)的抗氧化活性，因此可以用作食品添加劑(抗氧化劑)。HMR作為藥品或食品添加劑對人類具有有益的心血管作用。在食品中加入HMR制造創(chuàng)新的新型功能食品、營養(yǎng)藥品、健康食品、藥用食品、防癌食品或新穎食品是可行的。
應(yīng)該知道，本發(fā)明方法可以各種不同形式的實(shí)施方案表現(xiàn)，在此只有公開了其中少數(shù)部分。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道存在其他實(shí)施方案而沒有偏離本發(fā)明的精神。因此，所述實(shí)施方案僅是為了說明本發(fā)明，而不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明。
表1人糞菌叢體外發(fā)酵不同的植物食品的哺乳動物木酚素產(chǎn)量μg/100g亞麻子粉 68000大豆 170谷糠小麥 570燕麥 650完整谷類糧食黑麥 160馬鈴薯 80胡蘿卜 350洋蔥 1101Thompson等Nutrition和Cancer 1643-52，1991表2脂類過氧化抑制試驗測定木酚素和一些相關(guān)的類黃酮的體外抗氧化特性化合物 抗氧化能力(t-BuOOH-LP)IC50(μM)類黃酮莰非醇(3，4’，5，7-四羥基黃酮) 0.9櫟精(3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮) 0.4莰非素(3，5，7-三羥基-4’-甲氧基黃酮) 0.5木酚素腸內(nèi)酯 15.92，3-二-(3’-羥芐基)-丁內(nèi)酯腸二醇 12.72，3-二-(3’-羥芐基)-丁烷-1，4-二醇羥基烏臺樹脂酚 0.08表3HMR和已知抗氧化劑體外抗氧化活性的比較。表中所列為IC-50濃度，例外的是過氧自由基清除測定為化學(xué)計量系數(shù)(即1摩爾受試化合物可以清除的過氧自由基摩爾數(shù))。
HMR1TROLOX2BHA3BHT4對脂類過氧化的抑制作用 0.06μM 0.02 1.1μM15.3μM對LDL氧化的抑制作用 2.0μM2.7μM 未測定過氧化物陰離子的清除5.6μM25 μM 15 μM ＞1mM過氧自由基的清除1∶4 1∶2 未測定1羥基烏臺樹脂酚2水溶性的維生素E衍生物3叔丁對甲氧酚(合成抗氧化劑)4丁基化羥基甲苯(合成抗氧化劑)測定方法如正文中所述。表4HMR作用四周后對雄性大鼠生殖器官相對重量1的影響。
1數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mg/kg體重)。HMR處理后各組的相對重量與安慰劑組無顯著差異。表5HMR作用四周后對雄性大鼠睪丸激素和LH濃度的影響1
1數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。HMR處理后各組的激素濃度與相應(yīng)的安慰劑組都沒有顯著性差異。
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)防人體癌癥、某些非癌癥激素依賴型疾病和/或心血管疾病的方法，該方法包括給予所述病人有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非癌癥激素依賴型疾病選自下泌尿道癥狀(lower urinary tract symptoms)、尿道協(xié)同失調(diào)、膀胱不穩(wěn)定狀態(tài)、膀胱出口梗阻、良性前列腺增生和男子乳房發(fā)育癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述心血管疾病因血清氧化LDL所致。
5.一種增加人血清腸內(nèi)酯或羥基烏臺樹脂酚其他代謝物水平、因而預(yù)防人體癌癥或某些非癌癥激素依賴型疾病的方法，該方法包括給予給所述病人有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述非癌癥激素依賴型疾病選自下泌尿道癥狀、尿道協(xié)同失調(diào)、良性前列腺增生和男子乳房發(fā)育癥。
8.一種藥用制劑，它包含有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受載體。
9.一種用作食品添加劑的產(chǎn)品，它包括富含羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的液體或固體材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的產(chǎn)品，其中所述食品選自功能食品、營養(yǎng)添加劑(nutritional supplement)、營養(yǎng)劑、藥用食品(pharmafood)、營養(yǎng)藥品(nutraceutical)、健康食品、防癌食品(designer food)或任何食品。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的產(chǎn)品，其中所述食品是以下形式的功能食品奶油、人造奶油、餅干、面包、蛋糕、糖果、甜食(confectionery)、酸奶或其他發(fā)酵奶制品、或谷類糧食如muesli。
12.一種食品，它包含有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的食品，其中所述食品選自功能食品、營養(yǎng)添加劑、營養(yǎng)劑、藥用食品、營養(yǎng)藥品、健康食品、防癌食品或任何食品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的食品，其中所述食品是以下形式的功能食品奶油、人造奶油、餅干、面包、蛋糕、糖果、甜食、酸奶或其他發(fā)酵奶制品、或谷類糧食如muesli。
15.一種增加食品穩(wěn)定性的方法，該方法包括在所述食品中添加有效量的羥基烏臺樹脂酚或其幾何異構(gòu)體或立體異構(gòu)體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中增加食品的穩(wěn)定性包括抑制脂類、維生素和色素的氧化作用，該氧化作用可導(dǎo)致食品失去營養(yǎng)價值以及產(chǎn)生臭味。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防人類癌癥、某些非癌癥激素依賴型疾病和/或心血管疾病的方法,該方法基于給予所述病人羥基烏臺樹脂酚。本發(fā)明還涉及提高人體血清腸內(nèi)酯或其他種羥基烏臺樹脂酚代謝物的水平、因此而預(yù)防人類癌癥或某些非癌癥性激素依賴性疾病的方法,該方法基于給予所述病人羥基烏臺樹脂酚。此外,本發(fā)明涉及包含羥基烏臺樹脂酚的藥用制劑、食品添加劑和食品。
文檔編號A61K31/365GK1345315SQ00805542
公開日2002年4月17日 申請日期2000年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月30日
發(fā)明者M·奧圖帕, C·?？藸柭? L·坎加斯, S·梅克萊, N·薩爾里寧, R·桑蒂, A·維里 申請人:霍莫斯?fàn)I養(yǎng)藥品有限公司