獲得溫敏不育系的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其包括根據(jù)RNase ZS1設(shè)計靶標(biāo)序列的步驟；和構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pU3-gRNA載體的步驟；和構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體的步驟；和獲得轉(zhuǎn)基因苗的步驟；和突變位點的鑒定步驟；以及獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟。本發(fā)明的方法徹底的失活了RNase ZS1蛋白的活性，實現(xiàn)人工培育不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系，同時與利用化學(xué)、物理誘變獲得的突變體沒有本質(zhì)的區(qū)別，具有目的性強，基因組的損傷小，規(guī)避了轉(zhuǎn)基因帶來的可能風(fēng)險。
【專利說明】-種定點突變RNase Zs1獲得溫敏不育系的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻溫敏不育系的突變方法，具體涉及一種定點突變RNase Zsi獲得溫 敏不育系的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是最主要的糧食作物之一，全世界超過一半的人口都以 水稻為主食（Miura et al.，2010)。隨著人口的增長和可耕地面積的減少，糧食的供需變得 越來越不平衡（Gupta et al.，2006)，增加糧食單位面積廣量已成為解決糧食供需不平衡 的關(guān)鍵措施之一。幸運的是，雜交水稻可以比常規(guī)優(yōu)質(zhì)水稻提高20-30%的產(chǎn)量，在解決糧 食短缺的問題上起到了非常重要的作用，因此，雜交水稻的種植面積逐年上升，現(xiàn)已超過水 稻種植面積的 60% (cheng et al.，2007 ;Normile, 2008 ;Su et al.，2012)。
[0003] 根據(jù)所使用的不育系類型的不同，雜交水稻育種的方法主要分為兩系法和三系法 (cheng et al.，2007)。三系法通過使用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和恢復(fù)系產(chǎn)生雜種Fl代種子， 利用保持系和細(xì)胞質(zhì)雄性不育系雜交保留細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（Wang et al.，2006 ;Fujii et al·，2009 ;Itabashi et al·，2011 ;Luo et al·，2013 ;Chen et al·，2014);但是只有少 數(shù)水稻品種可以作為恢復(fù)系，這大大降低了恢復(fù)系與不育系間的遺傳多樣性，限制了雜種 優(yōu)勢的利用（Zhang et al.，1994 ;Zhou et al.，2012 ;Zhang et al.，2013)。而兩系法主 要利用光/溫敏雄性核不育系來實現(xiàn)，因為光/溫敏不育系育性受日長和溫度調(diào)控，在不 育條件下可作為不育系，在可育條件下可作為保持系，一系兩用。而且由于不受核質(zhì)互作影 響，幾乎所有的正常品種都可以作為恢復(fù)系（袁隆平，1994 ;Zhang et al.，1994 ;Ding et al.，2012a)。基于這個本質(zhì)上的差異，兩系法雜交技術(shù)具有更為廣泛的恢復(fù)系，不需要特殊 的恢復(fù)基因，使得配組更加自由，利于亞種間雜種優(yōu)勢的利用，對提高雜交稻組合的產(chǎn)量、 米質(zhì)、抗性等存在更大的潛在優(yōu)勢；不育系可一系兩用，不需要保持系，簡化了生產(chǎn)程序； 溫敏不育受核基因控制，與細(xì)胞質(zhì)無關(guān)，豐富了細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的多樣性，可以避免三系雜 交稻不育細(xì)胞質(zhì)的負(fù)效應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)單一可能帶來的潛在危險（王效寧等，2005 ;Yang et al·，2007;蔡春苗等，2008 ;Zhou et al·，2012 ;Zhang et al·，2013)。因此，溫敏不育系在 雜交水稻育種中潛力巨大，相比而言，目前廣泛應(yīng)用的為溫敏不育系。
[0004] 安農(nóng)S-I溫敏不育水稻是第一個被發(fā)現(xiàn)的秈型溫敏不育系（鄧華鳳等，1999)，溫 敏不育材料往往通過自然突變獲得，自然突變頻率非常低，而用傳統(tǒng)育種手段將自然突變 的溫敏不育材料培育成為溫敏不育系過程漫長，如何提高溫敏不育系的培育效率已成為迫 切需要解決的問題。要突破傳統(tǒng)育種的局限，必須使用基因工程手段。盡管，RNAi和反義 RNA技術(shù)可以實現(xiàn)對基因的抑制表達(dá)，但是并不能徹底刪除基因的功能，基因殘留的功能 會提高轉(zhuǎn)基因植株的不育起點溫度，不利于育種的安全，而且轉(zhuǎn)基因植株中會殘留外源序 列，涉及轉(zhuǎn)基因安全問題。近年來，定點突變技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，比如ZFN(Zinc finger nucleases), TALEN(Transcriptionactivator-like effector nucleases)和 CRISPR/ Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)已廣泛應(yīng)用于各種生物中。這些方法都是通過靶識別序列或引導(dǎo)序列將核 酸酶引導(dǎo)到靶標(biāo)位置，然后核酸酶切割靶標(biāo)DNA，在細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)的作用下將切斷的 DNA修復(fù)鏈接起來，但是在修復(fù)過程中往往會導(dǎo)致堿基丟失。目前，已經(jīng)通過RNAi技術(shù)干 涉RNase ZS1，獲得溫敏不育植株；但是RNAi技術(shù)只是降低了 RNase Zsi的表達(dá)量，并不能徹 底的使其失活，使轉(zhuǎn)基因植株有較高的不育起點溫度，且不育起點溫度不穩(wěn)定，影響制種安 全。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種定點突變RNase Zsi獲得溫 敏不育系的方法，徹底的失活了 RNase Zsi蛋白的活性，實現(xiàn)人工培育不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫 敏不育系，同時與利用化學(xué)、物理誘變獲得的突變體沒有本質(zhì)的區(qū)別，具有目的性強，基因 組的損傷小，規(guī)避了轉(zhuǎn)基因帶來的可能風(fēng)險。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種定點突變RNase Zsi獲得溫敏不育系的方法，其包括
[0008] 利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)根據(jù) RNase Zsi (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)設(shè)計靶 標(biāo)序列的步驟；和
[0009] 構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pU3_gRNA載體的步驟；和
[0010] 構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體的步驟；和
[0011] 獲得轉(zhuǎn)基因苗的步驟；和
[0012] 突變位點的鑒定步驟；以及
[0013] 獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟。
[0014] 本發(fā)明所述靶標(biāo)雙鏈片段中的一條鏈具有以下結(jié)構(gòu)：5' -NX-NGG_3'，也可以是 5' -Nx-NAG-3'或5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一個，14彡X彡30。較佳的靶 位點序列以A或G開頭。本發(fā)明根據(jù)靶標(biāo)的設(shè)計原則在RNase Zsi的編碼區(qū)可以找到148 個 5' -Nx-NGG-3'，121 個 5' -Nx-NAG-3'，133 個 5' -Nx-NGA-3' 序列作為靶標(biāo)。
[0015] 上述方案中，構(gòu)建含祀標(biāo)序列片段的pU3_gRNA載體具體步驟為：首先合成帶粘性 末端的靶標(biāo)引物，將接頭引物變性后移至室溫冷卻完成退火；將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶 切后的pU3-gRNA載體上，經(jīng)PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒。
[0016] 上述方案中，構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體是將含靶標(biāo)序列片段的 gRNA表達(dá)盒從pU3-gRNA上切下，然后鏈接到含Cas9表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上。
[0017] 上述方案中，獲得轉(zhuǎn)基因苗的步驟是將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈 傷組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室；通過潮霉素鑒定陽性轉(zhuǎn)基因 植株。本發(fā)明中將含靶標(biāo)的PCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法是通過農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化或基因槍法。也可以是能實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的其他生物學(xué)方法。
[0018] 上述方案中，突變位點的鑒定步驟具體為：提取陽性植株的DNA，設(shè)計引物擴增上 述DNA，經(jīng)純化后，測序，分析突變情況。
[0019] 上述方案中，獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟具體為：收獲Ttl代實現(xiàn)定 點突變的植株的種子，在長日/高溫條件下種植T 1代植株，通過表型觀察和潮霉素陽性檢 測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分但表型不育的植株種植于短日/低溫條件下，育性恢復(fù)可育的植 株作為溫敏不育株，經(jīng)自交或回交等方法繁殖后獲得溫敏不育系。
[0020] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 1.本發(fā)明所述的定點突變RNase Zsi獲得溫敏不育系的方法，利用上述技術(shù)定點 突變已克隆到的溫敏不育基因，實現(xiàn)了人工培育溫敏不育系，并且這種溫敏不育系是可以 不帶轉(zhuǎn)基因成分的，與利用化學(xué)、物理誘變獲得的突變體沒有本質(zhì)的區(qū)別，只是目的性強， 基因組的損傷小，規(guī)避了轉(zhuǎn)基因帶來的可能風(fēng)險；
[0022] 2.本發(fā)明所述的定點突變RNase Zsi獲得溫敏不育系的方法加快了育種的進(jìn)程， 節(jié)省了時間、成本；
[0023] 3.傳統(tǒng)育種無論回交多少代都會或多或少的改變遺傳背景，可能導(dǎo)致一些優(yōu)良性 狀丟失。本發(fā)明所述的定點突變RNase Zsi獲得溫敏不育系的方法不改變受體材料的遺傳背 景，并可以通過將三系的保持系定點突變?yōu)闇孛舨挥?，達(dá)到三系雜交稻改為兩系雜交稻， 拓寬恢復(fù)系的篩選范圍，提高雜種優(yōu)勢利用效率，進(jìn)而提高產(chǎn)量和稻米品質(zhì)；
[0024] 4.本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，安農(nóng)S-I的育性主要受溫度控制，不育起點溫度在26°C 左右，發(fā)明人通過圖位克隆和功能互補已經(jīng)確定tms5編碼RNase Zsi蛋白，溫敏不育系中 RNase Zsi編碼區(qū)第71位堿基由C突變成A，形成提前終止密碼；本發(fā)明通過測序35個主 流實用型溫敏不育系，發(fā)現(xiàn)33個溫敏不育系的tms5序列與安農(nóng)S-I -致，而另外2個溫敏 不育系的 p/tmsl2_l 序列（參見 Hai Zhou et al·，Photoperiod and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA. Cell Research，22(4) :649_660,2012)與培矮64S-致； 說明通過自然突變或傳統(tǒng)的人工誘變tms5(RNaSe ZS1)失活的新突變是非常困難的；誘變 新的可用于兩系雜交育種的溫敏不育系也是非常困難的。因此，本方法改變了這一現(xiàn)狀。
[0025] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1所獲得的tms5-l-6的T1代植株潮霉素陽性檢測結(jié)果圖， 其中1-12分別為tms5-l-6的T 1代植株中的12株；
[0027] 圖2為實施例1中tms5-l-6-ll是tms5-l-6的T1代植株中第11株在不同溫度條 件下生長時的花粉育性結(jié)果圖，其中，HT表示高溫，LT表示低溫，WT表示轉(zhuǎn)基因前的植株；
[0028] 圖3為本發(fā)明實施例2獲得的tms5-2不同溫度條件下的花粉育性，其中ZHll表 示野生型水稻中花11，HT表示高溫，LT表示低溫；
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例3獲得的tms5-3不同溫度條件下的花粉育性，其中ZHll表 示野生型水稻中花11，HT表示高溫，LT表示低溫；
[0030] 圖5為本發(fā)明應(yīng)用實施例中轉(zhuǎn)化秈稻品種獲得的tms5-l不同溫度條件下的花粉 育性，其中ZS97B表示野生型水稻秈稻三系保持系-珍汕97B，HT表示高溫，LT表示低溫。

【具體實施方式】
[0031] 實施例1
[0032] 在粳稻品種中花11中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變RNase Zsi (0s02g0214300) 獲得溫敏不育系，具體步驟如下：
[0033] 1)靶標(biāo)序列設(shè)計：
[0034] Target-tms5-l(SEQ ID NO. I) :TGGAGGGCATCTCCATCGGCGG (位于 0s02g0214300 編 碼區(qū)的107-128).
[0035] 2)含 Target-tms5-l 片段的 pU3-gRNA 載體構(gòu)建：
[0036] 首先合成帶粘性末端的靶標(biāo)引物tms5-l F(SEQ ID NO. 2): GCCGTGGAGGGCATCTCCATCGG，tms5-l R(SEQ ID N03) :AAACCCGATGGAGATGCCCTCCA;將接頭引 物變性后移至室溫冷卻完成退火，將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA載體上；經(jīng) PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒；
[0037] 3)含 Target-tms5_l 片段的 pCRISPR/Cas9 載體構(gòu)建：
[0038] 將含Target-tms5_l片段的gRNA表達(dá)盒從pU3_gRNA上切下，然后鏈接到含Cas9 表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上；
[0039] 4)轉(zhuǎn)基因苗的獲得：
[0040] 將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織； 經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室，通過潮霉素鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株；
[0041] 5)突變位點的鑒定：
[0042] 提取陽性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC擴增上述DNA，產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測序， 測序結(jié)果與轉(zhuǎn)基因前的野生型植株序列比較，具體參見SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 12;分析 突變情況；測序結(jié)果顯示：突變植株占總陽性轉(zhuǎn)基因植株的70%，突變類型為堿基插入或 刪除，突變位置始于NGG上游第3到4個堿基之間；
[0043] WT(SEQ ID NO. 6) ：CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGCGGGCAGGAGACCTGCGTCA TCTTCCC
[0044] tms5-l-l(SEQ ID NO. 7) ：CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGACGGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0045] tms5-l-2(SEQ ID NO. 8) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA**GGCGGGCAGGAGACCT GCGTCATCTTCCC
[0046] tms5-l-3(SEQ ID NO. 9) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA***GCGGGCAGGAGACCT GCGTCATCTTCCC
[0047] tms5-l-4(SEQ ID NO. 10) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCC******GGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0048] tms5-l-5(SEQ ID NO. 11) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCT***********CAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0049] tms5-l_6(SEQ ID NO. I2) :CGAGGGCTACCCCGT****************GGCGGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0050] 其中，tms5-l-l，-2, -3, -4, -5和-6表示不同的轉(zhuǎn)基因株系；WT表示野生型；序 列中"Δ"表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入說明定點突變成功；
[0051] 6)不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的獲得：
[0052] 收獲Ttl代實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在長日/高溫條件下種植T1代植株，通過 表型觀察和潮霉素陽性檢測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分（圖1)但表型不育的植株種植于短日/ 低溫條件下，結(jié)果參見圖2,育性恢復(fù)可育的植株作為溫敏不育株，經(jīng)繁殖后獲得溫敏不育 系。
[0053] 圖1結(jié)果表明，T1代植株中4、10和11是不帶轉(zhuǎn)基因成分的；圖2結(jié)果表明10號 植株在高溫下表現(xiàn)為花粉敗育，而低溫下表現(xiàn)為育性恢復(fù)。
[0054] 實施例2
[0055] 在粳稻品種中花11中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變RNase Zsi (0s02g0214300) 獲得溫敏不育系，具體步驟如下：
[0056] 1)靶標(biāo)序列設(shè)計：
[0057] Target-tms5-2(SEQ ID NO. 13) :GCAGCTGAAGCTGTCAGGTGTGG (位于 0s02g0214300 編碼區(qū)的552-574);
[0058] 2)含 Target-tms5_2 片段的 pU6_gRNA 載體構(gòu)建：
[0059] 首先合成帶粘性末端（下劃線部分）的祀標(biāo)引物tms5-2 F(SEQ ID NO. 14): GCCGCAGCTGAAGCTGTCAGGTG，tms5-2 R(SEQ ID N0.15) :AAACCACCTGACAGCTTCAGCTG;將接頭 引物變性后移至室溫冷卻完成退火，將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶切后的pU6-gRNA載體上， 經(jīng)PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒；
[0060] 3)含 Target-tms5_2 片段的 pCRISPR/Cas9 載體構(gòu)建：
[0061] 將含Target-tms5-2片段的gRNA表達(dá)盒從pU6-gRNA上切下，然后鏈接到含Cas9 表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上；
[0062] 4)轉(zhuǎn)基因苗的獲得：
[0063] 將含祀標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種 中花11愈傷組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室；通過潮霉素鑒定陽 性轉(zhuǎn)基因植株；
[0064] 5)突變位點的鑒定：
[0065] 提取陽性植株的 DNA，用引物 tms5-5F(SEQ ID NO. 16) :CAGGAGTTCCTCTTCATCTC 和 tms5-5R(SEQ ID NO. 17) :AGGCACCGTCAATGTATTCG 擴增上述 DNA，經(jīng)純化后送公司測序，分 析突變情況，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)基因前的野生型水稻中花比較，具體參見SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 22 ;顯示：突變植株占總陽性轉(zhuǎn)基因植株的60%，突變類型為堿基插入或刪除，突變位 置始于PAM序列TGG上游第3到4個堿基之間；
[0066] ZHll(SEQ ID NO. 18) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCAGGTGTGGAGGTCTGT TGTTGTTGTTTTT
[0067] tms5-2-l(SEQ ID NO. 19) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCAGCGTGTGGAGG TCTGTTGTTGTTGTTTTT
[0068] tms5-2-2(SEQ ID NO. 20) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCA*GTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT
[0069] tms5-2-3(SEQ ID NO. 21) :TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTC**GTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT
[0070] tms5-2-4(SEQ ID NO. 22) :TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCT****GGTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT ；
[0071] 6)不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的獲得：
[0072] 收獲Ttl代實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在長日/高溫條件下種植T1代植株，通過 表型觀察和潮霉素陽性檢測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分但表型不育的植株種植于短日/低溫 條件下，結(jié)果參見圖3,育性恢復(fù)可育的植株作為溫敏不育株，經(jīng)繁殖后獲得溫敏不育系。
[0073] tms5-2-l，-2, -3和-4表示不同的轉(zhuǎn)基因株系；ZHll表示野生型水稻中花11 ;序 列中"S"喊基表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入說明定點突變成功。 圖3的結(jié)果表明tms5-2突變植株在高溫下表現(xiàn)為花粉敗育，而低溫下表現(xiàn)為育性恢復(fù)。
[0074] 實施例3
[0075] 在粳稻品種中花11中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變RNase Zsi (0s02g0214300) 獲得溫敏不育系，具體步驟如下：
[0076] 1)靶標(biāo)序列設(shè)計：
[0077] Target-tms5-3(SEQ ID NO. 23) :AACCTCGTCCCCCTCGAGATTGG (位于 0s02g0214300 編碼區(qū)的388-410);
[0078] 2)含 Target-tms5_3 片段的 pU3_gRNA 載體構(gòu)建：
[0079] 首先合成帶粘性末端（下劃線部分）的靶標(biāo)引物tms5-3 F(SEQ ID N0.24): GGCAACCTCGTCCCCCTCGAGAT，tms5-3R(SEQ ID N0.25) :AAACATCTCGAGGGGGACGAGGT;將接頭 引物變性后移至室溫冷卻完成退火，將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA載體上， 經(jīng)PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒；
[0080] 3)含 Target-tms5_3 片段的 pCRISPR/Cas9 載體構(gòu)建：
[0081] 將含Target-tms5-3片段的gRNA表達(dá)盒從pU3-gRNA上切下，然后鏈接到含Cas9 表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上；
[0082] 4)轉(zhuǎn)基因苗的獲得：
[0083] 將含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種 中花11愈傷組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室，通過潮霉素鑒定陽 性轉(zhuǎn)基因植株；
[0084] 5)突變位點的鑒定：
[0085] 提取陽性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC擴增上述DNA，經(jīng)純化后送公司測序，分析 突變情況，測序結(jié)果及野生型水稻中花的序列參見SEQ ID NO. 26-SEQ ID NO. 31 :突變植株 占總陽性轉(zhuǎn)基因植株的70%，突變類型為堿基插入或刪除，突變位置始于NGG上游第3到4 個堿基之間；
[0086] ZHll(SEQ ID NO. 26) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGAGATTGGTCAGGAGCA CGAGCTCAGG
[0087] tms5-3-l(SEQ ID NO. 27) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGAAGATTGGTCAG GAGCACGAGCTCAGG
[0088] tms5-3-2(SEQ ID NO. 28) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGATGATTGGTCAG GAGCACGAGCTCAGG
[0089] tms5-3-3(SEQ ID NO. 29) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGA*ATTGGTCAGG AGCACGAGCTCAGG
[0090] tms5-3-4(SEQ ID NO. 30) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTC****************GTCAGG AGCACGAGCTCAGG
[0091] tms5-3-5(SEQ ID NO. 31) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTC*********************G AGCACGAGCTCAGG
[0092] 其中，tms5-3-l，-2, -3, -4和-5表不不同的轉(zhuǎn)基因株系；序列中方喊基"A"和"工" 表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入說明定點突變成功；
[0093] 6)不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的獲得：
[0094] 收獲TO代實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在長日/高溫條件下種植Tl代植株，通過 表型觀察和潮霉素陽性檢測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分但表型不育的植株種植于短日/低溫 條件下，結(jié)果參見圖4,育性恢復(fù)可育的植株作為溫敏不育株，經(jīng)繁殖后獲得溫敏不育系。
[0095] 圖4結(jié)果表明：tms5-3突變植株在高溫下表現(xiàn)為花粉敗育，而低溫下表現(xiàn)為育性 恢復(fù)，說明其為溫敏不育株。
[0096] 應(yīng)用實施例4
[0097] 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變秈稻品種珍汕97B中RNase Zsl(0s02g0214300) 獲得溫敏不育系。
[0098] 1)秈稻轉(zhuǎn)基因苗的獲得：
[0099] 將實施案列1中構(gòu)建好的含靶標(biāo)的pCRISPR/Cas9載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn) 化法轉(zhuǎn)化水稻秈稻品種珍汕97B組織，經(jīng)篩選，分化和生根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng) 室，通過潮霉素鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株；
[0100] 2)突變位點的鑒定：
[0101] 提取陽性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC擴增上述DNA，經(jīng)純化后測序，分析突變情 況，珍汕97B (ZS97B)序列及測序結(jié)果參見，突變植株占總陽性轉(zhuǎn)基因植株的65%，突變類 型為堿基插入或刪除，突變位置始于NGG上游第3到4個堿基之間；
[0102] ZS97B(SEQ ID NO. 32) ：CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGCGGGCAGGAGAC CTGCGTCATCT
[0103] tms5-l-7(SEQ ID NO. 33) ：CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATTCGGCGGGCAGG AGACCTGCGTCATCT
[0104] tms5-l-8(SEQ ID NO. 34) :CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA**GGCGGGCAGGA GACCTGCGTCATCT
[0105] tms5-l-9(SEQ ID NO. 35) :CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTC****GGCGGGCAGGA GACCTGCGTCATCT
[0106] tms5-l-10(SEQ ID NO. 36):CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCA*********GCGGGCAGG AGACCTGCGTCATCT ；
[0107] 其中，tms5-l_7, -8，-9，-I表不不同的轉(zhuǎn)基因株系；序列中方堿基"I"表不插入 的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入說明定點突變成功；
[0108] 3)不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的獲得：
[0109] 收獲Ttl代實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在長日/高溫條件下種植T1代植株，通過 表型觀察和潮霉素陽性檢測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分但表型不育的植株種植于短日/低溫 條件下，結(jié)果參見圖5,育性恢復(fù)可育的植株作為溫敏不育株，經(jīng)繁殖后獲得溫敏不育系。
[0110] 圖5結(jié)果表明：珍汕97B背景下的tms5-l突變植株在高溫下表現(xiàn)為花粉敗育，而 低溫下表現(xiàn)為育性恢復(fù)，說明其為溫敏不育株，同時證明三系改兩系的可行性。
[0111] 上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于：其包括 利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)根據(jù) RNase ZS1 (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)設(shè)計靶標(biāo)序 列的步驟；和 構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pU3-gRNA載體的步驟；和 構(gòu)建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體的步驟；和 獲得轉(zhuǎn)基因苗的步驟；和 突變位點的鑒定步驟；以及 獲得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，所 述RNase ZS1雙鏈片段中的一條鏈具有以下結(jié)構(gòu)：5'-Nx-NGG-3'，也可以是5'-Nx-NAG-3'或 5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一個，14彡X彡30。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，突 變后的特征表現(xiàn)為NGG或NAG或NGA上游第3個堿基與第4個堿基之間插入堿基或在其5' 和/或3'丟失喊基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，構(gòu) 建含靶標(biāo)序列片段的pU3-gRNA載體具體步驟為：首先合成帶粘性末端的靶標(biāo)引物，將接頭 引物變性后移至室溫冷卻完成退火；將退火后的引物鏈接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA載體上， 經(jīng)PCR擴增和測序驗證陽性質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，構(gòu) 建含靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9載體是將含靶位點序列片段的gRNA表達(dá)盒從pU3-gRNA 上切下，然后鏈接到含Cas9表達(dá)盒的pCRISPR/Cas9載體上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，獲 得轉(zhuǎn)基因苗的步驟是將含靶標(biāo)的PCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)篩選，分化和生 根成苗，將轉(zhuǎn)基因植株種植于網(wǎng)室；通過潮霉素鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，將 含靶標(biāo)的PCRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化或基 因槍法。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于， 突變位點的鑒定步驟具體為：提取陽性植株的DNA，并設(shè)計引物擴增上述DNA，經(jīng)純化后，測 序，分析突變情況。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點突變RNase ZS1獲得溫敏不育系的方法，其特征在于，獲 得不帶轉(zhuǎn)基因成分的溫敏不育系的步驟具體為：收獲L代實現(xiàn)定點突變的植株的種子，在 長日/高溫條件下種植?\代植株，通過表型觀察和潮霉素陽性檢測分離到不帶轉(zhuǎn)基因成分 但表型不育的植株種植于短日/低溫條件下，育性恢復(fù)可育的植株作為溫敏不育株，經(jīng)繁 殖后獲得溫敏不育系。
【文檔編號】C12N15/82GK104293827SQ201410496037
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】周海, 莊楚雄, 陳亮, 李靜, 姜大剛 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)