一種與β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適配子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適配子及其應(yīng)用。所述的核酸適配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的任意一種。核酸適配子或其化學(xué)修飾物作為BACE1抑制劑在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。本研究通過SELEX技術(shù)成功篩選得到能以高親和力結(jié)合BACE1的DNA適配子A1和A4，并證明該適配子具有抑制BACE1體外活性的作用。為新的強(qiáng)效特異的BACE1抑制劑的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，為AD治療提供了新的方法和思路。
【專利說明】一種與β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適 配子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與β -淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性 結(jié)合的核酸適配子及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer' s disease, AD)是一種漸進(jìn)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng) 退行性疾病，以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，其他癥狀還包括執(zhí)行功能障礙、精神障 礙等。晚期病人生活不能自理，常死于肺部感染等并發(fā)癥；給患者家庭及社會(huì)帶來巨大 的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) [1]。據(jù)預(yù)測，全世界AD患者的發(fā)病人數(shù)將由2010年的三千六百萬在2050 年增至三倍[2]。AD的發(fā)病原因尚不清楚。目前認(rèn)為多種致病因子，諸如淀粉樣前體 蛋白 / 淀粉樣蛋白（amyloid precursor protein/amyloidi3，APP/Ai3)[3]、載脂蛋白 E4(ApolipoproteinE4，apoE4)[4'5]、tau[6' 7]、α 突觸核蛋白（<1-8}〇111(316；[11)[8'9]、1?敵結(jié)合蛋 白（TDP-43) [8'1Q]及組蛋白去乙?；?2(Histone deacetylase 2，HDAC2)[11]等相互作用， 參與AD的發(fā)??；其他如老齡[12]、氧化應(yīng)激 [13]、炎癥[14]、線粒體功能損害[15]等也可能與AD 發(fā)病有關(guān)。對于AD目前尚無有效的根治方法，臨床常用的治療AD的藥物乙酰膽堿酯酶抑 制劑和NMDA受體拮抗劑只能暫時(shí)緩解癥狀。
[0003] AD的兩大病理標(biāo)志是神經(jīng)元胞內(nèi)的磷酸化tau形成的神經(jīng)纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangles)及胞外的Αβ組成的淀粉樣蛋白斑（amyloid plaques)。因此 Αβ -直被認(rèn)為是AD重要的致病因素。近年來許多研究重新肯定了 Αβ在AD發(fā)病中的重要 性[16_22]。在八0產(chǎn)生過程中，β-分泌酶先水解APP生成可溶性APP氨基端產(chǎn)物β (soluble amyloid precursor protein beta, sAPPP)和羧基端產(chǎn)物C99。繼而γ -分泌酶在不同位 點(diǎn)剪切C99,產(chǎn)生多種不同氨基酸長度的A β肽。此外在氨基肽酶、谷氨酰胺酰環(huán)化酶、異構(gòu) 酶等介導(dǎo)的酶作用過程及Αβ肽鏈細(xì)胞外磷酸化反應(yīng)的作用下，產(chǎn)生由各種Αβ肽鏈組成 的混合物?？梢哉fΑβ是一群有不同長度、溶解度、穩(wěn)定性、生物學(xué)及毒性特性的肽類混合 物的總稱。Αβ的生成增多、降解減少或清除減少可導(dǎo)致各種Αβ單體和它們組成的低聚 物、纖維狀物在腦內(nèi)聚集、沉積，引起不同程度的神經(jīng)毒性。其中可溶性Αβ低聚物的致病 性較Αβ單體和Αβ纖維強(qiáng) [3，16，19]。Αβ低聚物可能通過影響抑制性中間神經(jīng)元和谷氨酸 轉(zhuǎn)運(yùn)體來損害突觸功能和相關(guān)的信號通路，改變神經(jīng)元活性，誘發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性 介質(zhì)。因此抑制過多的Αβ產(chǎn)生或其活性是AD治療的根本策略。
[0004] β -淀粉樣前體蛋白裂解酶 I (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1)，也稱β-分泌酶l(P_secretase 1)，是最主要的β-分泌酶，是Αβ產(chǎn) 生過程中的限速酶。因此抑制BACEl的表達(dá)或活性將減少A β產(chǎn)生。BACEl包含501個(gè)氨 基酸，屬跨膜的1型天冬氨酸蛋白酶。其在神經(jīng)元中的表達(dá)水平最高。BACEl與AD的關(guān)系 密切。在AD腦內(nèi)，淀粉樣斑塊圍繞的神經(jīng)元內(nèi)BACEl水平升高。2012年，研究者發(fā)現(xiàn)APP 基因上臨近BACEl蛋白水解位點(diǎn)的一個(gè)突變（Α673Τ)在非AD人群與AD病人中的出現(xiàn)頻率 有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該突變可減少BACEl對APP的剪切，從而減少A β產(chǎn)生；這個(gè)發(fā)現(xiàn)為 抑制BACEl可對抗AD的論點(diǎn)提供了有力的證據(jù)[28]。除了 APP，BACEl可作用于其它底物及 調(diào)節(jié)因子。BACEl基因完全敲除的小鼠顯示了因影響神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白I (type III neuregulin 1，NRGl)信號而出現(xiàn)的外周神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成不足和精神分裂樣行為，以及與電壓門控鈉 通道 β 亞單位（β-subunits of voltage-gated sodium channels，NavPs)相關(guān)的痛癇 樣表現(xiàn)[31]。但是目前還不清楚這些改變是否完全由BACEl抑制所引起的。有報(bào)道通過一 種BACEl抑制劑治療可增強(qiáng)APP轉(zhuǎn)基因小鼠的α-分泌酶水解過程，減少腦內(nèi)Αβ含量而 不影響NRGl通路。α -分泌酶水解APP增強(qiáng)時(shí)，能夠使其水解產(chǎn)物可溶性APP氨基端產(chǎn)物 a (soluble amyloid precursor protein alpha, sAPPa)產(chǎn)生增加；而 sAPPa 具神經(jīng)保 護(hù)作用。當(dāng)BACEl完全抑制或敲除時(shí)，其他蛋白酶可代償對BACEl底物的水解過程。NRGl 和Navi3 s信號通路也可能受其它一些未知的酶作用物所影響。近來一些研究提示部分抑 制BACEl已足夠減少Αβ含量、改善AD模型動(dòng)物的認(rèn)知功能而不產(chǎn)生明顯的毒害效應(yīng)，提 示部分抑制BACEl活性將是一種有效的替代途徑。目前，尚沒有安全有效的BACEl抑制劑 應(yīng)用于臨床。
[0005] 長期以來，人們認(rèn)為核酸的主要功能僅僅是攜帶遺傳信息，但隨后人們逐漸認(rèn)識 到單鏈核酸分子具有執(zhí)行各種各樣的細(xì)胞功能的能力。單鏈RNA分子能夠形成迥然不同 的三維結(jié)構(gòu)，使它們可以特異識別各種分子靶標(biāo)，甚至是執(zhí)行類似于蛋白分子的催化作用。 例如，tRNA和rRNA分子是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵物質(zhì)。關(guān)于轉(zhuǎn)錄、剪接及翻譯機(jī)制的研究分析 顯示蛋白質(zhì)和某些RNA位點(diǎn)的特異相互作用對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)非常重要。核酸的巨大的 組合多樣化及能夠形成多種多樣的二級和三級結(jié)構(gòu)的能力使直接篩選出具特定性能的核 酸序列成為可能。由此出現(xiàn)了在體外富集這些核酸分子的方法：指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)[38'39]。而 這些篩選出來的能以高度親和力（解離常數(shù)值在納摩爾級至皮摩爾級之間）與靶分子特異 結(jié)合的寡核苷酸分子（單鏈DNA或RNA)，被稱為適配子 [38]。
[0006] SELEX技術(shù)通過數(shù)輪或數(shù)十輪重復(fù)篩選，得到特異結(jié)合靶分子的寡核苷酸序列。 每一輪篩選包括三個(gè)主要步驟：（1)體外構(gòu)建的庫容量約為IO 13-IO15的隨機(jī)寡核苷酸文庫 與靶分子孵育；（2)寡核苷酸-靶標(biāo)復(fù)合物與未結(jié)合的寡核苷酸分離；（3)結(jié)合的寡核苷 酸序列經(jīng)PCR擴(kuò)增。隨著篩選輪數(shù)的增加，可逐漸富集到與靶分子的結(jié)合親和力逐步增加 的序列?，F(xiàn)在已證實(shí)運(yùn)用SELEX技術(shù)可以對非常廣泛的靶物質(zhì)進(jìn)行篩選得到相應(yīng)的適配 子；這些靶物質(zhì)包括蛋白、多肽、核酸、多糖類、小分子有機(jī)物、病毒顆粒、細(xì)菌、活細(xì)胞及組 織 [4°]。SELEX技術(shù)也經(jīng)過許多改進(jìn)，出現(xiàn)了諸如消減SELEX[41' 42]、利用親和層析和磁珠的 SELEX[43'44]、毛細(xì)管電泳 SELEX[45'46]、全細(xì)胞 SELEX[42'47]、微流體 SELEX[48'49]等方法。這些新 方法或能增加篩選效率，或能減低對靶標(biāo)的要求，或能改進(jìn)獲得的適配子的功能。
[0007] 純化蛋白質(zhì)是最常用的SELEX篩選的靶標(biāo)。以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)篩選出的適配子，可 用于核酸-蛋白質(zhì)作用機(jī)制的研究 [51];可高效特異地抑制靶蛋白[52]或用于尋找針對其他 蛋白質(zhì)的新抑制劑[53];用來檢測不同的靶分子 [54]。相比于抗體，適配子有如下優(yōu)勢：分子 量?。粚岱€(wěn)定，經(jīng)歷變性/復(fù)性后能恢復(fù)天然構(gòu)象及結(jié)合靶標(biāo)[55];易于生產(chǎn)；易于通過各 種化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行修飾以提高其穩(wěn)定性和對核酸酶的抵抗；易于結(jié)合熒光素等信號基團(tuán)以增 強(qiáng)適配子的功能；免疫原性低；靶物質(zhì)廣泛，對于一些抗體不能識別的物質(zhì)如離子、小分子 等也具特異親和力[56]。因此適配子可以在許多生物學(xué)應(yīng)用中代替抗體。目前適配子已廣 泛地用于新藥研發(fā)、疾病診斷及治療、藥物的體內(nèi)運(yùn)輸、生物成像、試劑分析、食品檢測等方 面的研究[57]。作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的抗體類藥物大多面臨藥物敏感性不高、體內(nèi)毒性 及不能有效穿透血腦屏障的問題；由于其獨(dú)特的特性，適配子有望代替抗體作為藥物運(yùn)輸 載體、分子探針或抑制劑等在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診治中發(fā)揮作用。一些針對朊病毒蛋白 的致病亞型（proteinase K-resistant isoform, PrPSc)的適配子已經(jīng)被篩選出來，這些適 配子可以用于區(qū)別朊病毒的不同亞型，幫助診斷朊病毒?。≒rion diseases)[58'59]。膠質(zhì)瘤 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的實(shí)體瘤，研究者們分別利用不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株篩選出識別腫瘤 細(xì)胞表面肌糖蛋白（tenascin-C) [6°]或表皮生長因子受體III型突變體[61]的適配子，在膠質(zhì) 瘤的靶向運(yùn)輸、分子成像方面展示了初步的應(yīng)用。Cerchia等篩選出一組適配子可以從非致 瘤的T98G細(xì)胞中識別膠質(zhì)瘤的致瘤株，其中5個(gè)適配子可干擾細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶磷 酸化，抑制惡性型瘤細(xì)胞增殖 [62]。此外還有針對AD的Αβ 4(|的適配子、針對帕金森病的酪 氨酸激酶受體Ret的適配子[64]，也有報(bào)道。雖然這些研究尚處于初步階段，但顯示了適配 子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診治中的潛能。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種與β -淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核 酸適配子或其化學(xué)修飾物。
[0009] 本發(fā)明的與β -淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適配子或其化學(xué)修飾 物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的任意一種。
[0010] 所述的化學(xué)修飾物是在上述核酸適配子中包括的至少一個(gè)核苷酸的核糖2'位上 的羥基被氫原子、氟原子、-0-?；桶被腥我庖环N所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、 FITC、biotin的任意修飾。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述與β -淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核 酸適配子或其化學(xué)修飾物作為BACEl抑制劑在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本研究利用SELEX技術(shù)，以純化的人BACEl蛋白胞外段作為靶分子，從體外合成的 含30個(gè)核苷酸（nucleotides, nt)隨機(jī)片段的ssDNA文庫中篩選出以高親和力特異結(jié)合 BACEl的適配子。利用基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)的間接ELISA法和pull-down實(shí)驗(yàn)來測定 適配子對BACEl的結(jié)合親和力及特異性。利用突光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer, FRET)實(shí)驗(yàn)以檢測適配子對BACEl體外活性的抑制作用。將適配子作用 于M17-APPsw細(xì)胞（一種AD細(xì)胞模型），進(jìn)行雙抗夾心ELISA和western blot實(shí)驗(yàn)，檢測 適配子對AD細(xì)胞模型中BACEl活性的抑制效應(yīng)。
[0013] 首先，體外構(gòu)建合成兩端為固定序列、中間為30nt的隨機(jī)序列、全長為73nt的 ssDNA文庫（Gp30)。以純化的人BACEl蛋白胞外段為靶標(biāo)，在微孔板上進(jìn)行篩選。每一輪 篩選過程主要包括ssDNA文庫與BACEl孵育結(jié)合、洗滌分離未結(jié)合的寡核苷酸序列、不對稱 PCR擴(kuò)增結(jié)合的寡核苷酸序列、切膠回收目的ssDNA得到次級文庫、再將次文庫與BACEl結(jié) 合進(jìn)行下一輪篩選等重復(fù)步驟。從第四輪篩選開始，亞文庫先與空白孔孵育進(jìn)行反篩，以去 除非特異結(jié)合的序列。共進(jìn)行了七輪SELEX篩選。
[0014] 將第七輪得到的ssDNA進(jìn)行克隆、測序。用Primer 5.0軟件分析測序結(jié)果，選擇 兩端的固定序列與原庫相同、中間含有30nt隨機(jī)片段的序列為目的序列，通過MEME在線軟 件對所得序列進(jìn)行同源性分析，用RNA STRUCTURE 5. 5軟件測算二級結(jié)構(gòu)。共挑選出四個(gè) 重復(fù)序列，命名為適配子八142、4344。其中序列41的出現(xiàn)頻率最高。序列同源性分析未 發(fā)現(xiàn)四個(gè)序列均共有的模序。二級結(jié)構(gòu)分析顯示四個(gè)序列均以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。
[0015] 為驗(yàn)證適配子的靶蛋白及對靶蛋白的親和力，利用經(jīng)典的ELISA法及生物素-鏈 親和素系統(tǒng)進(jìn)行間接ELISA。將生物素標(biāo)記的適配子呈兩倍濃度梯度稀釋，與BACEl孵育 后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素孵育，TMB顯色，測定450nm的吸光度值。將所測得 的吸光度值與適配子的濃度通過Sigmaplot 12. 0軟件進(jìn)行非線性回歸分析得出解離常數(shù) (Kd)值。用anti-BACEl抗體與BACEl孵育作為對照比較結(jié)合親和力；用無關(guān)適配子（U31) 與BACEl孵育作為對照比較結(jié)合特異性。結(jié)果顯示適配子Al (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示）及A4(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示）的結(jié)合曲線擬合效果好，類似于BACEl抗 體的擬合曲線（R值均達(dá)到〇. 99, P〈0. 01)。而U31的結(jié)合曲線則不能擬合（P>0. 05)。適配 子 A1、A4 對 BACEl 的結(jié)合親和力分別為 68. 5655±8· 1237ηΜ、15· 3497±2· 0262nM，與 BACEl 抗體對BACEl的親和力（2· 7498±0· 2785nM)幾乎相近。說明Al及A4能以高親和力特異 結(jié)合BACEl。
[0016] 利用鏈親和素磁珠 -pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證適配子是否能結(jié)合AD細(xì)胞模型 (M17-APPSW細(xì)胞）中的BACE1。選擇重復(fù)頻率最高的生物素標(biāo)記的Al與鏈親和素磁珠孵 育，再與M17-APPsw細(xì)胞蛋白提取液孵育。與適配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-適 配子復(fù)合物上，經(jīng)洗滌后復(fù)合物通過SDS-PAGE膠分離，在PVDF膜上用BACEl抗體顯影。生 物素標(biāo)記的原文庫Gp30、U31及不加適配子組作為對照。結(jié)果顯示，Al組有明顯的70KDa 的BACEl蛋白條帶；Gp30組中70KDa處的條帶極細(xì)；U31及不加適配子組均未在70KDa處顯 現(xiàn)條帶。說明Al能特異結(jié)合M17-APPSW細(xì)胞中的BACEl蛋白。
[0017] 下一步進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測Al是否能抑制BACEl的體外活性。BACEl 底物兩端分別連接一個(gè)熒光供體和猝滅受體，隨著供體能量轉(zhuǎn)移至受體，供體發(fā)出的熒光 可被受體所猝滅。BACEl裂解底物時(shí)，由于不能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，來自于供體的熒光不能被猝 滅，熒光信號增加。當(dāng)加入抑制劑時(shí)由于底物裂解被抑制，熒光信號減低。利用這一原理，將 不同濃度的適配子Al加入BACE1及其熒光底物的混合物中，檢測熒光強(qiáng)度的變化。BACE1的 一種特異抑制劑、Gp30及U31作為對照。隨著濃度增加，標(biāo)準(zhǔn)抑制劑組中熒光值逐漸下降， 至500nM時(shí)熒光值較陽性對照顯著減低（P〈0. 01)。Al組在250nM的終濃度時(shí)熒光值急速 下降（Ρ〈0· 01)。Gp30及U31組熒光值無顯著減低。按抑制率（％)= IOO-(IFiZlFc1XlOO) 算出對BACEl活性的抑制率（IF i為加入測試物后的熒光值，IFtl為不加測試物即陽性對照 的熒光值）。將抑制率與測試物濃度的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析，擬合曲線，估算出Al的半 數(shù)抑制濃度（IC 5tl)為139. 81nM，小于標(biāo)準(zhǔn)抑制劑的IC5tl (242. 50nM)。說明Al對BACEl體外 活性的抑制作用強(qiáng)。
[0018] 接著將不同濃度（200ηΜ-10μΜ)的Al加入M17-APPsw細(xì)胞中培養(yǎng)24h后進(jìn)行 MTT實(shí)驗(yàn)以檢測Al對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示Al終濃度在不超過3μ M的范圍內(nèi) M17-APPsw細(xì)胞存活率不受影響。不同濃度（0. 1 μ Μ-3 μ Μ)Α1處理M17-APPsw細(xì)胞24h后 收集細(xì)胞蛋白提取液，進(jìn)行雙抗夾心ELISA法檢測A β 4(|及A β 42含量。在Al終濃度為3 μ M 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Αβ4(ι及Αβ42濃度較空白組（未予任何處理組）均有顯著下降（Ρ〈0.01)。因此 用3 μ M的Al作用于細(xì)胞后，收集細(xì)胞蛋白提取液及培養(yǎng)基進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測。3 μ M 的Gp30、U31處理組和空白組作為對照。結(jié)果顯示M17-APPsW的細(xì)胞內(nèi)分泌的A β 4(|及培養(yǎng) 基中分泌的A β 4Q濃度均較對照組顯著下降（Ρ〈0. 01)。同樣，M17-APPwt的細(xì)胞內(nèi)A β 4Q及 培養(yǎng)基中A β 4(|濃度均較對照組顯著下降（P〈0. 01)。與A β 4(|類似，M17-APPSW的細(xì)胞A β 42 及細(xì)胞培養(yǎng)基中Αβ42濃度均較對照組顯著下降（Ρ〈0.01)。為檢測Al對AD細(xì)胞模型中 sAPPP蛋白表達(dá)的影響，對AU Gp30及U31處理后的M17-APPsw細(xì)胞裂解物進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)。孵育的一抗分別為針對APP氨基端的APP抗體及anti-BACEl抗體。結(jié)果顯 示Al組的sAPPP蛋白表達(dá)水平較各對照組顯著下降（P〈0. 01、P〈0. 05)，各組間sAPPa及 BACEl的表達(dá)量無明顯差異。上述結(jié)果提示Al能抑制AD細(xì)胞模型中BACEl活性。
[0019] 本研究通過SELEX技術(shù)成功篩選得到能以高親和力結(jié)合BACEl的DNA適配子Al 和A4,并證明該適配子具有抑制BACEl體外活性的作用。為新的強(qiáng)效特異的BACEl抑制劑 的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，為AD治療提供了新的方法和思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.目的ssDNA的獲得。A. anti-BACEl抗體鑒定BACEl蛋白的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。 B.引物3的二級結(jié)構(gòu)。C.引物3的由富含GC堿基的反向重復(fù)序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能在擴(kuò) 增時(shí)阻止正鏈延伸。D.不對稱PCR產(chǎn)物電泳圖：l，pUC18 DNA/Msp 1 ;2, ssDNA原庫Gp30 ; 3,不對稱PCR獲得的不同長度PCR產(chǎn)物；4,切膠回收后獲得的目的ssDNA。
[0021] 圖2. RNA STRUCTURES 5. 5軟件測算四個(gè)適配子序列的二級結(jié)構(gòu)。A、B、C、D分別 為適配子A1、A2、A3、A4的二級結(jié)構(gòu)。
[0022] 圖3.適配子AU A4、anti-BACEl和無關(guān)對照適配子U31的結(jié)合曲線。
[0023] 圖4. Al、標(biāo)準(zhǔn)抑制劑、Gp30和U31的FRET實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A.不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抑制劑對 熒光強(qiáng)度變化的影響。B.不同濃度適配子對熒光強(qiáng)度變化的影響。C.標(biāo)準(zhǔn)抑制劑的抑制 曲線。D. Al的抑制曲線。*與陽性對照組比較P〈0. 05 Γ與陽性對照組比較P〈0. 01。
[0024] 圖5.生物素標(biāo)記的適配子Al通過鏈親和素磁珠與M17-APPSW細(xì)胞蛋白裂解物孵 育釣取靶蛋白。1，生物素標(biāo)記的Al與細(xì)胞蛋白提取液孵育；2,生物素標(biāo)記的原庫GP30與 細(xì)胞蛋白提取液孵育；3,生物素標(biāo)記的無關(guān)對照適配子U31與細(xì)胞蛋白提取液孵育；4,空 白對照（不加適配子）組。
[0025] 圖6.不同濃度Al對M17-APPsw細(xì)胞存活率的影響。
[0026] 圖7.不同濃度Al對M17-APPSW細(xì)胞中Αβ4(ι及Αβ42產(chǎn)量的影響。組與blank 組比較P〈〇. 01。
[0027] 圖8.Al、Gp30、U31終濃度分別為3μΜ時(shí)Αβ4(ι濃度的比較。A.M17-APPSW細(xì)胞內(nèi) 分泌的Αβ 4。濃度在Al組、Gp30組、U31組和blank組中的比較。Β. M17-APPSW細(xì)胞培養(yǎng)基 中分泌的A β 4(|濃度在各組中的比較。C. Ml7-APPwt細(xì)胞內(nèi)分泌的A β 4(|濃度在各組中的比 較。D. M17-APPwt細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌的Αβ 4。濃度在各組中的比較。#Al組與Gp30組、U31 組、blank 組比較 Ρ〈0· 01。##Gp30 組、U31 組與 blank 組比較 Ρ〈0· 01。#Gp30 組與 blank 組 比較 P〈0. 05。
[0028] 圖9. AU Gp30、U31終濃度分別為3 μ M時(shí)Αβ 42濃度的比較。A.熒光顯微鏡觀察 APPsred轉(zhuǎn)染M17-APPsw細(xì)胞后的紅色熒光。B. APPsred轉(zhuǎn)染后M17-APPsw細(xì)胞內(nèi)的A β 42 產(chǎn)量上升。C. M17-APPSW細(xì)胞內(nèi)分泌的Αβ 42濃度在Al組、Gp30組、U31組和blank組中的 比較。D. M17-APPsw細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌的Αβ 42濃度在各組中的比較。#Al組與Gp30組、 U31 組、blank 組比較 Ρ〈0· 01。#Gp30 組與 blank 組比較 Ρ〈0· 05。
[0029] 圖10. Al對M17-APPsw細(xì)胞內(nèi)sAPP α、sAPP β及BACEl蛋白表達(dá)量的影響。 A. sAPPa、sAPPP及BACEl在Al組、Gp30組、U31組和blank組中的蛋白免疫印跡圖。Β、 C、D分別為sAPPii、sAPPa及BACEl的顯影條帶在各組中的定量分析圖。組與Gp30 組、blank組比較Ρ〈0·01。 #A1組與U31組比較Ρ〈0·05。

【具體實(shí)施方式】：
[0030] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0031] 實(shí)施例1 :用微孔板法篩選針對結(jié)合BACEl胞外區(qū)并具有抑制活性的適配子
[0032] 實(shí)驗(yàn)一、文庫的構(gòu)建及引物的合成
[0033] 長度為73nt的隨機(jī)ssDNA文庫由Invitrogen公司合成，其兩端為固定序列， 中間為30nt的隨機(jī)序列，庫容量約為101445。序列為：5' -GCAATGGTACGGTACTTCC(30N) CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。
[0034] 根據(jù)文庫兩端固定序列分別設(shè)計(jì)相對應(yīng)的引物序列為：
[0035] 引物 1 :5, -GCAATGGTACGGTACTTCC-3，
[0036] 引物 2 :5，-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 '
[0037] 引物 3 :5, -GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTT GJ
[0038] 其中用于雙鏈擴(kuò)增PCR的是引物1和引物2 ;引物3的5'端還含有33個(gè)富含GC 堿基的反向重復(fù)序列（下劃線堿基），用于與引物1進(jìn)行PCR產(chǎn)生不同長度的單鏈DNA (不 對稱PCR)，以便形成亞文庫。引物1和引物2的5'端可通過標(biāo)記生物素（biotin)用于觀 察和測定適配子與BACEl蛋白的結(jié)合親和力和特異性。
[0039] 實(shí)驗(yàn)二、微孔板法篩選針對BACEl胞外區(qū)蛋白的適配子
[0040] 1針對BACEl胞外區(qū)蛋白的適配子的SELEX篩選：
[0041] 主要包括孵育結(jié)合、分離、擴(kuò)增、分離ssDNA、得到次級文庫、再結(jié)合等重復(fù)步驟， SELEX整個(gè)篩選過程如下：BACEl胞外區(qū)蛋白購自sigma公司。
[0042] 篩選前一天，將BACEl胞外區(qū)蛋白溶于PBS后，包被于96孔板中，4°C過夜。篩選 前棄去包被上清，加入封閉液（3 % BSA)于37°C封閉2h后用200 μ L洗滌緩沖液洗孔。預(yù) 先將一定濃度的上述隨機(jī)ssDNA文庫于95°C加熱5min，冰上冷卻lOmin，加入200 μ L結(jié) 合緩沖液中混勻，室溫放置30min，得到熱變性處理過的DNA。洗孔后加入熱變性處理過的 DNA，37°C孵育2h。孵育后用洗滌緩沖液洗孔以洗去未結(jié)合的DNA。未洗脫的DNA-蛋白復(fù) 合物中加入200 μ L PBS，于95°C加熱器加熱5min，冰上冷卻5min后取適量上清為模板，用 引物2和引物3進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，將所得單鏈產(chǎn)物切膠回收放入I. 5mL EP管中，加入 400 μ L/管的凝膠洗脫液，37°C振搖6h后，在上清中將洗脫液轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入1/10 體積的3mol/L NaAc(pH5. 2)，1/100體積的lmol/L MgCl2和2倍體積的無水乙醇，-20°C沉 淀過夜。4°C離心14, 000 rpm收集沉淀的ssDNA，然后用70%的預(yù)冷乙醇洗滌一次，待沉 淀干燥后用適量dd H2O溶解，用紫外分光光度計(jì)對ssDNA進(jìn)行定量。此時(shí)得到的ssDNA作 為次文庫用于下一輪篩選。為增加篩選壓力，提高篩選的DNA適配子的特異性與親和力，在 篩選過程中隨著篩選輪數(shù)增加，逐漸減少文庫及靶蛋白的投入量，減少孵育時(shí)間，增加鮭精 DNA投入量，增加洗滌時(shí)間，并從第四輪開始設(shè)立反篩過程（篩選前一晚用200yL PBS單獨(dú) 包被一空白對照孔，3 % BSA封閉，孵育時(shí)先將DNA與空白對照孔于37°C結(jié)合40min，反篩去 除非特異結(jié)合的ssDNA，然后轉(zhuǎn)移到BACEl包被孔與BACEl于37°C結(jié)合40min)。
[0043] 2篩選的次級文庫制備：
[0044] 通過引物1和引物3進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增得到不同長度的ssDNA產(chǎn)物，并用尿素 膠分離。尿素膠分離過程：將玻璃板洗凈晾干，把玻璃板固定在灌膠支架上，稱取尿素，按配 方加入水后，在水浴鍋中將尿素融化后在加入其它組分，將加好凝膠混勻后迅速倒入兩玻 璃板間隙，并迅速斜插入梳子，防止產(chǎn)生氣泡。待膠聚合好后，取下膠板，安裝在電泳槽中， 在內(nèi)外槽添加電泳緩沖液（I X TBE)。由于膠中含有尿素，尿素液會(huì)積聚在上樣孔中，影響上 樣，故上樣前需先用ImL注射器針頭沖洗加樣孔，將尿素液吸掉。不對稱PCR產(chǎn)物或ssDNA 樣品加變性凝膠加樣緩沖液混合，上樣。連接電極（正極接下槽），在100V-200V恒壓下進(jìn) 行電泳。待條帶電泳至凝膠的下部時(shí)中斷電源，卸下玻璃板，將凝膠放置于溴化乙錠染色液 (0. 5 μ g/mL溴化乙錠，I XTBE)中染色lOmin。在凝膠成像儀上成像，觀察檢測條帶并確定 目的條帶的位置。
[0045] 3.切膠回收ssDNA次文庫
[0046] 將溴化乙錠染色后的膠片放在鋪好保鮮膜的長波紫外燈上，打開紫外燈，在防護(hù) 罩防護(hù)下觀察DNA電泳條帶，迅速用銳利刀片切取目的條帶。將膠條切碎，放入I. 5mL EP 管中，加入400 μ L凝膠洗脫緩沖液，于37°C搖床上洗脫6h。將洗脫液吸到新的I. 5mL離心 管中，加入2. 5倍體積的無水乙醇，1/10體積的3mol/L NaAc (ρΗ5· 2)，1/100體積的lmol/L MgC12,于-20°C冰箱放置過夜后取出，4°C、14, OOOrpm離心30min，棄上清，沉淀用4°C預(yù)冷 的70%乙醇沖洗后再離心棄上清，沉淀于室溫干燥20min，將干燥好的DNA溶于50 μ L三蒸 水中，震蕩混勻用紫外分光光度計(jì)測定DNA量，-20°C保存?zhèn)溆?。選擇適量DNA作為下輪篩 選用的次文庫。
[0047] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示見圖1。純化的人BACEl胞外片段作為SELEX篩選的靶蛋白。 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測到該蛋白于70KDa處呈現(xiàn)為一清晰的單一條帶，與BACEl的分子量 一致（圖1A)。靶蛋白與DNA原庫孵育后，結(jié)合的BACE1-DNA復(fù)合物通過加熱分離，用引物 1和引物3進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，獲得目的ssDNA單鏈。弓丨物3的5'端引入富含GC堿基 的反向重復(fù)序列，能夠形成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，具有較高的Tm值，在Taq酶能較好發(fā)揮作用的溫 度范圍之內(nèi)（55°C -65°C )仍可保持穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，從而阻止正鏈的延伸（圖1B-C)。因 此，得到的PCR產(chǎn)物為兩條長度不同的ssDNA單鏈，在尿素變性PAGE凝膠上分離，顯示遷移 速率不同的兩條帶，短鏈位置與單鏈模板相當(dāng)，長鏈位置相當(dāng)于引物3延伸產(chǎn)物，比短鏈長 37個(gè)堿基（圖1D)。對短鏈進(jìn)行切膠回收后可獲得73bp的目的ssDNA單鏈（圖1D)，作為 次級亞文庫用于下一輪篩選。
[0048] 4.克隆測序：
[0049] T載體克隆反應(yīng)體系如下：
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種與β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適配子或其化學(xué)修飾物，其 特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的任意一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸適配子的化學(xué)修飾物，其特征在于，所述的化學(xué)修飾 物是在上述核酸適配子中包括的至少一個(gè)核苷酸的核糖2'位上的羥基被氫原子、氟原 子、-0-?；桶被腥我庖环N所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin的任意 修飾。
3. 權(quán)利要求1所述的與β_淀粉樣前體蛋白裂解酶1特異性結(jié)合的核酸適配子或其化 學(xué)修飾物作為BACE1抑制劑在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/115GK104293794SQ201410495810
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】石玉生, 張興梅, 梁惠玉, 陳文君, 彭勇華 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)