一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，該方法由以下步驟組成：(1)取如SEQ ID NO.1所示的N端帶有6個his標(biāo)簽的人端粒酶C端第936-1132片段的編碼序列，經(jīng)雙酶切、連接反應(yīng)克隆至含有綠色熒光蛋白基因GFP的穿梭質(zhì)粒中，得到重組穿梭質(zhì)粒；(2)將得到的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行PmeⅠ酶切線性化，通過與骨架質(zhì)粒PAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒；(3)將得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行重組包裝，收集具有綠色熒光的細(xì)胞，得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒；(4)將得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒采用氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化，得到重組腺病毒載體。本方法所得到的重組腺病毒載體不僅可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而且起效快。
【專利說明】一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及含肽的醫(yī)藥配制品，具體涉及含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)C端的重 組載體的構(gòu)建方法，該方法所得到的重組載體可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

【背景技術(shù)】
[0002] 人DNA末端是非編碼的TTAGGG重復(fù)序列，即端粒。由于末端復(fù)制問題，正常體細(xì) 胞每分裂一次，端?？s短50-200bp，當(dāng)端?？s短到一定程度不能維持DNA的穩(wěn)定時，細(xì)胞即 開始凋亡或程序性死亡。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的最大區(qū)別之一是90%以上的腫瘤細(xì)胞表達(dá) 端粒酶活性，可以延長端粒，使腫瘤細(xì)胞得以永生。因此，端粒酶成為識別腫瘤細(xì)胞和正常 細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，成為抗腫瘤作用的重要靶點(diǎn)。
[0003] 傳統(tǒng)的通過抑制端粒酶活性抗腫瘤作用的抑制劑，如針對端粒酶模板區(qū)（hTR) 或逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)的反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyribonucleotides，ASODN) 都是抑制端粒酶活性，使端?？s短而發(fā)揮抗腫瘤作用。但即使是腫瘤細(xì)胞其端粒也足夠 長（2?10kb)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞倍增時間一般>10h，即使沒有端粒酶，每天端粒縮短也只 有 0.1 ?0.2kb (Harley CB et al. Nature. 1990. 345 (6274): 458-460)。所以，端粒酶完 全被抑制使端?？s短到臨界點(diǎn)時一般也需要7?30天甚至更長才能發(fā)揮作用，尤其是 體內(nèi)給藥時（腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的倍增時間>30天）。在這個漫長的過程中，許多細(xì)胞的端 粒依然得以維持或代償，使得效果難以理想，往往都需要與化療或放療合用。近年來發(fā) 現(xiàn)，端粒酶除了通過延長端粒促進(jìn)腫瘤生長外，還有端粒外作用，如直接與NF-kB靶基因 啟動子DNA結(jié)合并與P65亞基作用啟動有關(guān)的癌基因表達(dá)（Martinez Pet al. Nat Rev Cancer. 2011. 11(3):161-176 ；Ghosh A et al. Nat Cell Biol. 2012. 14(12):1270-1281) 等，這些端粒外功能同樣可以促進(jìn)腫瘤的生長。目前的端粒酶抑制劑都是針對縮短端粒設(shè) 計的，對端粒外功能沒有影響，這也是端粒酶抑制劑效果不理想的重要原因之一。這類藥物 中研究較多、也是唯一進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物是GRN163L (又叫Imetelstat)，但起效慢，效果 也難以令人滿意（Crees Z et al.Curr Pharm Des.2014;20(41):6422-37)。
[0004] 另一類進(jìn)入臨床試驗(yàn)的針對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的抗腫瘤藥物是hTERT抗原肽。腫瘤 細(xì)胞可以將hTERT的部分肽段呈遞在細(xì)胞膜上作為腫瘤細(xì)胞的特異性抗原，將這些特異性 抗原呈遞給樹突狀細(xì)胞（DCs)可誘發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用。體外合成這些短 肽或用病毒載體表達(dá)這些短肽作為抗原，可特異性殺傷端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞，如Vx-001 疫苗（Kotsakis A et al. Ann Oncol. 2012, 23 (2): 442-9)。hTERT 抗原肽用于腫瘤的免疫 治療，免疫原性較低，治療窗較窄，只適用于表達(dá)相應(yīng)的hTERT抗原肽的腫瘤細(xì)胞，臨床使 用首先要篩選腫瘤抗原類型，分離自身樹突狀細(xì)胞并反復(fù)致敏后回輸體內(nèi)。操作復(fù)雜，療效 較低。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的 構(gòu)建方法，該方法所得到重組腺病毒載體不僅可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而且起效快。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：
[0007] -種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，該方法由以下步驟組成：
[0008] (1)取如SEQ ID NO. 1所示的N端帶有6個his標(biāo)簽的人端粒酶C端第936-1132 片段（命名為C197)的編碼序列，經(jīng)雙酶切、連接反應(yīng)克隆至含有綠色熒光蛋白基因GFP的 穿梭質(zhì)粒中，得到重組穿梭質(zhì)粒（命名為PAdTrack-GFP-C197);
[0009] (2)將得到的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行Pme I酶切線性化，通過與骨架質(zhì)粒PAdEasy-1在 BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒；
[0010] (3)將得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行重組包裝，收集具有綠色熒光 的細(xì)胞，得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒；
[0011] (4)將得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒采用氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化，得到重組腺 病毒載體（命名為Ad-GFP-C197)。
[0012] 上述方法中，所述SEQ ID NO. 1所示基因片段由上海生物公司根據(jù)本發(fā)明人所提 供的序列合成。
[0013] 上述方法中，含有綠色熒光蛋白基因GFP的重組腺病毒載體系統(tǒng)AdEasy-1由南 方醫(yī)科大學(xué)李紅衛(wèi)教授惠贈，其制備方法參照以下文獻(xiàn)所記載方法進(jìn)行：Xia〇-Ying He， et al. Recombinant adenovirus-mediated human telomerase reverse transcriptase gene can stimulate cell proliferation and maintain primitive characteristics in bovine mammary gland epithelial cells. Develop. GrowthDiffer. (2011)53,312 - 322。
[0014] 本發(fā)明是將hTERT羧基端（c-端）197個氨基酸的DNA重組到腺病毒載體，該載 體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后高效表達(dá)目的蛋白（C197)。hTERT是含有1132個氨基酸的蛋白質(zhì)，包 括N-端、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)、C-端。其中，C-端主要是與端粒DNA結(jié)合區(qū)，含核轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵信號，可 以進(jìn)入細(xì)胞核。由于本發(fā)明所述的人端粒酶C端第936-1132片段（C197)失去了 N-端和 逆轉(zhuǎn)錄區(qū)，因此其本身沒有端粒酶活性，但可以與hTERT競爭端粒結(jié)合位點(diǎn)，抑制端粒酶活 性。以端粒酶為靶點(diǎn)的的其他藥物，因其抑制端粒酶活性可使端?？s短，但端粒酶活性抑制 至端?？s短到臨界值至少需要20天以上，起效時間較長。如目前唯一進(jìn)入臨床試驗(yàn)的針對 端粒酶活性的抑制劑GRN163L對體外胰腺癌細(xì)胞增殖抑制作用起效在40天后（Burchett KM et al. Telomerase inhibitor Imetelstat (GRN163L)limits the lifespan of human pancreatic cancer cells PLoS One. 20149 (1) : e85155?圖 3b.)。而本發(fā)明所述的重組腺 病毒Ad-GFP-C197能夠高效表達(dá)C197cDNA序列，并能夠同時與NF-kB靶基因啟動子DNA 結(jié)合，抑制NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性，因此在第三天就開始抑制腫瘤細(xì)胞增殖，動物實(shí)驗(yàn)中也可 快速抑制腫瘤生長?？梢?，本發(fā)明所述重組腺病毒的優(yōu)勢是同時通過端粒和端粒外作用抑 制腫瘤細(xì)胞增殖，起效快。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0016] 圖1為構(gòu)建本發(fā)明所述的重組腺病毒Ad-GFP_C197的流程圖，其中，⑷圖是穿梭 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，（B)圖是骨架質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017] 圖2為重組腺病毒質(zhì)粒PAd-GFP_C197雙酶切后瓊脂糖凝膠圖。
[0018] 圖3為重組腺病毒質(zhì)粒PAd-GFP-C197測序圖。
[0019] 圖4為重組腺病毒Ad-GFP-C197的一組鑒定結(jié)果圖，其中，（A)圖是轉(zhuǎn)化后得 HEK-293細(xì)胞出現(xiàn)70%左右熒光的顯微照片，（B)圖是蛋白免疫印跡圖，表明C197cDNA片 段在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，（C)圖是mRNA相對表達(dá)量柱狀圖，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明C197mRNA 在細(xì)胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄。
[0020] 圖5重組腺病毒Ad-GFP-C197體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT)的一組增殖曲線 圖，其中，（A)圖是Hela細(xì)胞的增殖曲線圖，（B)圖是Cac 〇2細(xì)胞的增殖曲線圖，（C)圖是 MCF-7細(xì)胞的增殖曲線圖，（D)圖是SGC7901細(xì)胞的增殖曲線圖。
[0021] 圖6為重組腺病毒Ad-GFP-C197對裸小鼠體內(nèi)皮下移植瘤生長抑制的一組實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖，其中，（A)圖為Ad-GFP_C197對control腫瘤塊組織與control裸鼠瘤生長抑制前后 的照片；(B)圖為腫瘤生長曲線圖，p〈0. 05, n = 6 ; (C)圖為腫瘤重量柱狀圖，p〈0. 05, n = 6〇

【具體實(shí)施方式】
[0022] 例1 (構(gòu)建重組腺病毒載體）
[0023] 一、材料：
[0024]1、重組腺病毒骨架質(zhì)粒PAdEasy-1和穿梭質(zhì)粒PAdTrack-GFP-CMV，BJ5183、 DH5 a、HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞均本實(shí)驗(yàn)室保存；
[0025]2、引物：用DNAMAN軟件設(shè)計擴(kuò)增SEQ ID NO. 1所示DNA序列的引物，該引物由上 海生物公司合成，具體為：
[0026] 引物 1 :5, -AGGGTCGACACCATGCATCATCACCATCACCAT-3,（SEQ ID N0. 2)，
[0027] 引物 2 :5'-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3'（SEQ ID NO. 3);
[0028] 3、SEQ ID NO. 1所示C197DNA序列由上海生物公司合成，并克隆至PGSI載體中保 存；
[0029]4、工具酶 Sal I、Ecor V、Pme I、Pac I 均購自 Takara 公司；
[0030] 5、T4DNA連接酶、Ex-Tag酶均購自Thermo公司；
[0031]6、6_his tag抗體，羊抗鼠IgG抗體，0-Actin抗體均購自Santa公司。
[0032] 二、方法：
[0033] 參見圖1本發(fā)明所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法如下：
[0034] 1、his-C197DNA 片段克隆至穿梭質(zhì)粒 PAdTrack-GFP-CMV 中
[0035] (1)將含SEQ ID NO. 1所示C197DNA片段的pGSI載體進(jìn)行雙酶切（Sal I和Ecor V酶），酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收C197DNA片段。
[0036] (2)穿梭質(zhì)粒PAdTrack-GFP-CMV分別用Sal I和Ecor V限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶 切，隨后在T4DNA連接酶作用下與C197DNA片段在37°C連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒 定大小正確后回收，獲得重組穿梭質(zhì)粒PAdTrack-GFP-C197。
[0037] 2、同源重組得到重組腺病毒質(zhì)粒：
[0038] (1) Pme I酶切線性化PAdTrack-GFP_C197后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入到含有骨架質(zhì)粒 PAdEasy-1的BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒。
[0039](2)以重組腺病毒質(zhì)粒為模板，(：197(^嫩片段的上游引物5￡〇10勵.2，下游引物 SEQ ID NO. 3進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和基因序列測序，同時用SalI和Ecor V限制性內(nèi)切酶對 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。
[0040] 3、重組腺病毒的包裝
[0041] (1)將重組大質(zhì)粒用Pac I酶切線性化后，用脂質(zhì)體2000將線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進(jìn)入 HEK293細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒包裝,一周后可觀察到綠色熒光。
[0042] (2)待細(xì)胞出現(xiàn)CPE病變現(xiàn)象時，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心（3000r，4°C)收 集上清，得到重組腺病毒原液。
[0043] 4、重組腺病毒的擴(kuò)增與純化
[0044] (1)將收集好的重組腺病毒Ad-GFP-C197原液感染新一批對數(shù)生長期的HEK293細(xì) 胞，待細(xì)胞出現(xiàn)CPE病變現(xiàn)象，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心（3000r，4°C)收集病毒液。
[0045] (2)取2根Backman管，用75%乙醇浸泡30min后，于超凈臺風(fēng)干。
[0046] (3)將配制好1. 4和1. 2CsCl分別取2. 5ml裝入Backman管中（每管容量為5ml), 記。
[0047] (4)吸取備用的病毒液置于含有CsCl的Backman管中，用DMEM補(bǔ)平管口即可。
[0048] (5)將Backman管置于離心機(jī)真空離心，20000r，2h。
[0049] (6)小心取出Backman管可以看到明顯的兩條乳白色帶，上層為病毒帶，下層為雜 帶。
[0050] (7)取出5ml注射器，在超凈臺中于病毒帶位置插進(jìn)針頭，并吸出病毒帶，并將病 毒液置入透析袋中，在透析液中4°C攪拌下進(jìn)行透析，得到重組腺病毒載體Ad-GFP-C197。
[0051](8)透析后，取出透析袋，將病毒收集并分裝于-80°C儲存即可。
[0052]三、重組腺病毒載體Ad-GFP_C197的滴度測定
[0053] (1)以無血清培養(yǎng)基梯度稀釋重組腺病毒Ad-GFP_C197從1(T 2到KT6,取對數(shù)生長 期的HEK293細(xì)胞消化、計數(shù)、鋪24孔板，每孔2*105個細(xì)胞，每個梯度設(shè)3個復(fù)孔。
[0054] (2)待細(xì)胞貼壁后每孔滴加50ul稀釋好的對應(yīng)梯度下的病毒樣品。
[0055] (4) 37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，直接熒光顯微鏡下計數(shù)沒視野熒光細(xì)胞數(shù)，每 個梯度計數(shù)3個復(fù)孔，以每視野熒光細(xì)胞數(shù)10-50個為最佳。
[0056] (5)測得病毒滴度以PFU/ml表示，每個熒光細(xì)胞對應(yīng)一個綠色熒光形成單位。依 公式：滴度（PFU/ml)=(-個視野的熒光數(shù)*每孔對應(yīng)的視野數(shù)）/[加入病毒體積（ml)* 稀釋倍數(shù)]計算，上述步驟二所構(gòu)建的重組腺病毒載體的病毒滴度為3. MXlO^FU/ml。
[0057] 四、重組腺病毒載體Ad-GFP_C197的鑒定
[0058] 1、采用本發(fā)明構(gòu)建包裝重組腺病毒是否成功有以下兩種鑒定方法：
[0059] (1)由于GFP蛋白序列和C197DNA序列在重組腺病毒穿梭載體中由不同啟動子啟 動，即非融合表達(dá)，所以當(dāng)GFP蛋白表達(dá)出現(xiàn)綠色熒光也可推斷C197DNA序列也成功表達(dá)。 當(dāng)重組腺病毒Ad-GFP-C197感染細(xì)胞后，24h觀察到綠色熒光說明重組腺病毒包裝成功。
[0060] (2)重組腺病毒Ad-GFP-C197感染HEK293細(xì)胞后，收集細(xì)胞分別采用RT-PCR和 western blot進(jìn)行C197mRNA和蛋白的檢測，驗(yàn)證C197基因的表達(dá)，如果C197mRNA轉(zhuǎn)錄和 蛋白均表達(dá)，則進(jìn)一步說明重組腺病毒構(gòu)建成功。
[0061] 具體步驟如下：
[0062] 于6孔板中每孔鋪2*105個細(xì)胞，分別將M0I = 100的Ad-GFP-C197和Ad-GFP轉(zhuǎn) 染Hela細(xì)胞48h，提取6孔板中細(xì)胞的總蛋白和總RNA分別行免疫印跡實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。
[0063] 免疫印跡實(shí)驗(yàn)是通過SDS-PAGE將Hela細(xì)胞提取液中的各種蛋白按照相對分子質(zhì) 量大小分離。采用濕式轉(zhuǎn)膜（l〇〇v，90min)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。分別用一抗（his-tag 一抗稀釋度1:1〇〇〇和6八?011-抗稀釋度1:2000)41：孵育過夜，1打831'漂洗膜71^113次。 最后將膜在室溫下孵二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，稀釋濃度為1:5000)，2h后用1*TBST漂 洗膜7min 3次，加上ECL發(fā)光液，進(jìn)行顯影，定影和曝光。Trizol法提取6孔板中細(xì)胞的總 RNA，用C197的引物（引物序列同上）行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，以內(nèi)參GAPDH為對照組，驗(yàn)證 其mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。
[0064] 2、鑒定結(jié)果
[0065] 雙酶切產(chǎn)物跑膠后可見650bp條帶（見圖2)，測序結(jié)果也和目的序列一致（見圖 3)，則重組腺病毒大質(zhì)粒PAd-C197構(gòu)建成功，包裝后可見綠色熒光出現(xiàn)（見圖4A)，初步證 明該重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)正確。RT-PCR結(jié)果中his-C197mRNA轉(zhuǎn)錄水平是內(nèi)參GAPDH的 兩倍（見圖4B)，免疫印跡結(jié)果表明his-C197蛋白在重組腺病毒系統(tǒng)中表達(dá)（見圖4C)， 進(jìn)一步驗(yàn)證了重組腺病毒Ad-GFP-C197表達(dá)成功，即本發(fā)明所述的一種重組腺病毒載體 Ad-GFP-C197已成功建立。
[0066] 例2 (抗腫瘤作用效果實(shí)驗(yàn)）
[0067] 一、作用對象
[0068] 腫瘤細(xì)胞：Hela細(xì)胞，SGC7901細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞和CaC02細(xì)胞
[0069] 裸鼠成瘤：Hela細(xì)胞實(shí)體瘤，裸鼠是4-6周齡
[0070] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0071] 1、本發(fā)明所述的重組腺病毒Ad-GFP_C197用于感染多種腫瘤細(xì)胞并抑制細(xì)胞增 殖實(shí)驗(yàn)（MTT)的具體步驟如下：
[0072] (1)將Hela、MCF-7、SGC7901和CaC02細(xì)胞每孔1*104個鋪于96孔板中，待細(xì) 胞貼壁后將本發(fā)明所述重組腺病毒Ad-GFP-C197以M0I = 100分別感染腫瘤細(xì)胞（Hela、 SGC7901、MCF-7和CaC02)，同時以空白對照組（正常細(xì)胞）和對照病毒組Ad-GFP(空載體 病毒）作為對照，每組設(shè)6個復(fù)孔。
[0073] (2)次日在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，每隔24h采用MTT法進(jìn)行測定，即棄 去培養(yǎng)基，每孔加入含有l(wèi)OOul 5mg/ml MTT的培養(yǎng)基，37°C，5% C02濃度下培養(yǎng)4h ;
[0074] (3)取出板后，4°C、3000r離心lOmin，棄上清；加入100ul DMS0,振蕩lOmin，于 490nm波長的酶標(biāo)儀測量0D值。
[0075] (4)實(shí)驗(yàn)連續(xù)7d，根據(jù)每天的0D值（X土SD)繪制細(xì)胞增殖曲線，比較重組腺病毒 Ad-GFP-C197對腫瘤細(xì)胞的抑制情況。
[0076] 2、本發(fā)明所述的重組腺病毒Ad-GFP_C197對裸小鼠體內(nèi)皮下移植瘤生長抑制實(shí) 驗(yàn)，具體步驟如下：
[0077] (1)將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入1ml胰酶，待消 化好后加3ml全培終止消化。
[0078] (2)將全部細(xì)胞液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，1000r離心4. 5min，用PBS洗兩遍。用 4°C PBS:Matrigel (9. 4mg/ml) (1 :1)調(diào)整細(xì)胞密度為 5X 107 個 /ml，Matrigel 膠的終濃度 為2. 5mg/ml。細(xì)胞混懸液收集于50ml已滅菌青霉素瓶中，密封，置于冰上備用。
[0079] (3)每只裸小鼠后肢背部皮下接種Hela細(xì)胞混懸液0.2ml，待腫瘤生長至直徑 為4-6mm，將裸鼠分為二組：重組腺病毒Ad-GFP-C197組和control組（即Ad-GFP組）。 Ad-GFP-C197和Ad-GFP均以1*10 9PFU/次/只進(jìn)行瘤內(nèi)注射，給藥五周后則停止給藥，每次 給藥均測量腫瘤大小并記錄。
[0080] (4)裸鼠麻醉后行安樂死，取出腫瘤并稱重，根據(jù)每次測量的腫瘤大小繪制腫瘤生 長曲線，且根據(jù)腫瘤稱重繪制柱狀圖以比較重組腺病毒Ad-GFP-C197對腫瘤生長的抑制情 況。
[0081] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0082] 1、由圖5中增殖曲線可見，重組腺病毒Ad-GFP-C197對Hela、MCF-7、SGC7901和 Cac 〇2細(xì)胞均有抑制作用，且均于第三天開始出現(xiàn)抑制，第5-6天出現(xiàn)最大抑制率。由表1 可見，與Ad-GFP相比，Ad-GFP-C197能夠有效抑制Hela、Caco2、MCF-7和SGC7901生長，抑 制率高達(dá)50%。
[0083] 表1.重組腺病毒Ad-GFP_C197對腫瘤細(xì)胞的抑制效果
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，該方法由以下步驟組成： (1) 取如SEQ ID NO. 1所示的N端帶有6個his標(biāo)簽的人端粒酶C端第936-1132片段 的編碼序列，經(jīng)雙酶切、連接反應(yīng)克隆至含有綠色熒光蛋白基因 GFP的穿梭質(zhì)粒中，得到重 組穿梭質(zhì)粒； (2) 將得到的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行Pme I酶切線性化，通過與骨架質(zhì)粒PAdEasy-1在 BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得到重組腺病毒質(zhì)粒； (3) 將得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行重組包裝，收集具有綠色熒光的細(xì) 胞，得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒； (4) 將得到細(xì)胞包裝的重組腺病毒采用氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化，得到重組腺病毒 載體。
【文檔編號】C12N15/66GK104450786SQ201410784351
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】龐建新, 鄔賢, 丘玉昌, 曹瑩, 謝寶平, 周平正, 王杞妹, 陳嘉盛, 李紅衛(wèi) 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)