用于抑制β淀粉樣蛋白聚集的多肽和多肽功能化的金納米粒子及制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于抑制β淀粉樣蛋白聚集的多肽和多肽功能化的金納米粒子 及制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默氏癥（AD)是老年癡呆癥的最主要發(fā)病形式，截止2011年，全球已有 3500萬名AD患者，而與AD相關(guān)的死亡病例大約有48. 6萬例。AD的發(fā)病人數(shù)已經(jīng)僅次于癌 癥和心臟病，成為最耗費(fèi)社會(huì)財(cái)政支出的疾病之一。AD的病理學(xué)特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)由tau 蛋白形成的神經(jīng)纖維扭結(jié)以及細(xì)胞外的β淀粉樣蛋白（Αβ)沉積。Αβ是含有39-43個(gè) 氨基酸殘基的多肽，由淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP)經(jīng)β和γ 分泌酶依次切割形成。Αβ的兩種主要類型分別是Αβ 40和Αβ 42,其中Αβ 40含量較為豐 富，但Αβ42毒性更強(qiáng)。許多研究證明，Αβ的聚集特別是寡聚化過程與AD的發(fā)病緊密相 關(guān)。因此在Αβ聚集的早期對(duì)其進(jìn)行抑制是可行的治療手段，能夠阻止或延遲AD的發(fā)病。
[0003] 研究者已經(jīng)開發(fā)了多種針對(duì)Αβ的抑制劑，包括多酚類，多肽及其衍生物，抗體和 納米粒子等。這些抑制劑在體外試驗(yàn)以及細(xì)胞試驗(yàn)中具有一定效果，但他們的生物相容性、 體內(nèi)穩(wěn)定性等均存在問題。多肽具有分子量小、無免疫原性及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，且其易于合 成和修飾，理化性質(zhì)明確。因此可以通過理性設(shè)計(jì)得到理想的Αβ多肽抑制劑。由于Αβ 的疏水核心序列（KLVFFAE)對(duì)Αβ的聚集起重要作用，因此研究者基于此多肽設(shè)計(jì)開發(fā)了 以LPFFD為代表的一系列具有明顯抑制A β聚集效果的多肽抑制劑，然而這些多肽抑制劑 存在穩(wěn)定性差、易被降解和自聚等缺點(diǎn)，至今沒有得到實(shí)際應(yīng)用。
[0004] 近年隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米粒子在藥物遞送方面發(fā)揮重要作用。特別是金納 米粒子（GNP)具有低毒性、易于檢測(cè)和成像、合成方法成熟、能夠穿過血腦屏障等特點(diǎn)，常 用于藥物遞送與機(jī)理研究。其表面易于進(jìn)行功能化修飾。若將多肽抑制劑修飾在納米粒子 (NP)表面，研發(fā)多肽功能化GNP，不但能改善多肽配基的作用效率和溶解性等缺陷，還能引 入納米效應(yīng)，利用金納米粒子的性質(zhì)，可大大增強(qiáng)其對(duì)A β的抑制作用，成為具有前景的治 療AD的候選藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計(jì)合成一種多肽和多肽功能化的金納米 粒子，并提供多肽功能化的金納米粒子在制備抑制β淀粉樣蛋白聚集藥物的用途。
[0006] -種用于抑制β淀粉樣蛋白聚集的多肽，具有SEQ ID No. 1氨基酸序列：Val-Va Ι-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考查，該多肽自身具有一定的抑制β淀粉 樣蛋白聚集的能力。
[0007] 由于多肽功能化的納米粒子抑制β淀粉樣蛋白聚集的效果一般要好于游離多 肽，所以本發(fā)明利用上述多肽氨基酸序列制備了功能化的金納米粒子，其結(jié)構(gòu)表達(dá)如下：
[0008]
O
[0009] 本發(fā)明的金納米粒子的制備方法，是從Αβ的經(jīng)典抑制劑LPFFD和C末端序列 VVIA出發(fā)，設(shè)計(jì)得到特定多肽VVIACLPFFD，并在金納米粒子表面形成特定的結(jié)構(gòu)。
[0010] 本發(fā)明的具體說明如下：本發(fā)明所述的多肽功能化的金納米粒子，所用的納米粒 子為直徑15nm的金納米粒子（GNP)，所用的特定多肽VVIACLPFFD，具有SEQ ID No. 1氨基 酸序列：Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pr〇-Phe-Phe-Asp〇
[0011] 本發(fā)明首先從A β的經(jīng)典抑制劑LPFFD和C末端序列VVIA出發(fā)，經(jīng)過理性設(shè)計(jì)得 到特定多肽VVIACLPFFD，這一多肽分子能夠同時(shí)發(fā)揮LPFFD和VVIA的抑制性質(zhì)，不會(huì)彼此 沖突，并能夠在金納米粒子表面形成特定的結(jié)構(gòu)，放大其抑制A β聚集的效果。將其修飾在 直徑為15nm的金納米粒子上，通過多肽自身的抑制作用和與納米粒子的協(xié)同作用，提高其 與Αβ間的相互作用，有效抑制Αβ聚集。
[0012] 優(yōu)選的制備過程：
[0013] 1)將氯金酸水溶液（濃度為lmmol/L)煮沸回流10-30min ;加入熱的檸檬酸鈉水 溶液（濃度為38. 8mmol/L，氯金酸水溶液：梓檬酸鈉水溶液體積比=10:1)后，持續(xù)攪拌回 流30-60min ;反應(yīng)液冷卻后過濾去除沉淀，得到GNP溶液；
[0014] 2)配制多肽VVIACLPFFD的水溶液（濃度為l-3mmol/L);將其加入到l-5nmol/L 的GNP溶液中（多肽水溶液：GNP水溶液體積比=1:10)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-6h (反應(yīng)時(shí)加入 的多肽過量以保證GNP表面的完全修飾）。
[0015] 3)制得的溶液先通過孔徑0. 45微米濾膜除去沉淀，隨后將濾液使用去離子水透 析3-7天（透析截流分子量3000-10000道爾頓）除去其中殘余可溶物，得到多肽功能化的 金納米粒子水溶液。
[0016] 4)將多肽功能化的金納米粒子水溶液保存在4°C下。
[0017] 本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有三點(diǎn)，首先是多肽序列的結(jié)構(gòu)，多肽VVIACLPFFD將Αβ的C 末端序列VVIA和Αβ的經(jīng)典抑制劑LPFFD以半胱氨酸C連接，VVIA的疏水部分和LPFFD 的帶電部分暴露在肽鏈的兩端，使得這兩個(gè)肽段能夠發(fā)揮各自的作用；其次是當(dāng)多肽 VVIACLPFFD交聯(lián)在金納米粒子上時(shí)，交聯(lián)的位置在半胱氨酸C的側(cè)鏈巰基上，這時(shí)多肽的 兩端分別在納米粒子表面伸展，使得VVIA和LPFFD以一定構(gòu)象暴露在溶液中，能夠同時(shí)與 Αβ分子結(jié)合，從而加快抑制作用并提高抑制效果；最后是交聯(lián)以后的多肽功能化的金納 米粒子在溶液中成穩(wěn)定的膠體溶液，穩(wěn)定性相比金納米粒子大大提高，多肽功能化的金納 米粒子是單分散的，有利于與尺寸更小的A β聚集體結(jié)合并抑制其聚集。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 多種實(shí)驗(yàn)手段證明，多肽功能化的金納米粒子能夠有效抑制Αβ 42的聚集；改變 了 Αβ 42聚集體的形貌，減少了 Αβ 42纖維的生成；并在低濃度（0. lnmol/L)下有效抑制了 A β 42的細(xì)胞毒性。多肽功能化的金納米粒子作為一種潛在的AD治療藥物，可以有效地抑 制A β 42的寡聚化以及纖維形成過程，并降低A β 42聚集過程中所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用，是 Aβ 42聚集的理想抑制劑。金納米粒子作為制備治療阿爾茨海默氏癥的藥物的應(yīng)用有廣闊 的前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :實(shí)施例1中多肽功能化的金納米粒子的透射電鏡圖
[0021] 圖2Α :實(shí)施例2中未修飾的GNP的熱重分析圖
[0022] 圖2Β :實(shí)施例2中多肽功能化的金納米粒子的熱重分析圖
[0023] 圖3 :實(shí)施例3中0. lnmol/L-3. 5nmol/L濃度的多肽功能化的金納米粒子與Αβ 42 共培養(yǎng)24h后培養(yǎng)物的ThT熒光圖
[0024] 圖4A :實(shí)施例4中A β 42單獨(dú)培養(yǎng)24h后培養(yǎng)物的透射電鏡圖
[0025] 圖4B :實(shí)施例4中l(wèi)nmol/L的多肽功能化的金納米粒子與A β 42共培養(yǎng)24h后培 養(yǎng)物的透射電鏡圖
[0026] 圖5 :實(shí)施例5中l(wèi)nmol/L的多肽功能化的金納米粒子與A β 42共培養(yǎng)24h后培 養(yǎng)物的粒徑分布圖。
[0027] 圖6A :實(shí)施例6中0. lnmol/L-3. 5nmol/L濃度的多肽功能化的金納米粒子與 A β 42共培養(yǎng)24h后培養(yǎng)物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性（MTT實(shí)驗(yàn)）。
[0028] 圖6B :實(shí)施例6中0. lnmol/L-3. 5nmol/L濃度的多肽功能化的金納米粒子與 A β 42共培養(yǎng)24h后培養(yǎng)物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性（LDH釋放實(shí)驗(yàn)）。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0030] 本發(fā)明首先從A β的經(jīng)典抑制劑LPFFD和C末端序列VVIA出發(fā)，經(jīng)過理性設(shè)計(jì)得 到特定多肽 VVIACLPFFD 氨基酸序列：Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp〇
[0031] 多肽的結(jié)構(gòu)式如下：
[0033] 這一多肽分子能夠同時(shí)發(fā)揮LPFFD和VVIA的抑制性質(zhì)，不會(huì)彼此沖突，并能夠在 金納米粒子表面形成特定的結(jié)構(gòu)，放大其抑制聚集的效果；將其修飾在直徑為15nm的金納 米粒子上，通過多肽自身的抑制作用和與納米粒子的協(xié)同作用，提高其與Αβ間的相互作 用，有效抑制Αβ聚集；結(jié)構(gòu)不意如下：
[0034]
[0035] 本發(fā)明的多肽功能化的金納米粒子的制備方法，其步驟如下：
[0036] 1)將氯金酸水溶液（濃度為lmmol/L)煮沸回流10-30min ;加入熱的檸檬酸鈉水 溶液（濃度為38. 8mmol/L，氯金酸水溶液：梓檬酸鈉水溶液體積比=10:1)后，持續(xù)攪拌回 流30-60min ;反應(yīng)液冷卻后過濾去除沉淀，得到GNP溶液；
[0037] 2)配制多肽VVIACLPFFD的水溶液（濃度為l-3mmol/L);將其加入到l-5nmol/L 的GNP溶液中（多肽水溶液：GNP水溶液體積比=1:10)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-6h (反應(yīng)時(shí)加入 的多肽過量以保證GNP表面的完全修飾）。
[0038] 3)制得的溶液先通過孔徑0. 45微米濾膜除去沉淀，隨后將濾液使用去離子水透 析3-7天（透析截流分子量3000-10000道爾頓）除去其中殘余可溶物，得到多肽功能化的 金納米粒子水溶液。
[0039] 4)將多肽功能化的金納米粒子水溶液保存在4°C下。
[0040] 利用多種實(shí)驗(yàn)手段證明，多肽功能化的金納米粒子可以有效抑制Αβ 42聚集，并 能降低A β 42聚集過程中所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。
[0041] 實(shí)施例1 :多肽功能化的金納米粒子的形貌
[0042] 將多肽功能化的金納米粒子的水溶液滴加在400目的碳膜銅網(wǎng)上，自然干燥。然 后用透射電鏡（Tecnai G2 F20)進(jìn)行觀察，檢測(cè)電壓為200kV，選取放大后標(biāo)尺為50nm的圖 像進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。
[0043] 由圖1可知，多肽功能化的金納米粒子的形貌為較規(guī)則的球形，經(jīng)過軟件分析，多 肽功能化的金納米粒子的直徑為15. 0±1. 2nm。
[0044] 實(shí)施例2 :未修飾的GNP和多肽功能化的金納米粒子的質(zhì)量變化
[0045] 將未修飾的GNP和多肽功能化的金納米粒子的水溶液濃縮并凍干成棕色納米粉 末，放入熱重分析儀中進(jìn)行分析。將納米粉末由室溫程序升溫（5°C/min)至900°C，并伴隨 氮?dú)獯祾撸馑?0mL/min)，使GNP表面修飾的多肽分解揮發(fā)，記錄質(zhì)量損失。結(jié)果如圖2 所示。
[0046] 如圖2A可知，未修飾的GNP在加熱前后質(zhì)量無明顯變化。由圖2B可知，多肽功 能化的金納米粒子在加熱以后損失了 2. 148 %的質(zhì)量。直徑15nm的GNP相對(duì)分子質(zhì)量為 20539千道爾頓，損失的分子質(zhì)量約為441千道爾頓。每修飾一個(gè)VVIACLPFFD分子，其分子 量增加1123. 38道爾頓。所以多肽功能化的金納米粒子的平均修飾率約為400,即平均每個(gè) GNP上修飾了約400個(gè)VVIACLPFFD多肽分子。
[0047] 實(shí)施例3 :0. lnmol/L-3. 5nmol/L濃度的多肽功能化的金納米粒子