專利名稱：淫羊藿多糖及其在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多糖類的醫(yī)藥配制品及其醫(yī)藥用途，特別是一種淫羊藿多糖及其在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用。
淫羊藿(Epimedium)又名仙靈脾，為小蘗鹼科(Berberidaceae)植物，是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕、益氣類中藥，并有鎮(zhèn)咳、去痰、平喘、抑菌等作用，已在中醫(yī)藥組方中廣泛應(yīng)用。使用含有淫羊藿的復(fù)方煎劑、制劑、中成藥和各類粗提劑多有報(bào)道。
淫羊藿的化學(xué)成分主要有黃酮類化合物、木酯素、生物堿、多糖類和微量元素。
目前，臨床應(yīng)用和藥理實(shí)驗(yàn)的大量報(bào)道認(rèn)為，淫羊藿有效成分主要為黃酮類，多年來(lái)，人們一直集中精力對(duì)黃酮類的分離和應(yīng)用研究。且在確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)免疫等多種功能。如《中成藥研究》1987；(2)27-28介紹了“淫羊藿總黃酮促進(jìn)免疫功能的實(shí)驗(yàn)”。
國(guó)內(nèi)外對(duì)其它植物中提取多糖的方法，以及多糖作為生物調(diào)節(jié)劑的研究頗多。淫羊藿多糖對(duì)人體免疫功能的影響也曾有報(bào)道。
《中國(guó)免疫學(xué)雜志》1986年第2卷第2期報(bào)道了“淫羊藿多糖和淫羊藿甙對(duì)抑制性T細(xì)胞的作用”，對(duì)沒(méi)有說(shuō)明制備方法的自制淫羊藿多糖進(jìn)行抑制性T細(xì)胞誘導(dǎo)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明淫羊藿多糖和淫羊藿甙對(duì)抑制性T細(xì)胞具有相反的調(diào)節(jié)作用，提示中藥淫羊藿可能對(duì)機(jī)體免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用。
《中國(guó)免疫學(xué)雜志)》1985年第1卷第6期報(bào)道了“淫羊藿多糖促進(jìn)小鼠T和B細(xì)胞3H-TdR摻入和誘生干擾素作用的研究”，以自備但沒(méi)有公開制備方法的淫羊藿多糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。認(rèn)為是有效的免疫增強(qiáng)劑，并有誘生干擾素的作用。
通過(guò)加強(qiáng)腫瘤病人的免疫反應(yīng)作為治療腫瘤的一個(gè)途徑的嘗試，在臨床腫瘤學(xué)中已有幾十年的歷史。能引起對(duì)移植腫瘤排斥的腫瘤特異性抗原已在嚙齒類動(dòng)物中得到證實(shí)。在體外實(shí)驗(yàn)中，業(yè)已證明人的免疫效應(yīng)細(xì)胞具有殺死人腫瘤細(xì)胞的能力。
腫瘤免疫學(xué)認(rèn)為，腫瘤患者的預(yù)后與本人的免疫功能有關(guān)，利用非特異性的免疫治療劑能幫助其它根治療法延長(zhǎng)病人的緩解期或生存期。從天然產(chǎn)物中提取生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑及抗腫瘤藥物一直是受人重視的研究領(lǐng)域。在許多復(fù)雜的高分子化合物中，多糖類就是最引人注目的成分之一。在具有藥理活性多聚物的研究中，免疫激活性多糖是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域，也已發(fā)現(xiàn)多糖能夠激活巨嗜細(xì)胞。如香菇多糖和云芝多糖已在臨床上用于腫瘤的免疫治療。
但對(duì)淫羊藿多糖的成分、理化特性及其醫(yī)藥用途尚無(wú)系統(tǒng)和明確的研究報(bào)道。
本發(fā)明的目的是為了提供一種淫羊藿多糖(EPS)；本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了提供一種醫(yī)藥配制品及其醫(yī)藥用途，即淫羊藿多糖在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明是有區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的。
淫羊藿多糖的特征。
理化性質(zhì)該多糖為淡棕色粉末，氣微、味淡、比旋度[α]D23+6°(C＝0.1 H2O)；多糖A為棕色粉末，比旋度[α]D23+24°；多糖B淺黃色粉末，比旋度[α]D23+66°(C＝0.1 H2O)；均易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，Molishi反應(yīng)陽(yáng)性，蒽酮反應(yīng)陽(yáng)性，茚三酮反應(yīng)陰性。
分子量測(cè)定淫羊藿多糖為A、B兩部分組成，A部分的平均分子量為A＝1063009；B部分的平均分子量為B＝5522；總多糖的分子量為MW＝684710。
淫羊藿多糖的組成單糖分析及克分子比總多糖是由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖組成的雜多糖，克分子比為1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.12∶18.51。
多糖A的單糖組成是巖藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七種單糖，克分子比1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。
多糖B的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六種單糖，克分子比1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶19.1。
淫羊藿多糖的醫(yī)藥用途。
淫羊藿多糖在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用，淫羊藿多糖口服給予100～200mg/kg，對(duì)肺癌實(shí)體瘤和胸腹水型白血病均有一定的抑瘤趨勢(shì)，適用于乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌癥患者化療、放療需要輔助治療者。
制備淫羊藿多糖的分離方法簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，提取物純度高。可為臨床提供多糖類醫(yī)藥配置品的原料藥，用EPS多糖制備的膠囊劑型在癌癥患者放療、化療前后應(yīng)用，以及免疫功能低下患者使用，取得了滿意的臨床效果。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)淫羊藿多糖的提取方法、多糖的理化性質(zhì)、分子量測(cè)定、以及在制備治療腫瘤輔助藥物中和在制備治療促免疫作用藥物中的應(yīng)用，詳細(xì)描述

圖1為測(cè)定EPS的A、B分子量曲線圖。
圖2為測(cè)定EPS的A分子量曲線圖。
圖3為測(cè)定EPS的B分子量曲線圖。
圖4為EPS和MAF在體外對(duì)鼠MΦ吞噬功能的影響。
圖5為EPS和ConA在體外對(duì)鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。
表1為不同劑量EPS對(duì)鼠MΦ吞噬功能的影響(半體內(nèi))。
表2為EPS在體內(nèi)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響。
表3為EPS對(duì)正常鼠DHR的影響。
表4為EPS對(duì)免疫抑制態(tài)鼠DHR的影響。
表5為EPS對(duì)荷瘤鼠DHR的影響。
表6為EPS在體外對(duì)ConA的“解毒”作用(OD值)表7為EPS在體內(nèi)對(duì)鼠實(shí)體型S180的作用。
表8為EPS在體內(nèi)對(duì)腹水型S180的作用。
表9為EPS與化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼠實(shí)體型S180的作用。
表10為EPS與化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼠實(shí)體型HepA的作用。
表11為EPS對(duì)鼠肺腺癌LA-795的作用。
表12為EPS對(duì)鼠白血病L845的作用。
表13為EPS及ADM在體外對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞的作用。
表14為EPS對(duì)人NK細(xì)胞活性的影響。
表15為EPS腹腔給藥引起的T739鼠死亡數(shù)。
表16為臨床病人分類情況。
表17為口服EPS 200-1000mg/日功能指標(biāo)測(cè)定結(jié)果。
本發(fā)明采用朝鮮淫羊藿(Epimdium Koreanum Nakai由東北采集)的莖、葉入藥提取總多糖。
淫羊藿生藥1kg，加水10、8、6倍，加熱80-100℃，三次提取，首次2小時(shí)，后兩次各1小時(shí)，過(guò)濾，合并三次提取液，濃縮成1∶3(按生藥計(jì))的浸膏。向內(nèi)加入95％乙醇，使含純量達(dá)70％，攪勻，放置12-24小時(shí)，過(guò)濾得沉淀物。將沉淀物于5-10倍的蒸餾水中，攪勻，放置2-4小時(shí)，過(guò)濾，除去不溶物，濾液濃縮到一定體積后，加入95％乙醇再重復(fù)沉淀一次，得固體沉淀物，將其溶于15-20倍蒸餾水中，攪勻，放置2-4小時(shí)，過(guò)濾，濾液薄膜濃縮至小體積。向?yàn)V液中加入95％乙醇，使含純量達(dá)85％，攪勻放置12-24小時(shí)，抽濾得沉淀物即棕色粗多糖。
取粗多糖溶于500ml蒸餾水中，加入氯仿∶丁正醇為5∶1的混合溶劑100ml，劇烈振搖片刻，然后離心除去蛋白質(zhì)，水層重復(fù)三次(2％茚三酮液檢查陰性)水層逆向流水透析24小時(shí)，透析液薄膜減壓濃縮至小體積，加入4倍量95％乙醇使之沉淀，放置4-6小時(shí)侯，抽濾，無(wú)水乙醇洗滌，抽干，置入五氧化二磷的干燥器中減壓干燥，得淫羊藿總多糖7g；取總多糖3g溶于50ml蒸餾水中轉(zhuǎn)入透析袋中，以蒸餾水透析36小時(shí)，取出透析袋內(nèi)液體，濃縮，醇沉，抽濾，沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌，抽干，放入五氧化二磷的干燥器中減壓干燥，得棕色粉末為淫羊藿多糖A 1.2g。
將前24小時(shí)透析液，薄膜低溫濃縮至小體積，冷凍干燥得淺黃色粉末為多糖B 0.4g。
淫羊藿多糖的成分及特征理化性質(zhì)該多糖為淡棕色粉末，氣微、味淡、比旋度[α]D23+6°(C＝0.1 H2O)；多糖A為棕色粉末，比旋度[α]D23+24°；多糖B淺黃色粉末，比旋度[α]D23+66°(C＝0.1 H2O)；均易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，Molishi反應(yīng)陽(yáng)性，蒽酮反應(yīng)陽(yáng)性，茚三酮反應(yīng)陰性。
含量測(cè)定采用苯酚—硫酸法測(cè)定淫羊藿多糖含量為20.42％。
采用蒽酮-硫酸法測(cè)定淫羊藿多糖含量為31.25％。
按葡萄糖計(jì)算不低于18％。
純度檢查經(jīng)HPLC檢查和HPGPC檢查A為均一體。
元素分析
取少量總多糖進(jìn)行元素分析，分析結(jié)果不含氮。
紅外光譜分析淫羊藿多糖以BrK壓片，在400-4000cm-1處掃描，結(jié)果淫羊藿多糖具有多糖的特征吸收峰3366，2491，1601，1422，1324，1254，1097，605cm-1；多糖A的吸收峰3400(OH)，2920，1612，1422，1242，1024，892，763，617，582cm-1。
紫外光譜分析淫羊藿多糖水溶液在200-400區(qū)間進(jìn)行紫外掃描，在260，280nm出均未見到有核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰。
分子量測(cè)定應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定分子量(BECKMAN332-HPLC，流動(dòng)相水流速0.7ml/min，溫度；室溫，檢測(cè)器UV-NM柱子waters(1)Bondagel E-Linear TM.②Bondagel E-1000TM；③ц Bondagel E-1251TM。三根柱子串聯(lián)使用。)以T系列標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖T-10、T-20、T-40、T-80、T-500(由中國(guó)醫(yī)科院血研所提供)為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。多糖樣品以相同樣品進(jìn)樣，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得分子量。
圖1、2、3分子量曲線顯示的測(cè)定結(jié)果淫羊藿多糖為A、B兩部分組成，二者比例為3∶1，A部分的平均分子量為A＝1063009；B部分的平均分子量為B＝5522；總多糖的分子量為MW＝684710。
淫羊藿多糖的組成單糖分析及克分子比①紙層析多糖20mg.2N H2SO4水解6小時(shí)，Ba(OH)2中和，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至2ml，進(jìn)行紙層析，以七種單糖作對(duì)照。
展開劑乙酸乙酯∶吡啶∶醋酸∶水為5∶5∶1∶3結(jié)果顯示出六種主要單糖。
②以氣相色譜法(GC)測(cè)定單糖組成以總多糖30mg.以2N的H2SO4水解6小時(shí)，以Ba(OH)2中和，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，加入40mg鹽酸羥胺，加0.7ml吡啶，在90℃甘油浴上回流30min，冷至室溫后再加0.7ml醋酐，同樣溫度下再繼續(xù)反應(yīng)30min，減壓蒸去溶劑，加2ml氯仿，溶解后作氣相色譜分析；以木糖成醇為內(nèi)標(biāo)；用七種標(biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)同樣處理。相同條件下進(jìn)行氣相層析定性，以面積歸一化法計(jì)稱多糖中各單糖的相對(duì)含量。
總多糖是由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖組成的雜多糖，克分子比為1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.12∶18.51。
多糖A的單糖組成是巖藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七種單糖，克分子比1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。
多糖B的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六種單糖，克分子比1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶19.1。
淫羊藿多糖在制備治療促免疫作用藥物中的應(yīng)用，其特征在于淫羊藿多糖具有明顯的促免疫作用藥效學(xué)研究一.淫羊藿多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響1.半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)淫羊藿多糖配成5mg/ml溶液，供小鼠灌胃用。
陽(yáng)性對(duì)照物卡介苗(BCG)凍干皮上劃痕用卡介苗，批號(hào)8623，北京生物制品研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小白鼠，體重20g±2g按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前6-8天，將小鼠隨機(jī)分組I-III組分別給不同劑量的EPS，連續(xù)灌胃6天，IV組為陽(yáng)性對(duì)照，給BCG125mg/kg腹腔注射，V為陰性對(duì)照，口服灌胃同量的水。6天后，取2％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml給每鼠腹腔注射，半小時(shí)后，抽腹腔洗液滴于玻片孵箱溫育，漂洗、固定、染色，鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，并按吞噬百分率和吞噬指數(shù)計(jì)算。
吞噬百分率＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100％吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞÷2如表1所示，口服給予75-100mg/kg/d×6天的淫羊藿多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有非常明顯的促進(jìn)作用。
2.體外實(shí)驗(yàn)淫羊藿多糖用磷酸緩沖液PBS溶液制成2mg/ml溶液，高壓滅菌，4℃?zhèn)溆谩?br> 動(dòng)物選用DBA/2小鼠，8-12周齡，由醫(yī)科院腫瘤醫(yī)院動(dòng)物室提供。
腹腔巨噬細(xì)胞的制備經(jīng)腹腔注射1ml/只鼠1％巰基乙醇酸鈉(TG北京化工廠)。3-6天后用PBS沖洗腹腔收集腹腔滲出細(xì)胞(PEC)。洗滌后重懸于含15％小牛血清的RPMI1640(Nissui Tokyo)液中，調(diào)濃度至2×106/ml。按0.1ml/孔接種于96孔平底組織培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃，5％CO2孵箱中溫育1-2小時(shí)后用溫PBS洗滌去除非粘附細(xì)胞，貼壁者即為所需Mφ。
巨噬細(xì)胞活化因子(MAF)的制備根據(jù)Meltzer的方法。無(wú)菌摘去小鼠脾臟并在無(wú)血清中制成單細(xì)胞懸液，調(diào)有核細(xì)胞濃度至10×106/ml，加入3μg/ml刀豆蛋白A，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)束后于3000-4000rpm離心20分鐘，收集上清，再于0.25微孔濾紙過(guò)濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> EPS和MAF處理Mφ分別以500、250、125、63、31、16、0μg/ml(終濃度)的EPS加入各實(shí)驗(yàn)孔，其中0μg/ml為空白對(duì)照，另設(shè)EPS+MAF(35％終濃度)和EPS+MAF(17.5％終濃度)兩組以資比較。
Mφ吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)上述培養(yǎng)板內(nèi)的Mφ經(jīng)EPS或MAF處理24小時(shí)后，每孔加入0.4％中性紅(上海試劑三廠)0.1ml，半小時(shí)后吸去全部培養(yǎng)液，PBS洗三遍，加入0.1ml 75％乙醇，振蕩5分鐘，在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上用490nm波長(zhǎng)測(cè)各孔光密度(OD)。值。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行孔，每實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式根據(jù)一次有代表性的實(shí)驗(yàn)給出，用Student′s檢驗(yàn)決定處理的顯著性。
圖4結(jié)果表明，EPS在體外促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的最佳劑量是125μg/ml(31-250μg/ml)。EPS與巨噬細(xì)胞活化因子MAF合用時(shí)有協(xié)同作用出現(xiàn)，使巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力增加1-3倍。二EPS對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞功能的影響1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)EPS同上。左旋咪唑(LMS，廣州第七制藥廠)作為陽(yáng)性對(duì)照物。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明種小鼠。
實(shí)驗(yàn)分為III組，I組連續(xù)五天每天口服灌胃100mg/kg的EPS觀察待測(cè)藥的活性，II組為陽(yáng)性對(duì)照藥，分別在1、3、5各天共三次腹腔注射0.5mg/kg的LMS，III組給水作陰性對(duì)照。于給藥前和給藥后1-7天，每天剪尾取血推片，瑞士染色油鏡下數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，按以下標(biāo)準(zhǔn)觀察淋巴細(xì)胞及過(guò)渡型細(xì)胞所占的百分率淋巴母細(xì)胞的形態(tài)胞體比正常大3-4倍，呈圓形或橢圓形，胞漿常有偽足突出，染色淡藍(lán)，常有空泡，胞核增大，核質(zhì)疏松，常呈細(xì)絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見核分裂象。過(guò)渡型細(xì)胞的形態(tài)介于上述母細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞之間，體積稍大，多在12-15μm之間，胞漿稍多，淡蘭色，核稍大，核質(zhì)疏松，與大淋巴細(xì)胞的區(qū)別是后者核較致密，胞漿較少，噬堿性強(qiáng)，各組淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為兩種細(xì)胞之和，最后按均值進(jìn)行T檢驗(yàn)。
表2結(jié)果表明，經(jīng)口服給予EPS 100mg/kg/d×5天可以非常明顯地提高小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。②小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用左旋咪唑(LMS，廣州第七制藥廠)作為提高細(xì)胞免疫功能的對(duì)照藥，用2.4-二硝基氯苯(DNCB，北京化工三廠)作為遲發(fā)超敏反應(yīng)(DHR)的致敏原，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用T739近交系小鼠，雌雄兼用，體重20±1g。實(shí)驗(yàn)擬觀察正常鼠，免疫抑制態(tài)鼠和荷瘤鼠三種情況，因此采用環(huán)磷酰胺(CTX，上海第十二制藥廠)作為免疫抑制劑，小鼠荷瘤用細(xì)胞系為肺癌LA-795。
小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)測(cè)定方法按照Lundy等人報(bào)道的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)共分V組進(jìn)行，I-III組為隔日共5次口服灌胃分別給予75、100、125mg/kg的EPS，IV組為口服灌胃7.5mg/kg×5劑量的LMS作為陽(yáng)性對(duì)照組，V組為口服灌胃同容積的水作為空白對(duì)照組。首次致敏在正常鼠或荷瘤鼠的背部皮下每只注入2.5％DNCB丙酮溶液10μl。然后在第9-10天進(jìn)行攻擊，用0.5％DNCB丙酮溶液在小鼠一后足掌上皮內(nèi)注射10μl，另一足同法注射10μl丙酮作為對(duì)照。攻擊后48小時(shí)，將DNCB攻擊足及對(duì)照足于踝關(guān)節(jié)處切下，放入Lundy測(cè)量裝置，測(cè)出足腫脹程度，用μl表示，DNCB攻擊足與丙酮攻擊足(對(duì)照)的μl之差值為DHR值，然后分別求出其均值及標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行組間的比較和顯著性檢驗(yàn)。
觀察免疫抑制狀態(tài)DHR反應(yīng)時(shí)，前述I-V組均用CTX處理，方法是在致敏后第1、7天分別腹腔注射15ng/kg的CTX，使之造成免疫抑制狀態(tài)，另外設(shè)一第VI組，不給CTX，作為正常對(duì)照組。
觀察荷瘤鼠的DHR時(shí)，方法同上，但要在首次致敏前4天首先接種小鼠肺腺癌LA-795，接種細(xì)胞數(shù)3×106/只，位置為右腋皮下。
表3結(jié)果表明，口服灌胃給予75mg/kg/d×5的EPS對(duì)正常鼠的遲發(fā)超敏反應(yīng)有明顯的增強(qiáng)作用。
如表4所示50-75mg/kg/d的EPS對(duì)免疫抑制狀態(tài)小鼠的遲發(fā)超敏反應(yīng)有明顯的免疫恢復(fù)作用，且可使之恢復(fù)到正常水平。
表5結(jié)果表明，合適劑量(約50mg/kg×7)的EPS可以使荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫水平恢復(fù)至正常狀態(tài)。2體外實(shí)驗(yàn)—體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取DBA/2小鼠脾，剪碎、研磨、過(guò)網(wǎng)，洗一遍，0.83％Tris-NH4CI處理2分，洗三遍，將細(xì)胞懸浮于RPMI 1640(Nissui Tokyo)培養(yǎng)液中，內(nèi)含10％小牛血清，調(diào)濃度5×106/ml。將細(xì)胞分種在96孔板中，每孔0.1ml。分組，每組三復(fù)孔，按組加入不同濃度的淫羊藿多糖和刀豆球蛋白(Con A.Sigma)，于37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)60-70小時(shí)，結(jié)束前4小時(shí)加入濃度為5mg/ml的MTT(3-〔4，5-dimethylthiazol—2—y1〕—2，5-diphenyltetrazolium bromide，Sigma)10μl/孔，終濃度1mg/ml，4小時(shí)后，吸去全部培養(yǎng)液，加入0.2ml/孔的DMSO(北京化工廠)，振蕩5分鐘，于酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(DG3022，華東電子管廠)的490～510nm處測(cè)定光密度(OD)值。
由圖5可見，125～250μg/ml的EPS可以使小鼠淋巴細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)化增加一倍左右。如果加用ConA，則在250μg/ml處出現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化增加2.5倍的現(xiàn)象，中效公式證明，合并指數(shù)小于1，說(shuō)明運(yùn)用合適的EPS和ConA，在中效劑量處出現(xiàn)協(xié)同作用。
如表5*所示，EPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最佳劑量為250μg/ml，過(guò)高時(shí)，轉(zhuǎn)化率降低，文獻(xiàn)記載，ConA作為細(xì)胞分裂原也具有上述特點(diǎn)，即超過(guò)一定劑量時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化出現(xiàn)抑制。由圖3可以看到，EPS能夠在一定限度內(nèi)，扭轉(zhuǎn)ConA劑量過(guò)大時(shí)所出現(xiàn)的抑制作用。
三.淫羊藿多糖的抑瘤作用1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①.EPS對(duì)實(shí)體型小鼠肉瘤S180的作用取腹腔傳代的小鼠肉瘤細(xì)胞S180(腹水)，用生理鹽水按1∶4稀釋，接種于BALB/c小鼠右前肢腋下，每只0.2ml。接種后24小時(shí)，隨機(jī)分組，每組7只，并開始以不同劑量的淫羊藿多糖灌胃7天，對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。第8天處死小鼠，分別稱小鼠體重和瘤重，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘤重的差異，按下式算出腫瘤抑制率22腫瘤抑制率＝(對(duì)照組平均瘤重—給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100％
由表6結(jié)果可見，50mg/kg的EPS連續(xù)飼藥7天，對(duì)實(shí)體型S180的抑制率可達(dá)32％，P值＜0.05。
②對(duì)腹水型S180的作用材料和方法同實(shí)驗(yàn)(1)，區(qū)別僅在于小鼠荷瘤為腹水型S180，觀察指標(biāo)為生命延長(zhǎng)率，按下式計(jì)算生命延長(zhǎng)率＝(治療組平均存活天數(shù)—對(duì)照組平均存活天數(shù))/對(duì)照組平均存活天數(shù)×100％由表7結(jié)果可見，淫羊藿多糖對(duì)腹水型S180無(wú)明顯抑制作用。
③EPS與化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼠實(shí)體瘤的作用材料和方法同實(shí)驗(yàn)①，隨機(jī)分組如下I.空白對(duì)照組；II.EPS組，50mg/kg，連續(xù)8天，灌胃；III.阿霉素(ADM，F(xiàn)armitalia Carloerba Italy)組，4mg/kg，第1、6天靜脈注射；IV.環(huán)磷酰胺(CTX，上海第十二制藥廠)組，50mg/kg，第1、6天腹腔注射；V.EPS+ADM組，用藥方法同II、III組；VI.EPS+CTX組，用藥方法同II、IV組。
由表8結(jié)果可見，EPS對(duì)實(shí)體型S180有明顯抑制作用(P＜0.01)，但與CTX或ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)未見抑瘤作用增加。
由表9可見，EPS對(duì)HepA有明顯抑制作用，但與ADM或CTX按上述劑量應(yīng)用時(shí)，未見抑瘤作用增加。
④EPS對(duì)實(shí)體型鼠肺腺癌LA-795的作用將鼠肺腺癌細(xì)胞接種于鼠T-739右前肢腋下，飼以EPS 15天，表10可見EPS對(duì)鼠肺腺癌LA-795有一定抑瘤作用，但P＞0.05。
⑤EPS對(duì)鼠白血病L845的作用將小鼠白血病細(xì)胞L845接種于T-739近交系小鼠的胸腔或腹腔，分別獲得胸水型或腹水型L845，按前述實(shí)驗(yàn)②的方法，飼以EPS，以生命延長(zhǎng)率為指標(biāo)，得結(jié)果如下如表11所示，EPS對(duì)鼠白血病L845有一定抑制作用，以對(duì)腹水型L845為著(P＜0.05)。
2.體外實(shí)驗(yàn)將EPS與腫瘤細(xì)胞直接置于體外培養(yǎng)系統(tǒng)，以期觀察EPS是否對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用。
選用V79、L929、Hela和K562四種常規(guī)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株，用前先消化使之成為單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至25,000～50,000/ml。接種于96孔板內(nèi)，0.1ml/孔，于37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后取出，加入不同濃度的淫羊藿多糖或阿霉素(陽(yáng)性對(duì)照)，每組三孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)束前4小時(shí)加入濃度為5mg/ml的溴化二甲噻唑聯(lián)苯四唑鹽(MTT)10μl/孔，終濃度1mg/ml。3-4小時(shí)后，抽去全部培養(yǎng)液，加入0.1ml/孔的鹽酸異丙醇，微量振蕩器振蕩5分，于酶聯(lián)免疫測(cè)定儀的570μm處測(cè)定各孔光密度(OD)值，按下式計(jì)算增殖抑制率增殖抑制率＝(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100％如表12結(jié)果所示，1,000μg/ml的EPS在體外對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用為34％，(P＜0.05)，其作用機(jī)制尚不清楚。EPS對(duì)其他三種腫瘤細(xì)胞在體外無(wú)任何抑制作用。
四.淫羊藿多糖對(duì)NK細(xì)胞的作用根據(jù)王長(zhǎng)安改進(jìn)的Korzeniewski的乳酸脫氫酶(LDH)法測(cè)定人的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。
試劑盒購(gòu)自上海第二醫(yī)科大學(xué)免疫研究所免疫II室。
效應(yīng)細(xì)胞制備取腫瘤病人或正常人靜脈血10ml，枸緣酸鈉抗凝，1,500rpm離心10分鐘，吸棄上清，取中間白細(xì)胞層，磷酸緩沖液(PBS)稀釋一倍，小心置于4ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(上海榮盛生物制劑廠)上，3,000rpm離心25分鐘，吸棄上清，輕輕吸出單個(gè)核細(xì)胞層，另管RPMI1640洗兩遍，繼用0.5％牛血清白蛋白(BSA)-RPMI1640液洗一遍，調(diào)細(xì)胞濃度至5×106/ml備用。
靶細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞系K562用含15％小牛血清的RPMI1640液于實(shí)驗(yàn)前一天傳代，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用RPMI1640培養(yǎng)液將K562洗兩遍，0.5％BSA-RPMI1640液洗一遍，調(diào)細(xì)胞濃度至1×105/ml備用。
細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在96孔板內(nèi)進(jìn)行，先加靶細(xì)胞K5621×104/孔，后加效應(yīng)細(xì)胞10～100×104/孔，實(shí)驗(yàn)組按不同濃度加入淫羊藿多糖，另設(shè)組測(cè)定自然釋放和最大釋放值，用NP-40(Nonidet P40 Fluka)破壞靶細(xì)胞作最大釋放測(cè)定(使用濃度為1％，即1ml NP-40溶于99mlRPMI1640中)。置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4小時(shí)，小心吸取每孔上清液100μl，置另一96孔板，隨后在每孔內(nèi)加入100μl LDH底物混合液0.2MPH8.2 Tris緩沖液內(nèi)含5.4×10-2ML(+)乳酸鈉、6.6×10-4M碘硝基氯化四氮唑(INT、Fluka)、2.8×10-4M吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS、Serra)及1.3×10-3M氧化型輔酶I(NDA、Sigma)，3分鐘后加IN HCI 50μl/孔中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上于490nm處測(cè)定每孔光密度值(OD)，按下式換算NK細(xì)胞殺傷活性NK細(xì)胞殺傷活性＝(T—S)/(M—S)×100％式中T為測(cè)定孔OD值，S為靶細(xì)胞自然釋放值，M為靶細(xì)胞最大釋放值。
由表13結(jié)果可見EPS對(duì)NK細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。
毒理學(xué)研究1.急性毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用T739近交系小鼠，體重20±2g。將動(dòng)物分成6組，分別腹腔注射不同劑量的淫羊藿多糖，然后在給藥的24、48、72小時(shí)，直到第7天分別記錄動(dòng)物中毒死亡情況，分別記錄動(dòng)物中毒死亡情況，用Karber氏法計(jì)算淫羊藿多糖LD50值及95％平均可信限L95。
表14可見實(shí)驗(yàn)中，大劑量組(如I、II組)在給藥后6小時(shí)，動(dòng)物開始出現(xiàn)閉目、少動(dòng)、心跳加快，24小時(shí)開始出現(xiàn)死亡。死亡后解剖未發(fā)現(xiàn)各臟器異常，經(jīng)計(jì)算淫羊藿多糖LD50值為2275±402mg/kg。
淫羊藿多糖經(jīng)口服灌胃的LD50未能測(cè)出，因?yàn)橛?倍于腹腔用藥量的淫羊藿多糖經(jīng)灌胃給藥7天未發(fā)現(xiàn)有動(dòng)物死亡，因此，只知口服用藥的LD50大于11.375g/kg。
腹腔注射LD50＝2303mg±296mg/kg。
無(wú)論口服或腹腔注射給藥，其毒性劑量與有效劑量相距20-100倍，因此安全性很高。
2長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)①.一般毒性實(shí)驗(yàn).
分別給大鼠灌胃EPS35、65、100mg/kg劑量。對(duì)照組灌以生理鹽水，連續(xù)90天，最后作血常規(guī)生化指標(biāo)及病理學(xué)檢查。結(jié)果是紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白含量，白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類，血小板計(jì)數(shù)及凝血時(shí)間均在正常范圍內(nèi)，生化指標(biāo)中除血糖有升高趨勢(shì)外，(仍在正常范圍內(nèi))，余均未見異常。給藥期間，各組大鼠外觀，行為也未見異常。病理組織學(xué)檢查，各給藥組與對(duì)照組比較，未見藥物所致的明顯病理改變。
②特殊毒性實(shí)驗(yàn).
經(jīng)生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和嚙齒類動(dòng)物微核試驗(yàn)三種方法檢查，未見其具有致突變性。經(jīng)致畸敏感期毒性實(shí)驗(yàn)未見生殖毒性。
淫羊藿多糖對(duì)BALB/c鼠所荷實(shí)體型肉瘤S180有明顯抑制作用；對(duì)鼠實(shí)體型肝癌有明顯抑制作用，而對(duì)鼠肺腺癌LA-795的抑制作用P值大于0.05，淫羊藿多糖對(duì)腹水型白血病L845也有明顯抑制作用。
淫羊藿多糖膠囊劑型的制備稱取淫羊藿多糖50克，加入淀粉賦形劑150克，混合均勻，分裝于膠囊內(nèi)，使膠囊內(nèi)含藥200mg/粒，裝瓶備用。這樣制備的醫(yī)藥配置品，可供臨床應(yīng)用。
適應(yīng)癥免疫功能低下者；乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌癥患者化療、放療需要輔助治療者；用法及用量口服給藥200mg/kg/次.1.6g/kg/日反應(yīng)及毒副作用毒性低，無(wú)不良反應(yīng)。
臨床試用情況I期臨床試驗(yàn)?zāi)康难芯咳梭w對(duì)淫羊藿多糖所能耐受的最大計(jì)量及毒副反應(yīng)，并提出安全有效的給藥方案。
病人收治標(biāo)準(zhǔn)①有或無(wú)病理或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的惡性腫瘤患者。
②在本院進(jìn)行綜合治療的休息期住院病人中的志愿者。
③化療后恢復(fù)期，未服用其他藥物的患者。
④肝、腎心功能無(wú)明顯異常。
⑤Karnofsky評(píng)分大于40分，預(yù)計(jì)生存期大于3個(gè)月。
⑥能長(zhǎng)期隨診的病人。
方法從初始劑量200mg/日口服開始，設(shè)為第一組，逐步經(jīng)200、300、400、600、800、1000mg/日過(guò)度到高劑量，每組病人3例，并根據(jù)反應(yīng)情況決定增量幅度，直至達(dá)到最大耐受量或最適給藥劑量。
觀察指標(biāo)①一般情況與活動(dòng)能力。②免疫指標(biāo)。③肝腎功能。
④心電圖。
圖15、16說(shuō)明篩選30例病人分類方法，及各項(xiàng)觀察指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果。
對(duì)乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等30例癌癥患者臨床I期試用，并進(jìn)行免疫功能、肝功能、腎功能及其它指標(biāo)檢測(cè)，病人情況確有改善。而且發(fā)現(xiàn)，癌癥患者對(duì)1.6g/日劑量耐受性很好，30例病人中有一例發(fā)現(xiàn)乏力，不適和肌肉酸痛，占3％，發(fā)生在400/mg日組，而1.6g/日組未見此現(xiàn)象。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試用證明淫羊藿多糖是一種很有發(fā)展前途的生物調(diào)節(jié)劑。
權(quán)利要求
1.一種淫羊藿多糖，由多糖組成，其特征在于a理化性質(zhì)該多糖為淡棕色粉末，氣微、味淡、比旋度[α]D23+6°(C＝0.1 H2O)；其中多糖A為棕色粉末，比旋度[α]D23+24°；多糖B淺黃色粉末，比旋度[α]D23+66°(C＝0.1 H2O)；均易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，Molishi反應(yīng)陽(yáng)性，蒽酮反應(yīng)陽(yáng)性，茚三酮反應(yīng)陰性；b.總多糖組成淫羊藿多糖為A、B兩部分組成的總多糖，是由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖組成的雜多糖；其中多糖A的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖；多糖B的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六種單糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淫羊藿多糖，其特征在于該多糖A部分的平均分子量為A＝1063009，B部分的平均分子量為B＝5500，總多糖的分子量為MW＝684710。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淫羊藿多糖，其特征在于總多糖是由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖組成的雜多糖，克分子比為1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.12∶18.51。多糖A的單糖組成是巖藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七種單糖，克分子比1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。多糖B的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六種單糖，克分子比1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶19.1。
4.淫羊藿多糖在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用，其特征在于淫羊藿多糖口服給予100-200mg/kg，對(duì)肺癌實(shí)體瘤和胸腹水型白血病均有一定的抑瘤趨勢(shì)，適用于乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌癥患者化療、放療需要輔助治療者。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種淫羊藿多糖及其在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用,屬于多糖類的醫(yī)藥配制品及其醫(yī)藥用途。該多糖是由A部分和B部分組成,包括鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七種單糖。淫羊藿多糖具有明顯的促免疫作用,是一種很有發(fā)展前途的生物調(diào)節(jié)劑。適用于乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌癥患者化療、放療需要輔助治療者。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1360894SQ0013588
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月25日
發(fā)明者孫燕, 張群喜, 吳迺居, 李惟敏 申請(qǐng)人:孫燕, 張群喜, 吳迺居, 李惟敏