一種利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育aa高產(chǎn)菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法。為了獲得高產(chǎn)花生四烯酸的高山被孢霉菌株，本發(fā)明利用原生質(zhì)體融合的方法，將兩種具備不同優(yōu)良特性的高山被孢霉進行融合處理，并結(jié)合熒光染色方法對融合子篩選。其具體步驟包括：兩親本菌株的培養(yǎng)、兩親本菌株原生質(zhì)體的制備、兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色、兩親本菌株原生質(zhì)體的融合及融合子的篩選及驗證。本發(fā)明所述方法操作簡單，過程易實現(xiàn)，育種成功幾率高。該方法可用于提高花生四烯酸生產(chǎn)菌的產(chǎn)量水平、優(yōu)化花生四烯酸產(chǎn)品的油脂組分和改良菌種性狀等用途。
【專利說明】
一種利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法
[0001 ] 技術領域:
本發(fā)明涉及一種高山被孢霉融合子制備及熒光染色篩選的方法。
[0002]【背景技術】:
花生四稀酸(arachidonic acid，縮寫AA)，是一種二十碳不飽和脂肪酸，在人體很多生理過程中起著重要作用。具有酯化膽固醇、抑制血小板聚集、降低血液黏度、調(diào)節(jié)白細胞功能、提高免疫力，促進嬰幼兒大腦發(fā)育等功能。衛(wèi)生部在1994年正式批準，可在嬰幼兒配方食品中添加AA，1999年AA被正式列入新型營養(yǎng)強化劑。近年來已在保健食品、醫(yī)藥、化妝品等領域得到廣泛應用。
[0003]天然AA少量存在于動物肝和腎上腺、魚油和微生物(原生動物、變形蟲、微藻以及真菌)中，因含量過低不適合大規(guī)模的提取生產(chǎn)，近年來，發(fā)酵法生產(chǎn)AA—直是國內(nèi)外研究的熱點，高山被孢霉菌種因其油脂含量和AA含量高而被普遍應用于AA的發(fā)酵生產(chǎn)，2012年衛(wèi)生部發(fā)布《食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑使用標準》(GB14880-2012)確定其為AA的生產(chǎn)菌。高山被孢霉菌種選育是提高AA產(chǎn)量的有效手段之一。傳統(tǒng)的物理、化學誘變等育種方式存在突變方向不定、工作量大等缺點，因此，尋求更簡便而高效的育種方式一直是發(fā)酵行業(yè)的研究課題。
[0004]近年來，利用原生質(zhì)體融合技術選育微生物菌種受到人們的青睞。同傳統(tǒng)的誘變育種技術相比，原生質(zhì)體融合育種可以打破種屬限制，采用某些性狀優(yōu)異的菌株作為融合親株，可獲得性狀優(yōu)良的重組體。原生質(zhì)體融合技術應用于酵母工程菌及米曲霉工程菌的選育已經(jīng)比較成熟。目前尚未發(fā)現(xiàn)此方法應用于高山被孢霉。
[0005]對于融合子的篩選方法和技術，多利用營養(yǎng)缺陷標記或抗性標記，操作繁瑣，工作量大。本發(fā)明對制備的原生質(zhì)體進行熒光染色，可直觀判斷融合成功的融合子，簡單高效。
[0006]本發(fā)明通過原生質(zhì)體融合的方式，再利用熒光染色方法進行篩選融合子以達到育種目的，用以改造尚山被抱霉菌種，提尚其AA廣量，優(yōu)化AA廣品的油脂組分，提尚廣品品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法。
[0008]本發(fā)明的目的是利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子的方法進行優(yōu)良菌種篩選，簡單、快速、有效地改造菌株，選育AA高產(chǎn)菌株。
[0009]
本發(fā)明的目的通過如下的技術方案來實現(xiàn)。
[0010]本發(fā)明利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子的方法，將兩種具備不同優(yōu)良特性的高山被孢霉進行融合處理，并結(jié)合熒光染色方法對融合子篩選，具體包括以下步驟:
(I)兩親本菌株的培養(yǎng)分別將兩種具備不同優(yōu)良特性的高山被孢霉接于PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天，將孢子刮下，用無菌水制備孢子懸液，稀釋至18個孢子/ml，取Iml孢子懸液分別接入250ml的兩個三角瓶中，每個三角瓶中都裝有50ml PDA液體培養(yǎng)基，28°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)12-24h，制得兩親本菌株；
(2)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備
將步驟(I)獲得的菌絲體，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.5-1.0 mol/L NaCl溶液洗滌I次并離心，取Img離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶和幾丁質(zhì)酶，輕搖使離心后的菌絲體和酶解液充分混合，再置于28-32°C、轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫搖床中，酶解2_6h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4°C，5000r /min離心1min，沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體；
(3)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色
將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlPBS中，并分別加入Ιμ?的DiL(細胞膜紅色熒光探針)和Ιμ? D1(細胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，37°C避光溫育30min。離心去除染色劑，并用PBS緩沖液洗滌2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中懸浮。
[0011](4)兩親本菌株原生質(zhì)體的融合
將(3)中等量的熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4°C，5000r/min離心lOmin，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml 30%_40%PEG6000，輕輕搖勻，于25_35°C靜置30-9011^11，離心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液，
(5)融合子的篩選及驗證
在倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野下綠色激發(fā)光下看到菌體呈橙黃色，藍色激發(fā)光下看到菌體呈綠色，二者組合后呈紅色的即為融合子，觀察并計算融合率，顯微操作吸取融合子涂布再生平板，于28°C倒置培養(yǎng)2-5d，挑取融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落，轉(zhuǎn)接到另一再生平板培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到TOA培養(yǎng)基茄瓶中培養(yǎng)，使孢子大量生長，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速為180_250rmp，將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測AA產(chǎn)量。
[0012]上述技術方案中，所述混合酶解液中各酶的濃度分別為蝸牛酶10-20mg/ml、纖維素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml、幾丁質(zhì)酶0.2-0.5 mg/ml。
所述酶解時間為5h。
[0013]所述NaCl 濃度為 0.8mol/L。
[0014]所述的D1熒光染色劑的配制為ImgD1中加入10ml DMSO獲得，所述的Dil熒光染色劑的配制為Img Dil中加入10ml DMSO獲得。
[0015]所述的融合劑為30-40%PEG6000，融合操作為:30°C靜置lh。融合劑的最佳濃度為35%PEG，30°C靜置 lh。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點是:
1.利用原生質(zhì)體融合技術對具備兩種優(yōu)良性狀的菌株進行融合，獲得兼具兩者優(yōu)良性狀的融合菌株，定向改造菌種。
[0017]2.利用熒光染色方法篩選融合子，直觀簡便更大大減少了工作量。
[0018]3.目前，尚未發(fā)現(xiàn)該方法應用于高山被孢霉育種，為花生四烯酸高產(chǎn)菌株選育提供了一種新的手段。
[0019]【附圖說明】:
圖1為高山被孢霉原生質(zhì)體形態(tài)示意圖，其中圖a為原生質(zhì)體頂端釋放示意圖，圖b為原生質(zhì)體原位釋放示意圖，圖c為原生質(zhì)體形態(tài)示意圖。
[0020]圖2為熒光顯微鏡藍色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下圖片以及它們的組合圖，其中圖a為藍色激發(fā)光下圖片，圖b為綠色激發(fā)光下圖片圖c為組合圖。
[0021]圖3為本發(fā)明獲得融合菌株AA含量的氣相色譜圖。(ARA百分含量的計算使用的是面積歸一法，即ARA在氣相檢測圖譜中的峰面積占總峰面積的百分比)
【具體實施方式】:
本發(fā)明所用菌株G12和F24，均由高山被孢霉alpine cfcc88447(購于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心)紫外誘變后分離純化獲得，菌種以甘油管保存于-80 °C冰箱內(nèi)，每6個月轉(zhuǎn)存一次。G12，產(chǎn)孢子能力強，有利于傳代培養(yǎng)，但油脂含量較低;F24，油脂含量較高，但產(chǎn)孢子能力較弱，不易于傳代培養(yǎng)。
[0022]本發(fā)明所用的培養(yǎng)基及緩沖液:
1.PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2P04 0.0 5%, MgSO4 0.025%，ρΗ自夕犬.JWS ，
2.PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，ΚΗ2Ρ04 0.05%,MgSO4 0.025%，ρΗ自然；
3.再生培養(yǎng)基:以lmol/L山梨醇配制的PDA培養(yǎng)基；
4.PBS: NaH2PO4.H20 2.Hg^Na2HPO4 2.26g 溶于 10ml 水中，PH 6.5,
取上述配制好液體1ml，加入4.68g NaCl后加水定容到10ml即得到I3BS。
[0023]兩親本菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)量驗證
分別將Gl2和F24接于TOA茄瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2-4d，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp，將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測AA產(chǎn)量，
Gl 2的檢測結(jié)果:生物量34.15g/L，油脂含量達33.26%，AA含量達36.25%，AA產(chǎn)量4.12g/
L；
F24的檢測結(jié)果:生物量26.23g/L，油脂含量達43.61%，AA含量達47.16%，AA產(chǎn)量5.39g/L0
[0024]實施例1
(I)兩親本菌株的培養(yǎng)及收集
分別將G12和F24接于TOA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，將孢子刮下，用無菌水制備孢子懸液，稀釋至18個孢子/ml，取Iml孢子懸液接入裝液量為50ml PDA液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，制得兩親本菌株；
(2)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備
將步驟(I)獲得的菌絲體，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.8mol/NaCl溶液洗滌I次并離心，取Img離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蝸牛酶10-20 mg/ml、纖維素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和幾丁質(zhì)酶0.2-0.5 mg/ml，輕搖使離心后的菌體和酶解液充分混合，再置于28 °C、轉(zhuǎn)速80r/min的恒溫搖床中，酶解4h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4°C，5000r /min離心10111；[11，沉淀用0.8 mol/LNaCl溶液洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體；
(3)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlPBS中，并分別加入Ιμ?的DiL(細胞膜紅色熒光探針)和Ιμ? D1(細胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，37°C避光溫育30min，離心去除染色劑，并用PBS緩沖液洗滌2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl溶液中懸??；
(4)兩親本菌株原生質(zhì)體的融合
將步驟(3)等量的熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液置于離心管內(nèi)混合，于4°C，5000r/min離心lOmin，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml 30%PEG6000，輕輕搖勾，于28°C靜置451^11，離心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液；
(5)融合子的篩選及驗證
在倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野下綠色激發(fā)光下看到菌體呈橙黃色，藍色激發(fā)光下看到菌體呈綠色，二者組合后呈紅色的即為融合子，觀察并計算融合率約為20%，顯微操作吸取融合子涂布再生平板，于28°C倒置培養(yǎng)2-5d，挑取融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落50個，轉(zhuǎn)接到另一再生平板培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基茄瓶中培養(yǎng)，使孢子大量生長，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp，將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測AA產(chǎn)量，其中有15株菌產(chǎn)量高于兩親本菌株產(chǎn)量，產(chǎn)量最高的一株菌AA產(chǎn)量達6.14g/L。
[0025]實施例2
(I)兩親本菌株的培養(yǎng)及收集
分別將兩株高山被孢霉Gl 2和F24接于PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，將孢子刮下，用無菌水制備孢子懸液，稀釋至18個孢子/ml，取Iml孢子懸液接入裝液量為50ml的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，制得兩親本菌株。
[0026](2)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備
將步驟(I)獲得的菌絲體，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.8moI/L NaCI溶液洗滌I次并離心，取Img離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蝸牛酶10_20 mg/ml、纖維素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和幾丁質(zhì)酶0.2-0.5 mg/ml。輕搖使離心后的菌體和酶解液充分混合，再置于30 °C、轉(zhuǎn)速80r/min的恒溫搖床中，酶解5h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4°C，5000r /min離心10111；[11，沉淀用0.8 mol/LNaCl洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體。
[0027](3)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色
將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlPBS中，并分別加入Ιμ?的DiL(細胞膜紅色熒光探針)和Ιμ? D1(細胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，37°C避光溫育30min。離心去除染色劑，并用PBS緩沖液洗滌2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中懸浮。
[0028](4)兩親本菌株原生質(zhì)體的融合
將(3)中等量的熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4°C，5000r/min離心lOmin，棄上清留沉淀。向沉淀中加入5ml 35%PEG6000，輕輕搖勻，30°C靜置60min。離心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液。
[0029](5)融合子的篩選及驗證
在倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野下綠色激發(fā)光下看到菌體呈橙黃色，藍色激發(fā)光下看到菌體呈綠色，二者組合后呈紅色的即為融合子，觀察并計算融合率約為40%。顯微操作吸取融合子涂布再生平板。于28°C倒置培養(yǎng)2-5d，挑取融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落50個，轉(zhuǎn)接到另一再生平板培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基茄瓶中培養(yǎng)。使孢子大量生長，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp。將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測AA產(chǎn)量。其中有22株菌產(chǎn)量高于兩親本菌株產(chǎn)量，產(chǎn)量最高的一株菌AA產(chǎn)量達6.59g/L。
[0030]實施例3
(I)兩親本菌株的培養(yǎng)及收集
分別將兩株高山被孢霉Gl 2和F24接于PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，將孢子刮下，用無菌水制備孢子懸液，稀釋至18個孢子/ml，取Iml孢子懸液接入裝液量為50ml PDA液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，制得兩親本菌株。
[0031](2)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備
將步驟(I)獲得的菌絲體，用無菌水洗滌離心2次，再以濃度0.8moI/L NaCI溶液洗滌I次并離心，取Img離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液，混合酶解液包括蝸牛酶10_20 mg/ml、纖維素酶5-10 mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml和幾丁質(zhì)酶0.2-0.5 mg/ml。。輕搖使離心后的菌體和酶解液充分混合，再置于32 °C、轉(zhuǎn)速80r/min的恒溫搖床中，酶解6h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4°C，5000r /min離心10111；[11，沉淀用0.8 mol/L NaCl洗滌2次后離心獲得原生質(zhì)體。
[0032](3)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色
將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mlPBS中，并分別加入Ιμ?的DiL(細胞膜紅色熒光探針)和Ιμ? D1(細胞膜綠色熒光探針)熒光染色劑，37°C避光溫育30min。離心去除染色劑，并用PBS緩沖液洗滌2次后加入0.5-1.0 mol/L NaCl中懸浮。
[0033](4)兩親本菌株原生質(zhì)體的融合、
將(3)中等量的熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管內(nèi)混合，于4°C，5000r/min離心lOmin，棄上清留沉淀。向沉淀中加入5ml 40%PEG6000，輕輕搖勻，32°C靜置90min。離心后沉淀用0.5-1.0 mol/L NaCl洗滌2次并懸浮，獲得懸浮液。
[0034](5)融合子的篩選及驗證
在倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野下綠色激發(fā)光下看到菌體呈橙黃色，藍色激發(fā)光下看到菌體呈綠色，二者組合后呈紅色的即為融合子，觀察并計算融合率約為25%。顯微操作吸取融合子涂布再生平板。于28°C倒置培養(yǎng)2-5d，挑取融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落50個，轉(zhuǎn)接到另一再生平板培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基茄瓶中培養(yǎng)。使孢子大量生長，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp。將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測AA產(chǎn)量。其中有11株菌產(chǎn)量高于兩親本菌株產(chǎn)量，產(chǎn)量最高的一株菌AA產(chǎn)量達5.98g/L。
[0035]實施例1-3所述的原生質(zhì)體制備及融合過程，經(jīng)比較得到最適原生質(zhì)體制備及融合條件:30°C酶解5h，35%PEG6000，30°C靜置保溫60min進行融合。
[0036]對實施例2中融合后挑選出的高產(chǎn)菌株傳5代驗證，性狀穩(wěn)定。第5代搖瓶發(fā)酵11天檢測結(jié)果為:生物量29.22g/L，油脂含量達46.63%，AA含量達48.25%，最終AA產(chǎn)量可達
6.57g/L。證明利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選方法用以篩選AA高產(chǎn)菌獲得了良好的效果。
【主權(quán)項】
1.一種利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于，將兩種具備不同優(yōu)良特性的高山被孢霉進行融合處理，并結(jié)合熒光染色方法對融合子篩選，具體包括以下步驟: (1)兩親本菌株的培養(yǎng) 分別將兩種具備不同優(yōu)良特性的高山被孢霉接于I3DA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天，將孢子刮下，用無菌水制備孢子懸液，稀釋至18個孢子/ml，取Iml孢子懸液分別接入250ml的兩個三角瓶中，每個三角瓶中都裝有50ml PDA液體培養(yǎng)基，28°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)12-24h，制得兩親本菌株； (2)兩親本菌株原生質(zhì)體的制備 將步驟(I)獲得的菌絲體，用無菌水洗滌離心2-3次，再用NaCl溶液洗滌1_2次并離心，取Img離心獲得的濕菌體加入5ml混合酶解液里，輕搖使離心后的菌體和酶解液充分混合，再置于28-32°C、轉(zhuǎn)速70-150r/min的恒溫搖床中，酶解2-6h，酶解液用四層高級擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，于4°C，5000r /min離心8_10min，棄上清留沉淀，沉淀用NaCl溶液洗滌，2-3次后尚心獲得原生質(zhì)體； (3)兩親本菌株原生質(zhì)體的熒光染色 將得到的兩親本原生質(zhì)體分別懸浮于5mLPBS緩沖液中，一個瓶加入IyL的DiL熒光染色劑，另一個瓶中加入IyL D1熒光染色劑，37°C避光溫育30min，離心去除染色劑，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，然后分別加入到等量的NaCl溶液中懸??； (4)兩親本菌株原生質(zhì)體的融合 取步驟(3)得到的等量的熒光染色的兩親本原生質(zhì)體懸液，加入到離心管內(nèi)混合，于40C，5000r/min離心1min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入5ml融合劑，輕輕搖勾，于25-35°C靜置30-90min，離心后沉淀用NaCl溶液洗滌2_3次并懸浮，獲得懸浮液； (5)融合子的篩選及驗證 在倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野下綠色激發(fā)光下看到菌體呈橙黃色，藍色激發(fā)光下看到菌體呈綠色，二者組合后呈紅色的即為融合子，觀察并計算融合率，顯微操作吸取融合子涂布于再生平板，于28 °C倒置培養(yǎng)2-5d，挑取融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落，轉(zhuǎn)接到另一再生平板培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)接到TOA培養(yǎng)基茄瓶中培養(yǎng)，使孢子大量生長，制備孢子懸液，接種瓶，于25-30°C，濕度30 — 60%條件下培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp，將種子液按5-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件培養(yǎng)8-14d，檢測花生四烯酸產(chǎn)量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:混合酶解液中各酶的濃度分別為蝸牛酶10-20 mg/ml、纖維素酶5-10mg/ml、溶菌酶0.2-0.8 mg/ml、幾丁質(zhì)酶0.2-0.5 mg/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:所述的NaCl溶液的濃度為0.5-1.0 mol/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:所述的D1熒光染色劑的配制為ImgD1中加入1ml DMSO獲得，所述的Dil熒光染色劑的配制為Img Dil中加入1ml DMSO獲得。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原生質(zhì)體融合結(jié)合熒光染色篩選融合子選育AA高產(chǎn)菌株 的方法，其特征在于:所述的融合劑為30-40%PEG6000，融合操作為:30°C靜置Ih。
【文檔編號】C12Q1/04GK106047856SQ201610312823
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】潘淼, 孫立潔, 陳祥松, 袁麗霞, 吳金勇, 凌瑞, 姚建銘
【申請人】中國科學院等離子體物理研究所