microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出被Brachyury調(diào)控后發(fā)生顯著上調(diào)的若干microRNAs，并對這一系列microRNAs進(jìn)行了Real-Time PCR驗(yàn)證。本發(fā)明提供了Brachyury陽性腫瘤的分子標(biāo)記物，該分子標(biāo)記物hsa-miR-4286、hsa-miR-449c在肺癌患者中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而在其它肺部實(shí)質(zhì)性病變患者和正常人群中則未見表達(dá)水平異常。本發(fā)明還提供了microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的microRNAs可以在腫瘤發(fā)生的早期進(jìn)行篩查或診斷，對于腫瘤的早期治療和醫(yī)療成本的節(jié)約都具有重要意義。
【專利說明】microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是microRNAs在制備早期篩查或診斷 Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著腫瘤發(fā)病率的日益增高，人類的健康和生命面臨巨大挑戰(zhàn)，對腫瘤的防治成 為醫(yī)學(xué)界刻不容緩的責(zé)任。如何早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療成為降低腫瘤死亡率最有效的途徑。 隨著在腫瘤分子和細(xì)胞層面研宄的不斷深入和現(xiàn)有治療方法如放療化療嚴(yán)重的副作用， "腫瘤靶標(biāo)"這一概念被廣泛認(rèn)可并進(jìn)行了大量的研宄，這一概念的核心是找到僅在腫瘤中 特異性表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或局限性表達(dá)的分子，通過"生物導(dǎo)彈"直擊腫瘤，并對 正常組織造成最小化的破壞。這一概念的出現(xiàn)和隨之而進(jìn)行的大量研宄正逐漸使腫瘤獨(dú)有 的特征具現(xiàn)化，并有可能最終"無所遁形"，也使得人類在與腫瘤的斗爭中掌握了一定的主 動權(quán)。對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和有效治療都有重大意義。
[0003] TATA-box轉(zhuǎn)錄因子Brachyury是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，其同源體 在諸多多細(xì)胞生物體內(nèi)表達(dá)，如秀麗線蟲、非洲爪蛙、老鼠、人類等胚胎中表達(dá)（參見 文獻(xiàn) Papaioannou VE, Silver LM, et al. The T-box gene family. Bioessays 1998 ； 20:9-19. Kispert A，Herrmann BGj et al. Homologs of the mouse Brachyury gene are involved in the specification of posterior terminal structures in Drosophila，Tribolium，and Locusta. Genes Dev 1994 ；8:2137-50. Herrmann BG，Labeit Sj et al. Cloning of the Tgene required in mesoderm formation in the mouse. Nature 1990 ;343:617-22)。T-box蛋白主要在中胚層的形成和分化中具有重要作用，在胚胎發(fā)育 晚期則在大部分組織中關(guān)閉表達(dá)僅集中于脊索區(qū)表達(dá)，并在脊柱形成后隨著脊索的退化消 失而在大多數(shù)正常成人組織中不表達(dá)，僅在睪丸中有表達(dá)、脾和小腸中有低水平表達(dá)的限 制性表達(dá)方式（參見文獻(xiàn) Duane H. Hamilton，Ph. D·，Postdoctoral Fellow，et al. Cancer vaccines targeting the epithelial-mesenchymal transition:tissue distribution of Brachyury and other drivers of the mesenchymal-like phenotype of carcinomas. Semin Oncol. 2012Jun;39(3) :358-66.)。然而，在已知的人類多種腫瘤組織和細(xì)胞系 中，Brachyuir卻呈現(xiàn)出高水平的表達(dá)，這些腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系是：小腸、胃、腎、膀 胱、子宮、卵巢、睪丸、腦和淋巴組織，肺組織、結(jié)腸組織和前列腺組織來源的細(xì)胞系（參見 文獻(xiàn) Palena Cj Polev DEj et al. The human T-box mesodermal transcription factor Brachyury is a candidate target for T-cell-mediated cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2007Apr 15 ； 13 (8) : 2471-8. Park JCjChae YKj et al. Epigenetic silencing of human T (brachyury homologue)gene in non-small-cell lung cancer.Biochem Biophys Res Commun.2008Jan 11 ;365(2) :221-6.) D 以上研究結(jié)果都提;了 Brachyury 可 以應(yīng)用于多種來源的腫瘤診斷和治療中。然而，如何應(yīng)用腫瘤組織中高表達(dá)的Brachyury 對人群進(jìn)行早期的腫瘤篩查診斷卻沒有具體有效的方法和研宄。作為轉(zhuǎn)錄因子，Brachyury 具有強(qiáng)大的啟動或抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的作用，因此，通過檢測其下游被調(diào)控的某些外分泌 蛋白質(zhì)或miRNA的表達(dá)量便可以作為Brachyury表達(dá)水平的指標(biāo)。
[0004] microRNA作為僅有20-24bp的非編碼短鏈核苷酸片段，被證明在外周血中具有 穩(wěn)定的表達(dá)譜，且無性別差異，而腫瘤患者的microRNAs表達(dá)譜則發(fā)生顯著變化（參見 文獻(xiàn) Chen X, Ba Y, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 20080ct ； 18(10):997-1006.)由于microRNAs出細(xì)胞時(shí)被脂質(zhì)微泡（Micro vesicle)保護(hù)，因此 能夠保持穩(wěn)定，易于檢測，在冰凍組織、福爾馬林固定組織、石蠟組織，體液如外周血、痰 液、唾液、胸膜積液中都能夠進(jìn)行檢測，且由于microRNA片段較短，大大降低了檢測成 本，因此，其作為無創(chuàng)性腫瘤早期診斷標(biāo)記物的研究日益增多（參見文獻(xiàn)Du M，Liu S et al.Clinical potential role of circulating microRNAs in early diagnosis of colorectal cancer patients. Carcinogenesis. 2014Sep 19. Jeong HC. Clinical Aspect of MicroRNA in Lung Cancer. Tuberc Respir Dis(Seoul). 2014Aug ；77 (2):60-4.)
[0005] 目前的研宄尚未見以腫瘤特異性靶標(biāo)所關(guān)聯(lián)的microRNAs作為腫瘤（包括肺癌 等）早期診斷的標(biāo)記物，也尚未有用于檢測這一系列microRNAs在血清中含量的試劑盒來 針對部分存在Brachyury過表達(dá)的腫瘤（包括肺癌等）患者進(jìn)行篩查。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于尋找到與Brachyury高表達(dá)相關(guān)的腫瘤的分子標(biāo)記物（腫瘤靶 標(biāo)、革G標(biāo)），本發(fā)明的另一目的在于提供microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性 腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案：為了尋找被Brachyury調(diào)控的microRNAs，本發(fā)明人在肺 癌細(xì)胞H1299和作為正常人體對照細(xì)胞293T中利用慢病毒感染轉(zhuǎn)入外源性Brachyury的 cds序列使之過表達(dá)后再應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出被Brachyury調(diào)控后發(fā)生顯著上調(diào) 的若干microRNAs。并對這一系列microRNAs進(jìn)行了 Real-Time PCR驗(yàn)證。隨后在對臨床 上肺癌患者、慢性阻塞性肺炎患者、肺纖維化病變患者以及正常人群的血漿采集和檢測中 發(fā)現(xiàn)，microRNAs組中hsa-miR-4286、hsa_miR-449c在肺癌患者中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而在其 它肺部實(shí)質(zhì)性病變患者和正常人群中則未見表達(dá)水平異常。
[0008] 在前期的microRNA芯片實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)生顯著上調(diào)的has-miR-22被報(bào)道在 肺癌患者外周血中發(fā)生上調(diào)，可能為肺癌特異性診斷標(biāo)記物（Franchina T, Amodeo V,Circulating miR-22, miR-24and miR_34a as novel predictive biomarkers to pemetrexed-based chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer. J Cell Physiol. 2014Jan ;229 (I) :97-9.)。以上研宄結(jié)果顯示，被 Brachyury 所調(diào)控的 microRNA 能夠作為潛在的肺癌診斷標(biāo)記物，本發(fā)明中的一系列microRNAs經(jīng)過分子水平的實(shí)驗(yàn)與臨 床患者標(biāo)本的驗(yàn)證，在肺癌的診斷中具有很強(qiáng)的特異性，并且以反轉(zhuǎn)錄聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（RT-PCR)作為檢測基礎(chǔ)，通過對高危人群少量外周血的檢測來早期篩查預(yù)測腫瘤的發(fā) 生，是完全可行的。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面，是提供了與Brachyury高表達(dá)相關(guān)的腫瘤的分子標(biāo)記物， 所述的分子標(biāo)記物為hsa-miR-4286或hsa-miR_449c〇
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了 microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤 試劑或試劑盒中的應(yīng)用，所述的microRNAs選自hsa-miR-4286、hsa-miR_449c中的任一或 兩者的組合。
[0011] 本發(fā)明所述的microRNAs的具體序列如表1所示：
[0012]

【權(quán)利要求】
1. hsa-miR-4286或hsa-miR_449c作為Brachyury陽性腫瘤的分子標(biāo)記物的應(yīng)用。 2. microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其 特征在于，所述的microRNAs選自hsa-miR-4286、hsa-miR_449c中的任一或兩者的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑 或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的Brachyury陽性腫瘤是指該腫瘤中Brachyury呈現(xiàn) 出高水平的表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的Brachyury陽性腫瘤是指肺癌、小腸癌、胃癌、腎 癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、腦癌、淋巴癌、結(jié)腸癌，或前列腺癌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4任一所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性 腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑是指檢測所述的microRNAs表達(dá)量 的寡聚核苷酸；所述的試劑盒是指包含檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑 或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸包括反轉(zhuǎn)錄 引物、PCR上游引物，或PCR下游引物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑 或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸序列包含如 下A組、B組，或AB兩組的組合： 八組：反轉(zhuǎn)錄引物如5￡0 10勵(lì):3所示屮〇?上游引物如5￡0 10^):4所示屮〇?下游引 物如SEQ ID NO:5所示； B組：反轉(zhuǎn)錄引物如SEQ ID NO: 6所示；PCR上游引物如SEQ ID NO: 7所示；PCR下游引 物如SEQ ID NO:5所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的microRNAs在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤 試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，本發(fā)明的試劑盒包括以下組分： A. 反轉(zhuǎn)錄引物，1管10uM濃度，100uL; B. PCR上游引物，1管10uM濃度，100uL/管； C. PCR下游引物，1管10uM濃度，100uL/管； D. 正常標(biāo)準(zhǔn)品，1管，10uM濃度，100uL。
9. 檢測hsa-miR-4286或hsa-miR_449c表達(dá)量的寡聚核苷酸序列在制備診斷 Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的寡聚核苷酸序列包含如下 A組、B組，或AB兩組的組合： 八組：反轉(zhuǎn)錄引物如5￡0 10勵(lì):3所示屮〇?上游引物如5￡0 10^):4所示屮〇?下游引 物如SEQ ID NO:5所示； B組：反轉(zhuǎn)錄引物如SEQ ID NO: 6所示；PCR上游引物如SEQ ID NO: 7所示；PCR下游引 物如SEQ ID NO :5所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測hsa-miR-4286或hsa-miR-449c表達(dá)量的寡聚核苷酸 序列在制備診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，利用所述的寡 聚核苷酸檢測hsa-miR-4286或hsa-miR-449c表達(dá)量的方法包括如下步驟： 取樣本中的總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄引物、5XPrimeScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RNase Free dH20反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用EASY Dilution稀釋試劑盒中的正常標(biāo)準(zhǔn)品， 以所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板向反應(yīng)體系中加入PCR上游引物、PCR下游引物，通過反轉(zhuǎn)錄聯(lián) 合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測hsa-miR-4286或hsa-miR_449c的表達(dá)量。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498606SQ201410784315
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】陳素, 矯健, 姜東杰, 周振華, 肖建如 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)