專利名稱：檢測殺蟲晶體蛋白Bt Cry1Ab/Ac的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測殺蟲晶體蛋白Bt CrylAb/Ac的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)殺蟲晶體蛋白基因抗蟲基因在棉花和玉米等作物上得到了很成功的應用。根據(jù)編碼基因序列的同源性和編碼蛋白的殺蟲譜，Bt殺蟲晶體蛋白劃分為cry族和cryt族，每一類下又分為數(shù)量不等的亞類。目前在植物中表達的 Bt 基因有 Bt cry IAa, cry IAb, crylAc, cry2Aa, cry3Bb, cry9c0 Bt Cry I Ab/ Ac蛋白具有非常高的相似度，目前市場上商業(yè)化的作物中的轉(zhuǎn)BtCrylAc蛋白基因已包含 Bt CrylAb蛋白基因。Bt免疫檢測試劑盒已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、玉米種子質(zhì)量檢測、真?zhèn)舞b定， 食品中轉(zhuǎn)基因成分分析及生物安全性的研究。Bt CrylAb/Ac試劑盒的好壞完全取決于所制備抗體的好壞。國內(nèi)外文獻報道中的CrylA抗體，均通過蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵、提取、純化得到的蛋白作為抗原免疫動物制備的。由于Bt CrylAb/Ac蛋白在植物和動物中的翻譯后修飾不同，往往導致利用菌株表達的蛋白對植物中的Bt CrylAb/Ac識別率和親和力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測殺蟲晶體蛋白Bt CrylAb/Ac的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒，該方法及其專用試劑盒所使用的抗Bt CrylAb/Ac的單克隆抗體是由雜交瘤細胞株Bt2F9分泌產(chǎn)生的，該雜交瘤細胞株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5162。上述雜交瘤細胞株Bt2F9CGMCC No. 5162分泌產(chǎn)生的抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體，也是本發(fā)明保護的范圍。上述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體可用于檢測或輔助檢測Bt CrylAb/Ac蛋白，尤其適合于檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因植物中的Bt CrylAb/Ac蛋白。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞株Bt2F9或抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的單克隆抗體可用于制備檢測或輔助檢測Bt CrylAb/Ac蛋白的試劑或試劑盒，特別是用于制備檢測或輔助檢測轉(zhuǎn)基因植物中Bt Cry lAb/Ac蛋白的試劑或試劑盒。本發(fā)明所提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測或輔助檢測Bt Cry lAb/Ac蛋白，所述試劑盒中含有獨立包裝的所述單克隆抗體。在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨立包裝的抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗體和/或獨立包裝的Bt CrylAb/Ac蛋白標準品和/或獨立包裝的用于標記所述單克隆抗體的標記酶；所述抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗體是以Bt Cry lAb/Ac蛋白為免疫原免疫脊
3椎動物得到的；所述Bt CrylAb/Ac蛋白標準品可為Bt CrylAb/Ac蛋白或由所述BtCrylAb/ Ac蛋白配制成的一系列不同濃度的Bt Cry lAb/Ac蛋白溶液；所述一系列不同濃度的Bt Cry lAb/Ac 蛋白溶液的濃度具體可為50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/ mL、l. 56ng/mL和0. 78ng/mL,所述Bt Cry lAb/Ac蛋白溶液的溶劑具體可為PBS緩沖液；所述PBS緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2P04和NaCl，pH值為7. 5 ;溶質(zhì)Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述PBS緩沖液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M。在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨立包裝的包被緩沖液和/或獨立包裝的洗滌液和/或獨立包裝的底物緩沖液和/或獨立包裝的終止緩沖液和/或獨立包裝的封閉液；所述包被緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2CO3和NaHCO3 ;溶質(zhì)Na2CO3和NaHCO3在所述包被緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 04M ;所述包被緩沖液的pH值為9. 6 ;所述洗滌液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4, NaCl和吐溫-20 ;溶質(zhì)Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M，所述吐溫-20在所述洗滌液中的體積百分含量為O. 1% ;所述洗滌液的pH值為7. 5 ;所述底物緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4 ;溶質(zhì)檸檬酸三鈉和 Na2HPO4在所述底物緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 03M ;所述底物緩沖液的pH值為
5.5 ；所述終止緩沖液為2M的硫酸水溶液；所述封閉液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4, NaCl和脫脂牛奶；溶質(zhì)Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在所述封閉液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;所述脫脂牛奶在所述封閉液中的質(zhì)量百分含量為3% ;所述封閉液的pH值為7. 5 ；所述標記酶具體可為辣根過氧化物酶。本發(fā)明所提供的方法為一種鑒別或輔助鑒別轉(zhuǎn)Bt CrylAb/Ac基因植物的方法，包括如下步驟用本發(fā)明所提供的上述試劑盒對待測植物進行檢測，以與所述待測植物同種的非轉(zhuǎn)基因植物為對照，若所述待測植物的吸光值大于所述對照的3倍，則所述待測植物為或候選為轉(zhuǎn)Bt CrylAb/Ac基因植物，若所述待測植物的吸光值小于或等于所述對照的3 倍，則所述待測植物為或候選為非轉(zhuǎn)Bt Cry lAb/Ac基因植物；所述待測植物在進行所述檢測前，還經(jīng)過包括如下步驟的處理將所述待測植物的葉片研磨，用所述PBS緩沖液于4°C提取12小時，8000r/min 4°C離心取上清，獲得所述待測植物的提取液。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于定量檢測Bt Cry lAb/Ac蛋白，尤其適合于定量檢測轉(zhuǎn)基因植物中的Bt CrylAb/Ac蛋白。本發(fā)明所提供的抗Bt CrylAb/Ac的單克隆抗體是同時以Bt CrylAc蛋白溶液和轉(zhuǎn)Bt CrylAc基因棉花植株葉片的提取液為包被抗原，通過間接非競爭ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選得到的、對在植物中表達的Bt Cry lAb/Ac蛋白具有高親和力的抗體，親和常數(shù)為Losxio9M-1 ;利用該單克隆抗體制備得到的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，用于定性或定量檢測棉花、玉米等轉(zhuǎn)基因植物中的Bt Cry lAb/Ac蛋白，線性檢測范圍在O. 78 50ng/ mL,具有快速、靈敏的優(yōu)點。


圖I為酶聯(lián)免疫試劑盒檢測Bt Cry lAb/Ac蛋白濃度的標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。棉花品種SGK321 :棉花品種石遠321導入外源BT+CPTI雙價抗蟲基因，河北神農(nóng)高科技股份有限公司。棉花品種石遠321 :河北神農(nóng)高科技股份有限公司。弗氏完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號為F5881。弗氏不完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號為F5506。Bt CrylAc蛋白上海佑隆生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄編號為C010301。Bt CrylAc蛋白溶液將Bt CrylAc蛋白溶于包被緩沖液后得到的溶液。Bt CrylAc蛋白標準品溶液將Bt CrylAc蛋白溶于PBS緩沖液后得到的溶液。包被緩沖液溶劑為水，溶質(zhì)為Na2COdPNaHCO3, pH值為9. 6 ;溶質(zhì)Na2COjP NaHCO3 在包被緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 04M。洗滌液溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HPO4' KH2PO4' NaCl和吐溫-20，pH值為7. 5 ;溶質(zhì) Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在洗滌液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;吐溫-20在洗滌液中的體積百分含量為O. 1%。底物緩沖液溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4, pH值為5. 5 ;溶質(zhì)檸檬酸三鈉和Na2HPO4在底物緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 03M。終止緩沖液濃度為2M的硫酸水溶液。封閉液溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4, NaCl和脫脂牛奶，pH值為7. 5 ;溶質(zhì) Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在封閉液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M，脫脂牛奶在封
閉液中的質(zhì)量百分含量為3%。PBS緩沖液溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HPO4、KH2PO4和NaCl，pH值為7. 5 ;溶質(zhì)Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在PBS緩沖液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M。實施例I、雜交瘤細胞株的獲得及抗Bt CrylAb/Ac蛋白單克隆抗體的制備Balb/C小白鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。SP2/0骨髓瘤細胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。一、動物免疫I、以8-10周齡的Bal b/C小白鼠作為實驗動物。2、基礎免疫將lmg/mL的Bt CrylAc蛋白溶液經(jīng)無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點注射Bal b/C小白鼠，注射劑量為每只小鼠注射O. Img BtCrylAc蛋白。3、加強免疫基礎免疫2周后，取ImL lmg/mL的Bt CrylAc蛋白溶液，加入ImL弗氏不完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散。將乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點注射Bal b/C小鼠，注射劑量為每只小鼠注射O. ImgBt CrylAc蛋白。二、細胞融合和克隆化
加強免疫每隔10天一次，從第三次加強免疫開始，每次免疫后第7天，從小鼠眼眶采血，測定抗體效價，效價的定義為OD值為I時的血清稀釋倍數(shù)。待效價大于I : 8000 后，選擇血清效價最佳的小鼠(效價為I : 80000)，取脾細胞，按9 1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合；采用有限稀釋法篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用間接非競爭ELISA的方法分別以Bt CrylAc蛋白溶液和轉(zhuǎn)Bt CrylAc基因棉花植株葉片的提取液為包被抗原同時篩選分泌抗體效價高的單克隆細胞株，選擇既能識別Bt CrylAc蛋白溶液中的Bt CrylAc蛋白，又能識別轉(zhuǎn)Bt CrylAc基因棉花植株葉片提取液中的Bt CrylAc 蛋白的單克隆抗體，最后篩選得到穩(wěn)定分泌抗轉(zhuǎn)基因植物中BtCrylAb/Ac蛋白抗體的單克隆雜交瘤細胞株，命名為Bt2F9，該雜交瘤細胞株已于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3 號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5162。上述間接非競爭ELISA方法的步驟具體如下I)包被在96孔酶標板中加入100 μ L 50ng/mL的Bt CrylAc蛋白溶液，以轉(zhuǎn)Bt CrylAc基因的棉花SGK321的葉片提取液為對照，37°C包被3小時，用PBS緩沖液洗滌4次。葉片提取液的制備方法將葉片于研缽中研磨，用PBS緩沖液于4°C提取12小時， 8000r/min 4°C離心取上清，得到提取液，提取液中的Bt CrylAc抗原濃度為50ng/ml。2)封閉封閉液150 μ L/孔，在37°C濕盒中封閉lh，棄封閉液，洗滌3次。3)加抗體將不同稀釋倍數(shù)的增量培養(yǎng)法得到的單抗加至酶標板中，置濕盒中 37°C條件下30min,洗板4次。4)加酶標二抗將羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP (購自Jackson公司，商品目錄號為 79556) (O. lmg/mL)稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。5)顯色取20mg鄰苯二胺(OPD)溶于IOmL底物稀釋液中，加4μ L 30% H2O2，將底物溶液加入酶標板中，每孔100 μ L。避光顯色5min。6)終止每孔加入50 μ L終止液，用酶標儀492nm處測定各孔的OD值，部分結(jié)果見表I。表I中，Al、A2、……和F4分別代表篩選過程中加入的細胞培養(yǎng)板不同孔中的雜交瘤細胞，識別率(％ )=(以轉(zhuǎn)Bt CrylAc基因的棉花SGK321的葉片提取液為包被抗原的OD值/以50ng/mL的Bt CrylAc蛋白溶液為包被抗原的OD值)X 100%。表I.間接非競爭ELISA法篩選雜交瘤細胞的結(jié)果
權(quán)利要求
1.雜交瘤細胞株Bt2F9，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為 CGMCC No. 5162。
2.抗BtCrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體,其特征在于所述單克隆抗體是由權(quán)利要求I 所述的雜交瘤細胞株Bt2F9分泌產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測或輔助檢測BtCry lAb/Ac蛋白中的應用。
4.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細胞株Bt2F9或權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測或輔助檢測Bt Cry lAb/Ac蛋白的試劑或試劑盒中的應用。
5.—種檢測或輔助檢測Bt Cry lAb/Ac蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有獨立包裝的權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還含有獨立包裝的抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗體和/或獨立包裝的Bt Cry lAb/Ac蛋白標準品和/或獨立包裝的用于標記權(quán)利要求2所述單克隆抗體的標記酶；所述抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗體是以Bt Cry lAb/Ac蛋白為免疫原免疫脊椎動物得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還含有獨立包裝的包被緩沖液和/或獨立包裝的洗滌液和/或獨立包裝的底物緩沖液和/或獨立包裝的終止緩沖液和/或獨立包裝的封閉液；所述包被緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2CO3和NaHCO3 ;溶質(zhì)Na2CO3和NaHCO3在所述包被緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 04M ；所述洗滌液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐溫-20 ;溶質(zhì)Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M，所述吐溫-20在所述洗滌液中的體積百分含量為O. 1% ;所述底物緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4 ;溶質(zhì)檸檬酸三鈉和Na2HPO4 在所述底物緩沖液中的濃度分別為O. OlM和O. 03M ；所述終止緩沖液為2M的硫酸水溶液；所述封閉液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2P04、NaCl和脫脂牛奶；溶質(zhì)Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述封閉液中的濃度分別為O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;所述脫脂牛奶在所述封閉液中的質(zhì)量百分含量為3% ；所述標記酶為辣根過氧化物酶。
8.一種鑒別或輔助鑒別轉(zhuǎn)Bt Cry lAb/Ac基因植物的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求5-7中任一所述試劑盒對待測植物進行檢測，以與所述待測植物同種的非轉(zhuǎn)基因植物為對照，若所述待測植物的吸光值大于所述對照的3倍，則所述待測植物為或候選為轉(zhuǎn)Bt Cry lAb/Ac基因植物，若所述待測植物的吸光值小于或等于所述對照的3倍，則所述待測植物為或候選為非轉(zhuǎn)Bt Cry lAb/Ac基因植物。
9.權(quán)利要求5-7中任一所述試劑盒在定量檢測BtCry lAb/Ac蛋白含量中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測殺蟲晶體蛋白Bt Cry1Ab/Ac的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該方法及試劑盒所使用的抗Bt Cry1Ab/Ac的單克隆抗體是由雜交瘤細胞株Bt2F9分泌產(chǎn)生的，該雜交瘤細胞株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.5162。本發(fā)明所提供單克隆抗體是同時以Bt Cry1Ac蛋白溶液和轉(zhuǎn)Bt Cry1Ac基因棉花植株葉片的提取液為包被抗原，通過間接非競爭ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選得到的、對在植物中表達的Bt Cry1Ab/Ac蛋白具有高親和力的抗體，親和常數(shù)為1.03×109M-1；利用該單克隆抗體制備得到的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，用于定性或定量檢測棉花、玉米等轉(zhuǎn)基因植物中的Bt Cry1Ab/Ac蛋白，線性檢測范圍在0.78～50ng/mL，具有快速、靈敏的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102590527SQ201210012498
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者何麗珊, 南鐵貴, 孫碩, 張亮, 曹振, 李召虎, 王保民, 譚桂玉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學