專利名稱：：淀粉樣前體蛋白n端結(jié)構(gòu)在其運輸和代謝過程中的作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及淀粉樣前體蛋白N端結(jié)構(gòu)在其運輸和代謝過程中的作用。
背景技術(shù)：
：老年癡呆癥是中、老年人群中最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，臨床特征包括記憶的下降，認(rèn)知能力的喪失，嚴(yán)重的行為異常并最終導(dǎo)致死亡。AD患者腦片顯示有三種異常病理特征老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞的大量減少。老年斑的主要組分是含有3943個氨基酸殘基的P淀粉樣蛋白(l-amyloidprotein，AP)，它主要有兩種形式AP40和A1342，分別由40和42個氨基酸組成，其中A1342主要分布于AD病人腦中，是有細(xì)胞毒性的形式。以AP神經(jīng)毒性為中心的AP假說已成為目前學(xué)術(shù)界廣為接受的AD發(fā)病機制。AP是由淀粉樣前體蛋白(Amyloidprecursor，tein，APP)經(jīng)分泌酶水解而來。APP基因位于第21號染色體上，共有18個外顯子，經(jīng)剪切加工形成不同的編碼產(chǎn)物APP770、APP751和APP695等。APP695(缺少第7、第8兩個外顯子)特異表達(dá)在大腦中，尤其在神經(jīng)元細(xì)胞中高表達(dá)，與AP的產(chǎn)生關(guān)系最密切。APP蛋白單次跨膜，屬于I型跨膜蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)的運輸途徑包括分泌和內(nèi)吞兩個過程。APP在核糖體中合成后，首先通過細(xì)胞內(nèi)的運輸途徑，依次經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，被運輸小泡運輸?shù)郊?xì)胞表面，然后在其胞內(nèi)端內(nèi)吞信號的指導(dǎo)下，通過細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞途徑被內(nèi)吞小泡帶回到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入內(nèi)吞體，溶酶體等細(xì)胞器中。在上述過程中，APP可以被定位于不同細(xì)胞器上的各種分泌酶所切割，產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。APP的細(xì)胞內(nèi)代謝主要有兩種不同的途徑，根據(jù)最終是否產(chǎn)生AP，可以分為非淀粉樣蛋白途徑和淀粉樣蛋白途徑。由于a-分泌酶(a-secretase)禾PP_分泌酶(P-secretase)分別介導(dǎo)了這兩個過程，因此又被稱為a-分泌酶代謝途徑和e-分泌酶代謝途徑。如圖1所示，在正常生理狀況下，APP在細(xì)胞內(nèi)主要在細(xì)胞膜表面通過非淀粉樣代謝途徑被代謝，APP先在a-分泌酶作用下，生成含部分A13序列的分泌性APP(secretoryAPP，sAPPa)和包含83個氨基酸的羧基末端跨膜片段(APPC-terminalfragment,C83)，該羧基末端片段則在細(xì)胞內(nèi)被進(jìn)一步降解。金屬酶家族成員ADAM9，ADAM10，ADAM17具有a-分泌酶活性。a-分泌酶的作用位點位于AP序列內(nèi)部，酶切后會破壞AP的完整結(jié)構(gòu)，因此不會生成AP。而在e-分泌酶代謝途徑中，APP會在分泌小泡或者內(nèi)吞體、溶酶體等處被e-分泌酶作用，生成分泌性sAPPI3和含有AP完整結(jié)構(gòu)的羧基末端片段(C99)，P-分泌酶(e-secretase)進(jìn)一步在膜上將C99片斷水解，生成AP和APP胞內(nèi)區(qū)(APPintracellulardomain,AICD)片斷。P-分泌酶又稱BACE(beta-siteAPP-cleavingenzyme)，是天冬氨酸蛋白酶家族的一個特殊成員。Y-分泌酶是一個由四種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，包括早老素蛋白l(Presenlin1，PS1)，Nicastrin，Aph-l和Pen-2，其中發(fā)揮催化作用的是PSl跨膜部分的天冬氨酸殘基所提供的天冬氨酸水解酶活性。它在APP上的作用位點并不專一，產(chǎn)生的A|3主要有A|340和A|342兩種，其中A|342疏水性更強，在生理條件下更容易形成有毒的AI3寡聚體和沉積。在以往的工作中，本發(fā)明人已經(jīng)克隆到一種人APP基因的新剪接產(chǎn)物APP639(APP-AE2)。相比腦內(nèi)大量存在的APP695蛋白，APP-AE2缺少N端第二個外顯子編碼的56個氨基酸(E2區(qū))，參見ZL03129585.1。盡管現(xiàn)有技術(shù)中本領(lǐng)域人員對于APP蛋白作了大量的研究工作，然而APP蛋白上各區(qū)段對于APP自身代謝調(diào)節(jié)方面的了解還不夠清楚。因此，有必要對APP蛋白上各區(qū)段進(jìn)行更細(xì)致的研究，以找到合適的藥物靶點，為神經(jīng)退行性疾病防治藥物的篩選提供有效途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種對于篩選神經(jīng)退行性疾病防治藥物有用的藥物靶點，所述的靶點位于淀粉樣前體蛋白(APP)的N端。本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于所述的藥物靶點篩選藥物的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的淀粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO:1中第21-76位所示(56aa)。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的蛋白片段的用途，用于制備或篩選特異性作用于該蛋白片段的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)選自但不限于肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)選自特異性結(jié)合該蛋白片段的抗體，特異性結(jié)合該蛋白片段的配體，特異性作用于該蛋白片段(優(yōu)選阻滯該蛋白片段的活性)的小分子化合物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝進(jìn)而抑制神經(jīng)退行性疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括以含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列的淀粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用于該靶點(如抑制、阻滯或下調(diào)該靶點上蛋白片段的活性)的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括(1)提供一種淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(2)用候選物質(zhì)處理步驟(1)所述的淀粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用于所述的蛋白或片段中SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列位點的候選物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)選自(但不限于)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)是化合物(優(yōu)選小分子化合物)，抗體或配體。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括(1)提供一種淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第521-76位所示的氨基酸序列；(la)提供一種對照蛋白片段，所述的對照蛋白片段不含有SEQIDNO:l中第21-76位所示的氨基酸序列，其它氨基酸序列與(1)的淀粉樣前體蛋白或片段相同；(2)分別用候選物質(zhì)處理步驟(1)和(la)所述的蛋白或片段；(3)選擇出作用于步驟(1)的淀粉樣前體蛋白或片段，且不作用于步驟(la)的對照蛋白片段的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對于抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括(4)用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段(例如表達(dá)APP695蛋白)，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5)觀察步驟(4)的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白或片段與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、運輸小泡或內(nèi)吞體等細(xì)胞器的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括(4')用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5')測定步驟(4')的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段(CTF)的量，并與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理的表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段的細(xì)胞；若經(jīng)所述潛在物質(zhì)處理的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段的量在統(tǒng)計學(xué)上低于(如低20%;較佳地低50%;更佳地低100%或更低)對照組細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段的量，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的淀粉樣前體蛋白C端片段包括C99，C83，淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)區(qū)(AICD)，AP40，AP42。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括(4")用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5")測定步驟(4")的細(xì)胞內(nèi)是否形成斑塊結(jié)構(gòu)，若形成斑塊結(jié)構(gòu)，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。在本發(fā)明的第四方面，提供一種通過所述的方法獲得的抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是抗體。在本發(fā)明的第五方面，提供一種抗淀粉樣前體蛋白的抗體，所述的抗體特異性地結(jié)合所述的蛋白片段。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1.APP的兩種代謝方式，包括a-分泌酶代謝方式和|3_分泌酶代謝方式。圖2.APP蛋白N端E2的缺失引起APP代謝的下調(diào)。A.APP-AE2代謝產(chǎn)生的CTF少于APP695和APP-AE3，泳道1-4為a-分泌酶代謝過程，泳道5-8為P-分泌酶代謝過程，CTF包括C99myc、C83myc和AICDmyc。B.APP-AE2代謝產(chǎn)生的AP量少于APP695和APP-AE3。C.APP結(jié)構(gòu)示意圖。圖3.APP蛋白N端E2的缺失使得APP的a-分泌酶代謝過程和P-分泌酶代謝過程都被下調(diào)。A.APP-AE2的a-和p-分泌酶代謝過程的產(chǎn)物CTF和sAPP都少于APP695，泳道1-6為a-分泌酶代謝過程，泳道7-12為13-分泌酶代謝過程，wo-2抗體特異性的識別sAPPa，sAPPP抗體特異性的識別APP695產(chǎn)生的sAPPP，不能識別APPsw產(chǎn)生的sAPPP。B.APP-AE2不能與BACE共定位，APP695可以與BACE共定位，白色部分為共定位的APP與BACE。圖4.APP蛋白N端E2的缺失使得APP的亞細(xì)胞定位受到影響。A.APP-AE2沒有成熟形式的蛋白存在，APP695和APP-AE3都有相應(yīng)的修飾后的蛋白，myc抗體和wo-2抗體均可識別全長的APP-myc。B.APP-AE2和不同的細(xì)胞器標(biāo)志物(Marker)都沒有共定位，APP695和這些標(biāo)志物都可以共定位。其中，LMAN1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運輸小泡的標(biāo)志物，GM130是高爾基體的標(biāo)志物，EEA1是早期內(nèi)吞體的Marker,M6PR是晚期內(nèi)吞體的標(biāo)志物。圖5.APP蛋白N端E2區(qū)內(nèi)部Cys突變的APP代謝和定位情況與APP-AE2—致。A.C向G突變的APP-myc代謝產(chǎn)生的CTF和APP-AE2類似，都明顯少于APP695,泳道1-6為a-分泌酶代謝過程，泳道7-12為13-分泌酶代謝過程。B.C向G突變的APP-EYFP與APP-AE2類似都在細(xì)胞中形成聚集的斑塊結(jié)構(gòu)。圖6.APP-AE2所形成的特殊斑塊結(jié)構(gòu)并不是聚集體。A.APP-AE2與聚集體的標(biāo)志物都沒有共定位，Vimentin、y-tubulin、Ubiquitin是聚集體的標(biāo)志物(Marker)。B.APP-AE2與APP695—樣，在溫和去垢劑可溶性與非可溶性的組分中都有分布，s為可溶性組分，i為非可溶性組分。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次揭示淀粉樣前體蛋白(APP)的N端結(jié)構(gòu)在淀粉樣前體蛋白的運輸和代謝過程中發(fā)揮了重要作用，破壞APP蛋白的N端結(jié)構(gòu)可以使得細(xì)胞內(nèi)APP的運輸和代謝異常，毒性產(chǎn)物的生成顯著減少。基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以以APP蛋白的N端結(jié)構(gòu)作為藥物篩選的靶點，篩選可通過抑制該靶點從而抑制APP蛋白在細(xì)胞內(nèi)正常運輸和代謝的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是可以防治神經(jīng)退行性疾病的潛在物質(zhì)。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化7的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，"特異性作用于淀粉樣前體蛋白片段"是指一種物質(zhì)能夠與淀粉樣前體蛋白中內(nèi)含子2區(qū)域(優(yōu)選地是具有SEQIDNO:1中第21-76位所示氨基酸序列的位點)相互作用，從而抑制、阻滯或下調(diào)該區(qū)域的活性或功能。所述區(qū)域活性或功能的抑制、阻滯或下調(diào)對淀粉樣前體蛋白在細(xì)胞中的運輸或代謝產(chǎn)生影響。如本文所用，抗體的"特異性"是指抗體能結(jié)合于淀粉樣前體蛋白的內(nèi)含子2區(qū)域(優(yōu)選地是具有SEQIDNO:1中第21-76位所示氨基酸序列的位點)，從而抑制、阻滯或下調(diào)該區(qū)域的活性或功能。如本文所用，除非另外說明，"淀粉樣前體蛋白或片段"是全長的淀粉樣前體蛋白、各種剪切形式的淀粉樣前體蛋白，淀粉樣前體蛋白胞外區(qū)蛋白、淀粉樣前體蛋白N端結(jié)構(gòu)等的總稱。本文中，除非另外說明，所述的神經(jīng)退行性疾病是指一類與淀粉樣前體蛋白代謝產(chǎn)生細(xì)胞毒性片段(如AP42)相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如老年性癡呆(又稱為阿爾茨海默癥)。藥物耙點及其用途淀粉樣前體蛋白(APP)大部分位于細(xì)胞外，N端含有一個17個氨基酸的信號肽，胞內(nèi)部分是很短的APP蛋白C末端。由于C端包含了AP序列，是各種分泌酶的作用區(qū)域。到目前為止還沒有得到APP蛋白完整的晶體結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)的分析主要局限在APP胞外區(qū)域。一種APP蛋白的氨基酸序列例如可以與SEQIDN0:1所示的序列(APP695，GenBank登錄號NP_958817)基本上相同，APP695特異性表達(dá)在腦中，與AI3的產(chǎn)生密切相關(guān)。不同種屬的APP蛋白N端序列非常保守，氨基酸同源性高達(dá)36-84%。APP蛋白胞外N端區(qū)域含有九個a折疊和一個|3螺旋，構(gòu)成一個緊密的球形結(jié)構(gòu)。APP的N端富含半胱氨酸，形成三個二硫鍵，將整個APP蛋白胞外區(qū)域束緊在一起。APP蛋白的N端具有一個肝素結(jié)合區(qū)域，已知外源性的肝素能夠影響AI3的分泌。N端區(qū)域帶有較多堿性氨基酸，帶有的正電荷可以和大腦富含的氨基葡聚糖互相結(jié)合；鄰近的疏水區(qū)域可能具有配體結(jié)合能力，或能形成自身二聚體；APP蛋白N端區(qū)域的結(jié)構(gòu)和一些富含半胱氨酸的生長因子類似。本發(fā)明人經(jīng)過大量的工作，證明了APP蛋白N端結(jié)構(gòu)的完整性對于APP蛋白的正常運輸和代謝具有重要的作用。本發(fā)明人構(gòu)建了APP蛋白N端外顯子2(E2)缺失的蛋白(APP-AE2，該缺失使得APP蛋白的N端結(jié)構(gòu)被破壞)，發(fā)現(xiàn)APP-AE2在細(xì)胞內(nèi)的代謝水平明顯低于APP695或其它一些APP剪切形式，這種代謝異常主要發(fā)生在a-分泌酶、|3-分泌酶作用的過程，Y-分泌酶的作用并不受影響。并且，APP-AE2在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況也與APP695或其它一些APP剪切形式有不同。將E2區(qū)內(nèi)部的Cys定點突變可以得到與APP-AE2類似的結(jié)果。上述結(jié)果也提示了E2區(qū)的缺失引起APP的錯誤折疊導(dǎo)致APP蛋白代謝和定位的異常。并且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，APP蛋白的N端結(jié)構(gòu)被破壞后，在細(xì)胞內(nèi)主要以聚集的斑塊形式存在。細(xì)胞對于錯誤折疊的蛋白有多種應(yīng)對機制，其中一種是通過纖維蛋白的作用使得錯誤折疊的蛋白在中心體周圍形成聚集體(Aggresome)的結(jié)構(gòu)，但APP-AE2形成的這種特殊的結(jié)構(gòu)并不是聚集體結(jié)構(gòu)?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種分離的淀粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段是分離自淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域的蛋白片段。優(yōu)選的，所述的蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO:1中第21-76位所示(56aa)。所述的蛋白片段用于篩選與其可發(fā)生特異性作用的物質(zhì)，所述的物質(zhì)例如可選自(但不限于)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可以將所述的蛋白片段作為一種抗原，制備特異性結(jié)合該抗原的抗體?；谌L的淀粉樣前體蛋白作為抗原也可以獲得一些抗淀粉樣前體蛋白的抗體，然而這些抗體可能結(jié)合于淀粉樣前體蛋白上不同的抗原表位，要從中篩選出特異性結(jié)合于淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域的抗體需要大量的工作，篩選效率并不高。因此，以本發(fā)明的蛋白片段作為抗原直接進(jìn)行抗體的制備，可大大地降低抗體篩選的工作量。此外，也可以基于全長或含有外顯子2的淀粉樣前體蛋白剪切形式作為抗原來制備一系列的抗體，再通過抗原-抗體結(jié)合區(qū)域分析技術(shù)來選擇可特異性作用于外顯子2區(qū)域的抗體。一種可用的分析技術(shù)例如是單抗的抗原表位掃描技術(shù)，該技術(shù)例如可參考專利申請?zhí)?00710173305.2?！┓蛛x獲得了所述蛋白片段的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白片段。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到。此外，對于較短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關(guān)序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發(fā)明還提供了所述的蛋白片段的用途，其作為淀粉樣前體蛋白的一種有效的抗原性的片段，用于制備特異性結(jié)合淀粉樣前體蛋白的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。所述的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明的蛋白片段可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)所述的蛋白片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，其可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Ha騰rling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的蛋白片段免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，以含有所述的蛋白片段的淀粉樣前體蛋白或其剪切形式作為篩選模型，篩選可特異性作用于所述的蛋白片段的物質(zhì)，例如小分子化合物。篩選方法在得知了淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域在淀粉樣前體蛋白的運輸和代謝過程中發(fā)揮了重要作用后，可基于該新發(fā)現(xiàn)來篩選特異性作用于淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域，進(jìn)而影響淀粉樣前體蛋白在細(xì)胞中的運輸和代謝的物質(zhì)。通過影響淀粉樣前體蛋白在細(xì)胞中的運輸和代謝，下調(diào)a-淀粉酶和P-淀粉酶的代謝途徑，可有效地降低細(xì)胞內(nèi)毒性蛋白(如A1342)的產(chǎn)生，有效地緩解神經(jīng)退行性疾病。因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括以含有淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域(優(yōu)選如SEQIDN0:1中第21-76位所示的氨基酸序列)的淀粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用于該靶點(如抑制、阻滯或下調(diào)該靶點上蛋白片段的活性)的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。以蛋白上特定的區(qū)域作為靶點，來篩選作用于該區(qū)域的物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域人員所熟知的，這些方法均可用于本發(fā)明。所述的候選物質(zhì)可以選自肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列等。根據(jù)待篩選的物質(zhì)的種類，本領(lǐng)域人員清楚如何選擇適用的篩選方法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法包括(l)提供一種淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域；(2)用候選物質(zhì)處理步驟(1)所述的淀粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用于所述外顯子2區(qū)域的候選物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。作為一種更優(yōu)選的方式，可通過同時測試①含有外顯子2區(qū)域的淀粉樣前體蛋白或片段、以及②不含有外顯子2區(qū)域且其它區(qū)域與①相同的淀粉樣前體蛋白或片段；來判斷出可特異性結(jié)合前者(①)而不結(jié)合于后者(②)的物質(zhì)，也即該物質(zhì)作用于淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域。在得知了該方案后，具體的實施方法對本領(lǐng)域人員而言是很容易的。在一種篩選模式下，通過模擬所述含有淀粉樣前體蛋白的外顯子2區(qū)域的淀粉樣前體蛋白或片段的三維結(jié)構(gòu)來進(jìn)行藥物篩選。目前大量蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已由X射線晶體衍射技術(shù)和多維核磁共振(NMR)等技術(shù)解析而得，為研究蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的分子識別提供了有利條件。淀粉樣前體蛋白的N端位于胞外，可通過模擬其胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)來進(jìn)行篩選。目前已經(jīng)有許多備選的篩選庫(如小分子化合物篩選庫)，使得高通量篩選成為可能。可借助計算機輔助藥物設(shè)計，通過分析藥物靶標(biāo)，即蛋白分子功能位點的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，設(shè)計出特定的化學(xué)小分子，使其分子的各部分分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與靶標(biāo)相匹配，以達(dá)到與之結(jié)合并發(fā)揮作用的目的，這些技術(shù)均是本領(lǐng)域人員所熟知的。經(jīng)過大規(guī)模的藥物篩選，可以獲得一類特異性作用于淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的潛在物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以在進(jìn)一步驗證的基礎(chǔ)上，從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)FSTL1的表達(dá)和活性真正有用的物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，還需要對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和/或動物試驗，以從這些物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對于抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質(zhì)。在細(xì)胞水平上，可通過構(gòu)建細(xì)胞模型的方式來進(jìn)行驗證試驗。相關(guān)細(xì)胞模型的構(gòu)建是本領(lǐng)域人員熟知的。例如，可通過將淀粉樣前體蛋白或片段的表達(dá)單位(如表達(dá)載體)轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，使之可穩(wěn)定地表達(dá)、運輸和代謝淀粉樣前體蛋白或片段。表達(dá)單位和宿主細(xì)胞的選擇是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)。所述的宿主細(xì)胞例如是(但不限于)HEK293。當(dāng)然，也可以以內(nèi)源表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段的細(xì)胞作為篩選的模型，所述細(xì)胞例如是(但不限于)SK-N-SH細(xì)胞。10作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法包括用所述的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域；觀察該細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白或片段與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、運輸小泡或內(nèi)吞體等細(xì)胞器的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。一種分析上述蛋白與細(xì)胞器的共定位情況的技術(shù)是免疫熒光技術(shù)，這是本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)。相應(yīng)細(xì)胞器的標(biāo)志蛋白是本領(lǐng)域人員已知的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可從細(xì)胞內(nèi)a_分泌酶代謝途徑、13_分泌酶代謝途徑來確定經(jīng)候選物質(zhì)處理后細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白或片段的代謝變化情況。優(yōu)選地，所述的方法包括用所述的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域；測定該細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段(CTF，包括C99，C83，淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)區(qū)(AICD)，AP40，AP42等)或分泌性APP(sAPP)的量，并與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理的表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段的細(xì)胞；若經(jīng)所述潛在物質(zhì)處理的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段或分泌性APP的量在統(tǒng)計學(xué)上低于對照組細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段或分泌性APP的量，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。可以采用例如蛋白質(zhì)印跡(如Western印跡)等技術(shù)來定性、定量或半定量地分析細(xì)胞內(nèi)上述各片段的含量，這是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法包括用所述的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域；測定步驟該細(xì)胞內(nèi)是否形成斑塊結(jié)構(gòu)，若形成斑塊結(jié)構(gòu)，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。本發(fā)明還包括了采用所述篩選方法獲得的可用于抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)，所述的物質(zhì)對于緩解神經(jīng)退行性相關(guān)疾病如老年性癡呆是有效的。本發(fā)明還包括了含有所述的物質(zhì)的組合物，組合物的配制對于本領(lǐng)域人員而言是易于實現(xiàn)的。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次定位了一個對于淀粉樣前體蛋白的代謝有重要作用的區(qū)域，從而為篩選抑制淀粉樣前體蛋白代謝為毒性分子的藥物提供了有效的途徑。(2)提供了一種篩選抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)的有效方法以及抑制物質(zhì)。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1.E2的缺失的APP的獲得1.cDNA文庫篩選與Southern雜交所用探針模板的制備(l)cDNA文庫篩選探針模板(Probe1)的制備(a)使用TRIZ0L試齊U，從SK-N-SH細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)中提取總RNA。(b)常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR。(c)以RT-PCR產(chǎn)物為模板，使用引物對Pl/P2(表1)進(jìn)行PCR擴增。(d)電泳，回收純化PCR擴增產(chǎn)物，克隆進(jìn)pGEM-T-easy載體，酶切，測序。(e)XhoI和SacI酶切，電泳回收純化得到的682bp片段即是Probe1。(2)Southern雜交所用探針模板(Probe2和Probe3)的制備(a)Probe2的制備以篩庫獲得的APP695cDNA為模板，使用引物P3/P4(表1)進(jìn)行PCR擴增，所得到的459bp片段即為Probe2。(b)Probe3的制備用KpnI和AccI酶切含有APP695cDNA的質(zhì)粒，電泳，回收純化得到的167bp片段即為Probe3。2.APP639cDNA的獲得本發(fā)明人用Probe1篩選人胎腦cDNA文庫(購自GIBC0公司)，經(jīng)過兩輪雜交，共獲得17個陽性克隆。利用引物P1/P6(表1)進(jìn)行PCR分析和酶切鑒定這些克隆。在17個陽性克隆中，有14個克隆含有APP基因的編碼序列，其中一個克隆對應(yīng)于APP770型，一個克隆對應(yīng)于APP751型，其余12個克隆屬于APP695型。發(fā)明人挑選了幾個對應(yīng)于APP695的克隆進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clone13除了不含有第7、8外顯子外，還缺少第2外顯子，造成第1和第3外顯子直接連接。全序列測定顯示，Clone13全長為3011bp，閱讀框內(nèi)含有1920bp，推測編碼的蛋白含639個氨基酸(SEQIDNO:1中第1-20位，第77-695位)。因此，發(fā)明人將之命名為APP639。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2.E2的缺失引起了APP代謝的下調(diào)本發(fā)明人構(gòu)建了C端帶有myc-tag的APP不同剪切形式的表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建方法如下以APP695cDNA(參見GenBank登錄號NM_201414.1)為模板，使用5'引物(5'-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG_3，(SEQIDNO:8))和3，引物(5，_GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC_3，(SEQIDNO:9))(下劃線為XbaI的位點)進(jìn)行PCR擴增。純化PCR擴增片段，使用XbaI(購自日本TAKARA公司)酶切；同時對載體myc-pcDNA3(購于美國Invitrogen公司)亦使用限制性內(nèi)切酶XbaI酶切，將經(jīng)酶切的所述PCR片段插入到酶切后的myc-pcDNA3，獲得含全長APP695(圖中簡寫為695)以及myc-tag的質(zhì)粒(APP695_myc載體)。以APP639cDNA為模板，使用5'引物(5'-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG-3'(SEQIDNO:10))禾P3'引物(5，-GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC_3，(SEQIDNO:11))(下劃線為XbaI的位點)進(jìn)行PCR擴增。純化PCR擴增片段，使用XbaI酶切；同時對載體myc-pcDNA3(購于美國Invitrogen公司)亦使用XbaI酶切，將經(jīng)酶切的所述PCR插入到酶切后的myc-pcDNA3，獲得含APP639(即缺失外顯子2的APP695，圖中簡寫為AE2)以及myc-tag的質(zhì)粒(APP639-myc載體)。含缺失第3個外顯子的APP695(圖中簡寫為AE3)以及myc-tag的質(zhì)粒構(gòu)建以APP695-myc為模板，使用5'引物(5，_TTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCG_3，(SEQIDNO:12))禾卩3，引物(5，-TTCTTGGCAATACTGCAGGATGCCTTCCTTG_3(SEQIDNO:13))進(jìn)行PCR擴增，純化PCR擴增片段，使用DpnI(購自美國NEB公司)消化多余模板，自連得到含APP654(即缺失E3的APP695，APP-AE3，簡寫為AE3)以及myc-tag的質(zhì)粒(APP654-myc載體)。將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)中，通過對APP代謝產(chǎn)物量的檢測考察APP的代謝情況，以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入空載體作為對照。利用WesternBlot檢測了APP639蛋白的表達(dá)情況。利用myc抗體(購于美國Invitrogen公司)，成功地檢測到APP639-myc融合蛋白(圖2A中2，5泳道)、APP654-myc融合蛋白(圖2A中3，6泳道)和APP695-myc融合蛋白圖2A中4，7泳道)，而在對照組沒有檢測到相應(yīng)條帶(圖2A中1泳道)。并且，結(jié)果顯示APP639-myc代謝產(chǎn)生的C99myc，C83myc和AICDmyc融合蛋白要明顯少于APP654-myc和APP695-myc。也即，全長的APP695可以產(chǎn)生較多的C端片段(CTF);缺失了E2后，CTF的水平都明顯下降，相應(yīng)的細(xì)胞培液中的AP的量也要明顯低于APP695所產(chǎn)生的(圖2B)，但缺失第三個外顯子對應(yīng)的氨基酸序列對APP的代謝沒有影響。上述結(jié)果說明，E2的缺失可以特異性地引起APP代謝的下調(diào)。實施例3.E2的缺失使得APP的a-分泌酶和|3-分泌酶代謝途徑都被下調(diào)為了進(jìn)一步研究這種特異性的下調(diào)的分子機制，本發(fā)明人詳細(xì)地考察了APP的a-，e-分泌酶代謝途徑。大多數(shù)情況下，APP在細(xì)胞中主要經(jīng)過a-分泌酶代謝途徑分解，在過表達(dá)P-分泌酶(BACE)后，主要進(jìn)行e-分泌酶代謝過程。本發(fā)明人分別在不轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染BACE的情況下考察了APP的代謝產(chǎn)物的生成情況。如實施例2的方法，構(gòu)建含myc以及APP全長、缺失外顯子2、缺失外顯子3的質(zhì)粒，分別瞬時轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，收集上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培液，沉淀其中的蛋白，利用WesternBlot的手段檢測了sAPP蛋白的產(chǎn)生情況。發(fā)現(xiàn)在a-，|3-兩個代謝途徑中，APP-AE2代謝所產(chǎn)生的CTF和sAPP都要少于APP695。APP有一種Swedish(sw)突變形式，是將BACE的剪切位點之前的KM突變?yōu)镹L，這種突變形式易于被BACE剪切，常被作為研究APP代謝的模型(FormanMS等，DifferentialeffectsoftheSwedishmutantamyloidprecursorproteinonbeta—amyloidaccumulationandsecretioninneuronsandno皿euronalcells.JBiolChem19975272(51):32247-32253)。本發(fā)明人又構(gòu)建了缺失E2的APPsw-myc突變形式，得到了與APP695類似的結(jié)果(圖3A，a-分泌酶代謝泳道2、3;P-分泌酶代謝泳道8、9)。利用W0-2抗體(購自北京大學(xué)第六醫(yī)學(xué)院)檢測到APP695-myc代謝產(chǎn)生的sAPP。沒有檢測到APP639-myc代謝產(chǎn)生的sAPP，說明APP639代謝產(chǎn)生sAPP的能力要弱于APP695，見圖3A。為了觀察APP和分泌酶在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，本發(fā)明人分別構(gòu)建了帶有EYFP-tag的APP-EYFP表達(dá)載體和帶有ECFP-tag的BACE-ECFP表達(dá)載體，構(gòu)建方法如下APP639-EYFP:將EYFP-tag片段用XbaI從pEYFP(購自美國Clontech公司)載體中切下，純化酶切后片段，插入到用XbaI酶切后的APP639-myc載體中，得到APP639-EYFP表達(dá)載體。APP695-EYFP:將EYFP-tag片段用XbaI從pEYFP載體中切下，純化酶切后片段，插入到用XbaI酶切后的APP695-myc載體中，得到APP695-EYFP表達(dá)載體。BACE-ECFP:以BACElcDNA(參見GenBank登錄號NM_012104)為模板，使用5'引物(5'-TCCTCTAGAACTAGTGGATCCATGGCCCAA-3'(SEQIDNO:14))和3，引物(5，-GAGCTCGAGCTTCAGCAGGGAGATGTCATC-3'(SEQIDNO:15))進(jìn)行PCR擴增，得至IJPCR擴增片段，使用XbaI和XhoI進(jìn)行酶切，并純化酶切后片段；同時對pECFP-Nl(購自美國Clontech公司)使用NheI和XhoI酶切純化操作，將前述PCR片段插入得到BACE-ECFP表達(dá)載體。將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染到C0S7細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)中，通過共聚焦顯微鏡分別觀察APP639-EYFP，APP695-EYFP與BACE-ECFP在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，白色顯示兩種蛋白有共定位。結(jié)果表明，APP695-EYFP與BACE-ECFP可以在細(xì)胞中共定位，APP639-EYFP(APP-AE-EYFP)與BACE-ECFP不能在細(xì)胞中共定位，見圖3B。實施例4.E2的缺失使得APP的亞細(xì)胞定位受到影響在上面的實驗中本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，APP代謝產(chǎn)物中sAPP的量都明顯減少，因此這種代謝的下調(diào)應(yīng)該是發(fā)生在APP被a-分泌酶或13-分泌酶剪切這一步。但還不能確定是由于APP與分泌酶不能結(jié)合，還是不能同時定位到相應(yīng)的細(xì)胞器上所致。因此，本發(fā)明人又考察了不同剪切形式的APP的亞細(xì)胞定位情況。APP在細(xì)胞內(nèi)的運輸包括分泌和內(nèi)吞兩個過程。在分泌過程中，APP會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上經(jīng)過氨基化和糖基化的修飾形成成熟的蛋白，因此正常情況下，APP在細(xì)胞內(nèi)會有未成熟，半成熟和成熟的三種形式。如實施例2的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用WesternBlot方法檢測了細(xì)胞內(nèi)高爾基體中APP639蛋白的成熟情況。利用myc抗體和wo-2抗體，檢測到APP654-myc和APP695-myc融合蛋白的成熟形式和未成熟形式?？梢钥吹睫D(zhuǎn)染了APP-AE3和APP695的細(xì)胞中確實有這三種形式對應(yīng)的條帶(圖4A，泳道3、4)，而轉(zhuǎn)染了APP-AE2和細(xì)胞中只有未成熟的APP對應(yīng)的條帶(圖4A，泳道2)。這說明APP-AE2并沒有定位到高爾基體上，APP639myc不能正常成熟，停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。將APP639-EYFP和APP695-EYFP分別轉(zhuǎn)染到C0S7細(xì)胞中，利用免疫熒光染色方法，使用LMANl(美國密歇根大學(xué)張斌博士提供)，GM-130(購自美國BDBioscience公司)，EEA-1(購自美國BDBioscience公司)，M6PR(購自美國SantaCruz公司)抗體分別檢測APP639-EYFP和APP695-EYFP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體，高爾基體，早期內(nèi)吞體，晚期內(nèi)吞體的共定位情況。結(jié)果顯示，APP-AE2-EYFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運輸小泡(圖4B，14LMAN1)和高爾基體(圖4B，GM130)都沒有共定位，而APP695-EYFP可以很好的共定位(圖4BLMAN1，GM130)。在內(nèi)吞過程中，APP在細(xì)胞膜上，被內(nèi)吞體帶回細(xì)胞內(nèi)，因此APP695-EYFP和內(nèi)吞體(圖4B，EEA-1、M6PR)都有很好的共定位，而APP639-EYFP和內(nèi)吞體沒有共定位(圖4B，EEA-1、M6PR)。實施例5.APP蛋白N端結(jié)構(gòu)的破壞引起APP的代謝和定位異常在研究APP定位情況時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)APP-AE2-EYFP在細(xì)胞內(nèi)會形成聚集的斑塊結(jié)構(gòu)，而一些錯誤折疊的蛋白往往會形成這樣的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人分析了E2序列的特征，發(fā)現(xiàn)其中有三個Cys殘基(aa38、aa62、aa73)，會形成二硫鍵，而二硫鍵對于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用，本發(fā)明人采用常規(guī)的方法把這些Cys殘基分別突變?yōu)镚ly，破壞了這些二硫鍵，考察了這些突變的APP的代謝和定位情況。分別用WesternBlot和免疫熒光染色的方法，考察上述定點突變后的APP695-myc和APP695-EYFP融合蛋白的代謝和定位情況。WesternBlot結(jié)果顯示這些結(jié)構(gòu)被破壞的APP695與APP639代謝情況一致，產(chǎn)生的CTF都少于未突變的APP695(wt)(圖5A，a-分泌酶代謝泳道4-6，P-分泌酶代謝泳道10_12)。免疫染色結(jié)果也顯示，APP695蛋白外顯子2中三個半胱氨酸點突變的APP695iyc和APP695-EYFP融合蛋白與APP639融合蛋白一樣，不能正常代謝，在細(xì)胞內(nèi)聚集成團，形成聚集的斑塊結(jié)構(gòu)(圖5B)。實施例6.APP-AE2形成的特殊結(jié)構(gòu)不是聚集體當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的錯誤折疊蛋白時，一般的降解機制不能完全降解這些蛋白，就會形成聚集體(Aggresome)的結(jié)構(gòu)，在這種情況下，錯誤折疊的蛋白被纖維蛋白帶到微管集合中心周圍，形成富含泛素的包被著纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)不能溶于溫和的去垢劑。因此，可以通過考察APP-AE2是否與泛素和纖維蛋白有共定位，以及是否溶于溫和去垢劑來確定這種特殊的結(jié)構(gòu)是否是聚集體。參照實施例4的細(xì)胞亞定位方法，利用免疫熒光染色的方法，分別使用抗波形蛋白(Vimentin)、Y-微管蛋白(Y-tubulin)和泛素(Ubiquitin)抗體(均購自美國SantaCruz公司)作為聚集體的標(biāo)志蛋白，考察APP639-EYFP和APP695-EYFP蛋白是否與它們有共定位。結(jié)果表明，APP639-EYFP與APP695-EYFP與這些標(biāo)志蛋白都沒有共定位，APP639沒有形成聚集體，如圖6A。參照實施例2的相關(guān)方法，利用WesternBlot的手段檢測了APP639蛋白在去垢劑(NP40)不溶組分(i)中的分布情況。利用抗myc抗體和抗wo-2抗體，檢測到APP639-myc和APP695-myc融合蛋白均在去垢劑(NP40)可溶性組分(s)中分布較多，在去垢劑不溶性組分中分布較少，見圖6B。而APP639-myc融合蛋白只檢測到未成熟形式。結(jié)果表明APP639沒有形成聚集體。實施例7.小分子化合物的藥物篩選采用X射線晶體衍射技術(shù)，根據(jù)APP695蛋白的胞外區(qū)(N端含有SEQIDN0:1中第28-123位)氨基酸序列設(shè)計模擬的蛋白三維結(jié)構(gòu)，采用高通量虛擬篩選技術(shù)，以SPECS化合物數(shù)據(jù)庫中的化合物為候選物質(zhì)。將初步篩選與APP外顯子2區(qū)域有特異性結(jié)合作用的化合物進(jìn)行歸類，結(jié)果獲得了一些經(jīng)初篩認(rèn)為潛在有效的候選化合物。實施例8.抗體制備常規(guī)方法重組表達(dá)和純化獲得蛋白，所述的蛋白序列如SEQIDNO:l中第21-76位所示，將該蛋白作為抗原進(jìn)行動物免疫。免疫動物為新西蘭白兔，雄性，體重為2-2.5kg。免疫流程將抗原與Freund's佐劑l:l混合，乳化后，皮下和皮內(nèi)多點注射進(jìn)行免疫?？乖膭┝繛?.9mg/次/兔。首次免疫用完全Freund's佐劑，再次免疫用不完全Freund's佐劑。免疫的間隔時間為3周。第三次免疫后1周，兔放血，收集抗血清，獲得抗APP蛋白E2區(qū)域的免疫多抗。利用APP蛋白作為抗原，與前述獲得的多抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述的多抗可以特異性結(jié)合APP蛋白的E2區(qū)域，且不結(jié)合于雜蛋白以及APP蛋白上其它區(qū)域。將上述制備的抗體加入到如實施例2的方法制備的表達(dá)APP695的293T細(xì)胞中，通過對APP代謝產(chǎn)物量的檢測考察APP的代謝情況，并與不用抗體處理的表達(dá)APP695的細(xì)胞、轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)入APP639表達(dá)載體的細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于抗體的特異性封閉作用，經(jīng)抗體處理后的細(xì)胞APP的代謝情況顯著低于未經(jīng)抗體處理的情況，而是與轉(zhuǎn)入APP639表達(dá)載體的細(xì)胞相當(dāng)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表〈110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院〈120〉淀粉樣前體蛋白N端結(jié)構(gòu)在其運輸和代謝過程中的作用〈130>086125〈160>15〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>695〈212>PRT〈213〉智人(HomoSapiens)〈400>1MetLeuProGlyLeuAlaLeuLeuLeuLeuAlaAlaTrpThrAlaArg151015AlaLeuGluValProThrAspGlyAsnAlaGlyLeuLeuAlaGluPro202530GinlieAlaMetPheCysGlyArgLeuAsnMetHisMetAsnValGin354045AsnGlyLysTrpAspSerAspProSerGlyThrLysThrCyslieAsp505560ThrLysGluGlylieLeuGinTyrCysGinGluValTyrProGluLeu65707580160172]GinlieThrAsnValValGluAlaAsnGinProValThrlieGinAsn0173]8590950174]TrpCysLysArgGlyArgLysGinCysLysThrHisProHisPheVal0175]1001051100176]lieProTyrArgCysLeuValGlyGluPheValSerAspAlaLeuLeu0177]1151201250178]ValProAspLysCysLysPheLeuHisGinGluArgMetAspValCys0179]1301351400180]GluThrHisLeuHisTrpHisThrMaiAlaLysGluThrCysSerGlu0181]1451501551600182]LysSerThrAsnLeuHisAspTyrGlyMetLeuLeuProCysGlylie0183]1651701750184]AspLysPheArgGlyValGluPheValCysCysProLeuAlaGluGlu0185]1801851900186]SerAspAsnValAspSerAlaAspAlaGluGluAspAspSerAspVal0187]1952002050188]TrpTrpGlyGlyAlaAspThrAspTyrAlaAspGlySerGluAspLys0189]2102152200190]ValValGluValAlaGluGluGluGluValAlaGluValGluGluGlu0191]2252302352400192]GluAlaAspAspAspGluAspAspGluAspGlyAspGluValGluGlu0193]2452502550194]GluAlaGluGluProTyrGluGluAlaThrGluArgThrThrSerlie0195]2602652700196]AlaThrThrThrThrThrThrThrGluSerValGluGluValValArg0197]2752802850198]ValProThrThrAlaAlaSerThrProAspAlaValAspLysTyrLeu0199]2902953000200]GluThrProGlyAspGluAsnGluHisAlaHisPheGinLysAlaLys0201]3053103153200202]GluArgLeuGluAlaLysHisArgGluArgMetSerGinValMetArg0203]3253303350204]GluTrpGluGluAlaGluArgGinAlaLysAsnLeuProLysAlaAsp0205]3403453500206]LysLysAlaVallieGinHisPheGinGluLysValGluSerLeuGlu0207]3553603650208]GinGluAlaAlaAsnGluArgGinGinLeuValGluThrHisMetAla0209]3703753800210]ArgValGluAlaMetLeuAsnAspArgArgArgLeuAlaLeuGluAsn385390395400TyrlieThrAlaLeuGinAlaValProProArgProArgHisValPhe405410415AsnMetLeuLysLysTyrValArgAlaGluGinLysAspArgGinHis420425430ThrLeuLysHisPheGluHisValArgMetValAspProLysLysAla435440445AlaGinlieArgSerGinValMetThrHisLeuArgVallieTyrGlu450455460ArgMetAsnGinSerLeuSerLeuLeuTyrAsnValProAlaValAla465470475■GluGlulieGinAspGluValAspGluLeuLeuGinLysGluGinAsn485490495TyrSerAspAspValLeuAlaAsnMetlieSerGluProArglieSer500505510TyrGlyAsnAspAlaLeuMetProSerLeuThrGluThrLysThrThr515520525ValGluLeuLeuProValAsnGlyGluPheSerLeuAspAspLeuGin530535540ProTrpHisSerPheGlyAlaAspSerValProAlaAsnThrGluAsn545550555560GluValGluProValAspAlaArgProAlaAlaAspArgGlyLeuThr565570575ThrArgProGlySerGlyLeuThrAsnlieLysThrGluGlulieSer580585590GluValLysMetAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluVal595600605HisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLys610615620GlyAlalielieGlyLeuMetValGlyGlyValVallieAlaThrVal625630635640lieVallieThrLeuValMetLeuLysLysLysGinTyrThrSerlie645650655HisHisGlyValValGluValAspAlaAlaValThrProGluGluArg660665670HisLeuSerLysMetGinGinAsnGlyTyrGluAsnProThrTyrLys675680685PhePheGluGinMetGinAsn690695<210〉2〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223〉引物〈400>2gaagaggctgaggaaccctaeg〈210〉3<211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列<221〉misc_feature〈223〉引物〈400〉3tccattcacgggaaggagctcc〈210〉4〈211〉20<212〉DNA〈213>人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400〉4gtttggcactgctcctgctg〈210>5〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物<400〉5tctctttggcgacggtgtgc〈210〉6〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223〉引物〈400>6caccatcctcatcgtcctcg20〈210>7〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>7tgagcatggcttccactctggc22〈210>8〈211>25〈212>DNA<213>人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>8ttttctagagatgctgcccggtttg25〈210>9〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>9gagtctagactagttctgcatctgc25<210>10〈211>25〈212>DNA〈213>人工序列<221>misc_feature〈223〉引物〈400〉10ttttctagagatgctgcccggtttg25〈210>11〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc—feature〈223〉引物20〈400>11gagtctegactagttctgcatctgc25<210>12〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc一feature〈223〉引物〈400>12ttggtgagtttgtaagtgatgcccttctcg30〈210>13〈211>31〈212>DNA<213>人工序列〈22l>misc—feature〈223〉引物〈400〉13ttcttggcaatactgcaggatgccttccttg31〈210>14〈211>30<212>DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature〈223>引物〈400>14tcctctagaactagtggatccatggcccaa30〈210>15〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature<223>引物〈400>15gagctcgagcttcagcagggagatgtcatc302權(quán)利要求一種分離的淀粉樣前體蛋白片段，所述蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO1中第21-76位所示。2.權(quán)利要求1所述的蛋白片段的用途，用于制備或篩選特異性作用于該蛋白片段的物質(zhì)。3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的物質(zhì)選自肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列。4.一種篩選抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括以含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的氨基酸序列的淀粉樣前體蛋白或片段作為篩選的靶點，選出特異性作用于該靶點的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)提供一種淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:l中第21-76位所示的氨基酸序列；(2)用候選物質(zhì)處理步驟(1)所述的淀粉樣前體蛋白片段；(3)選擇出特異性作用于所述的蛋白或片段中SEQIDNO:l中第21-76位所示的氨基酸序列位點的候選物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)提供一種淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的氨基酸序列；(la)提供一種對照蛋白片段，所述的對照蛋白片段不含有SEQIDN0:l中第21-76位所示的氨基酸序列，其它氨基酸序列與(1)的淀粉樣前體蛋白或片段相同；(2)分別用候選物質(zhì)處理步驟(1)和(la)所述的蛋白或片段；(3)選擇出作用于步驟(1)的淀粉樣前體蛋白或片段，且不作用于步驟(la)的對照蛋白片段的物質(zhì)，所述的物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的潛在物質(zhì)。7.如權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對于抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝有用的物質(zhì)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括(4)用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5)觀察步驟(4)的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白或片段與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、運輸小泡或內(nèi)吞體的共定位情況，若基本上不存在共定位，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括(4')用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDN0:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5')測定步驟(4')的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段的量，并與對照組比較；其中所述的對照組是不用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理的表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段的細(xì)胞；若經(jīng)所述潛在物質(zhì)處理的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段的量在統(tǒng)計學(xué)上低于對照組細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白C端片段的量，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括(4")用步驟(3)獲得的潛在物質(zhì)處理細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)淀粉樣前體蛋白或片段，所述的蛋白或片段含有SEQIDNO:1中第21-76位所示的氨基酸序列；(5")測定步驟(4")的細(xì)胞內(nèi)是否形成斑塊結(jié)構(gòu)，若形成斑塊結(jié)構(gòu)，則所述的潛在物質(zhì)是抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。11.一種通過權(quán)利要求4-10任一所述的方法獲得的抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝的物質(zhì)。12.—種抗淀粉樣前體蛋白的抗體，所述的抗體特異性地結(jié)合權(quán)利要求1所述的蛋白片段。全文摘要本發(fā)明涉及淀粉樣前體蛋白N端結(jié)構(gòu)在其運輸和代謝過程中的作用。本發(fā)明公開了一種分離自淀粉樣前體蛋白的蛋白片段，其可用于制備或篩選特異性作用于該蛋白片段的物質(zhì)。本發(fā)明還公開了一種篩選抑制淀粉樣前體蛋白的運輸或代謝進(jìn)而抑制神經(jīng)退行性疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括以淀粉樣前體蛋白外顯子2區(qū)域作為篩選的靶點，選出特異性作用于該靶點的物質(zhì)。本發(fā)明為神經(jīng)退行性疾病防治藥物的篩選提供了新途徑。文檔編號C07K16/18GK101724057SQ200810201708公開日2010年6月9日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者景乃禾,沈承勇,陳永峰申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院