專利名稱：一種提高Bt殺蟲蛋白在漢遜酵母中表達量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及使用一個復合增強子以實現(xiàn)Bt融合蛋白基因在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式高效表達的方法，其中包括1)使用一個復合增強子以提高密碼子優(yōu)化后的Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中的產(chǎn)量；幻采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調(diào)控Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型的方式表達；3)優(yōu)化后的漢遜酵母發(fā)酵培養(yǎng)生長條件；4)利用納濾及鎳柱親和層析快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法制備的Bt重組融合蛋白可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Bt是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)的簡稱，屬革蘭氏陽性上壤芽胞桿菌。該細菌產(chǎn)生的Bt殺蟲毒蛋白能夠破壞昆蟲腸道內(nèi)的細胞滲透壓，造成消化紊亂， 最終導致昆蟲死亡。Bt基因是第一代抗蟲基因的典型代表，它表達的蛋白統(tǒng)稱為Cry晶體蛋白。根據(jù)殺蟲譜及氨基酸序列同源性的不同，Bt基因被分為不同的類型，其中CrylAb和 CrylAc對鱗翅目害蟲具有專一性毒性，而其它的Bt基因則對雙翅目或鞘翅目等害蟲具有專一毒性。Bt基因通過生物技術(shù)手段轉(zhuǎn)入作物后，能夠表達具有殺蟲活性的毒蛋白并使植物具備抗蟲性。目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)Bt基因的作物有棉花、水稻、玉米、小麥和油菜等。雖然現(xiàn)在市場上有許多可用于Bt轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)測定的試劑盒，但不同的廠商可能采用不同的工藝表達、分離純化原料，以及不同的方法確定參考物質(zhì)的量值，而蛋白質(zhì)檢測標準物質(zhì)和量值溯源傳遞體系的嚴重缺乏使得不同試劑盒內(nèi)所帶參考物質(zhì)不能溯源到上一級的計量標準，也就無法保證不同試劑盒所帶參考物質(zhì)量值的準確性與可溯源性，造成測定結(jié)果不準確和缺乏可比性，對生物安全監(jiān)管帶來隱患，由此產(chǎn)生一系列法律、貿(mào)易等經(jīng)濟和社會問題。因此，在我國范圍內(nèi)，盡快研制Bt蛋白標準物質(zhì)，建立起靈敏準確的定量測定方法及Bt轉(zhuǎn)基因植物蛋白量值溯源傳遞體系，對于今后保證測定結(jié)果的溯源性、準確性和可比性，顯得十分迫切且意義重大。近幾年來，隨著人們對漢遜酵母(Hansenula polymorpha)生物學特性的深入研究，發(fā)現(xiàn)其作為外源基因表達宿主的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。漢遜酵母也是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，與畢赤酵母類似。漢遜酵母中甲醇代謝的主要途徑有兩種(Lodeboer A.M.，et al. , 1985) 一種是在過氧化物酶體中進行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase, M0X)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再經(jīng)甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase, FMD)作用下生成C02，H2O2在過氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下生成 H2O和& ；甲醇的另一個代謝途徑發(fā)生在過氧化物酶體外，甲醇在細胞質(zhì)中經(jīng)過一系列酶的催化作用最后轉(zhuǎn)變?yōu)樘穷?，其中二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DHAS)是這一過程的關(guān)鍵酶。甲醇代謝過程中的各種關(guān)鍵酶，包括Μ0Χ、DHAS和CAT等的表達都是在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)解的，它們受甲醇、甘油和山梨醇的誘導，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但當葡萄糖濃度低于0. 時，陽遏作用即被解除。在甲醇完全誘導條件下，過氧化物酶體可占細胞總體積的80%，M0X和DHAS可占細胞總蛋白的15%，它們的啟動子具有極強的啟動下游基因表達的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表達的常用啟動子。誘導型啟動子以其強啟動功能和嚴緊的調(diào)控機制被廣泛的應用于外源基因的表達，已有很多外源蛋白在這些啟動子的調(diào)控下在漢遜酵母細胞中得到高效的表達。目前用于漢遜酵母外源蛋白表達系統(tǒng)的誘導型啟動子都需要在一定劑量甲醇存在的條件下才能發(fā)揮作用，但由于甲醇是有毒物質(zhì)，且易燃易爆，這樣就限制了該系統(tǒng)在醫(yī)藥或食品等領(lǐng)域的應用。因此，各種組成型啟動子就應運而生，已經(jīng)成功應用于漢遜酵母外源蛋白表達系統(tǒng)的組成型啟動子有質(zhì)膜AIPase 啟動子(pPMAl)和翻譯延伸因子Ia啟動子(TEFl)等，這些組成型啟動子的應用不僅無需在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甲醇，而且也簡化了發(fā)酵工藝和降低了成本等。漢遜酵母作為外源蛋白表達宿主多采用營養(yǎng)缺陷型菌株來進行重組子的初步篩選，目前已得到多種營養(yǎng)缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(Seon AhCheon, et al.，2009)。同時，由于漢遜酵母對氨基糖苷類抗生素敏感，G418、 Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被廣泛地用作篩選標記。以漢遜酵母作為外源基因的表達宿主時，外源DNA整合到酵母基因組中主要可分為隨機整合和同源重組，其中同源重組需要導入的DNA中必須含有漢遜酵母的同源序列。 同源序列與酵母基因組中某段DNA序列完全或部分一致，從而導致外源DNA在此位置可通過同源交換整合到酵母基因組中。漢遜酵母轉(zhuǎn)化常用的同源序列包括各種強啟動子和 rDNA(Klabunde J. , et al. ,2003)序列，而本發(fā)明首次采用了漢遜酵母質(zhì)膜AIPase基因作為同源整合序列。真菌質(zhì)膜AIPase是上世紀70年代未首次在粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中被發(fā)現(xiàn)的，隨后分別從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中得到提純。質(zhì)膜 ATPase是酵母質(zhì)膜中含量最多的蛋白，占總質(zhì)膜蛋白的15%，占總細胞蛋白的0. 3%，它的主要作用是作為一個跨膜的質(zhì)子泵，維持細胞內(nèi)的PH值和電化學梯度，從而使多種營養(yǎng)物質(zhì)得以運輸。漢遜酵母質(zhì)膜AIPase (Helen Cox, 2000)基因全長^97bp，編碼898個氨基酸。本發(fā)明中首次將其插入到漢遜酵母表達載體中作為外源基因整合的同源序列。作為外源基因的表達宿主，漢遜酵母具有許多優(yōu)點1)漢遜酵母的最適生長溫度在37 43°C，菌體生長速度快，發(fā)酵時間短；2)以rDNA作為整合的同源序列，可以獲得高拷貝的轉(zhuǎn)化子，有可能極大地提高外源重組蛋白的表達量；幻多個外源基因能夠通過一步法同時被整合到酵母基因組中，并按照一定劑量關(guān)系同時或分別表達。上述優(yōu)點使?jié)h遜酵母表達系統(tǒng)迅速發(fā)展成為最具魅力的真核表達系統(tǒng)之一，目前，已經(jīng)有多種外源蛋白基因在漢遜酵母中獲得了表達，見表1 表1在漢遜酵母中表達的部分外源蛋白外源蛋白來源表達呈文獻Glucose oxidase (GOD)Aspergillus neger500mg/L (MOX 啟動子) 1 85mg/L (PMA1 啟動子)I Ielen Cox,2000Human serum albumin (rHA)Human280mg/L (MOX 啟動子) 460mg/L (PMA1 啟動子)uricaseCandida utilis2.4g/LZhiyu Chen,e/ c /.,2008BFSHa/ScCnel 融合蛋內(nèi)’牛4.7mg/LWeidong Qian,( i αι., 2009BFSHp/ScCnel融合蛋白牛6.2mg/'Lα-醇腈酶2.015U/ml張冬冬7，2009人血潔閂蛋閂人1.033g/L, ； 凡2006乙肝表面抗原乙肝病毐0.4g/LGellissen G,et ai 1996* =BFSHa 為 Bovine follicle-stimulation homone α M S, ScCnel 為 Sacchromyces cerevisiae calnexin在本發(fā)明之前，還沒有采用密碼子優(yōu)化后的Bt基因在漢遜酵母中以組成型方式表達該蛋白的的報道，也沒有人使用一個復合增強子序列以大大提高Bt在漢遜酵母細胞中的表達量。本發(fā)明首次按照酵母所偏愛的密碼子，人工合成了一個完整的Bt融合蛋白基因及一個復合增強子序列，并利用克隆的畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAPDH) 以及漢遜酵母菌株A16的質(zhì)膜AIPase基因，構(gòu)建了一個全新的、組成型的和分泌型的漢遜酵母高效表達載體，在將該外源基因?qū)霛h遜酵母細胞后，通過抗性篩選、活性檢測等方法，獲得了能夠高效表達Bt重組融合蛋白酵母工程菌株，再經(jīng)特定條件的高密度發(fā)酵培養(yǎng)、納濾和親和層析等一系列操作，最終制備的重組Bt重組融合蛋白可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的之一是要證實一個復合增強子能夠大大提高密碼子優(yōu)化后的Bt重組融合蛋白基因在漢遜酵母細胞中的生物表達量。按照一個優(yōu)先的實施方案，Bt融合蛋白基因首先被按照酵母所偏愛的密碼子所優(yōu)化并人工合成出來，然后它被置于一個畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAPDH)操縱之下，連同一個復合增強子，一起被整合到漢遜酵母基因組中，隨著重組酵母工程菌的生長，Bt融合蛋白基因在復合增強子的作用下能夠以組成型方式得到高效表達。本發(fā)明的目的之二是提供最適的重組漢遜酵母生長和表達條件以及目標蛋白快速的純化方法。按照一個優(yōu)先的實施方案，提供了有關(guān)重組漢遜酵母的最適的生長培養(yǎng)條件和外源蛋白表達條件，如培養(yǎng)基的成分、接種量、PH值、溶氧量和培養(yǎng)時間等，由此使該重組酵母工程菌的生長量和重組蛋白的分泌量都盡可能地達到最大化。通過離心除菌、納濾、 親和層析等操作從發(fā)酵液中得到高純度的Bt外源重組蛋白，以便其可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。(二)技術(shù)方案本發(fā)明利用漢遜酵母表達系統(tǒng)以組成型方式表達和生產(chǎn)Bt重組融合蛋白，該重組蛋白具有與天然蛋白相類似的結(jié)構(gòu)和組成。按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明提供了使用一個增強子以實現(xiàn)Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型方式高效表達和生產(chǎn)的方法，該重組Bt具有與天然Bt蛋白相類似的結(jié)構(gòu)與組成。同時本發(fā)明也提供了 Bt在漢遜酵母中可高密度發(fā)酵生產(chǎn)以及該重組蛋白快速分離和純化的方法。本發(fā)明利用漢遜酵母表達系統(tǒng)表達和生產(chǎn)Bt重組融合蛋白，如果將其經(jīng)過高度純化，可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。本發(fā)明所指的Bt重組融合蛋白是在漢遜酵母中以組成型方式表達和生產(chǎn)的，首先是編碼Bt蛋白的基因被按照酵母所偏愛的密碼子進行優(yōu)化并人工合成出來；與此同時， 為了以后該目標蛋白的高度純化，在Bt基因末端添加了一個6組氨酸標簽結(jié)構(gòu)(6xHis)編碼序列，然后，該融合蛋白基因被插入到一個帶有α-因子分泌信號肽核苷酸編碼序列的酵母表達載體上以便再形成一個新的融合蛋白基因。α-因子分泌信號肽的作用是操縱外源的重組Bt蛋白向漢遜酵母胞外的分泌。在該質(zhì)粒載體上，含有一個組成型啟動子，該啟動子位于α-因子分泌信號肽與Bt形成的融合蛋白基因的上游，它操縱融合基因在漢遜酵母細胞中的表達。在融合基因的下游，含有一個復合增強子，它能夠極大地提高Bt重組融合蛋白的表達量。在該質(zhì)粒載體中還含有漢遜酵母質(zhì)膜AIPase基因，它在質(zhì)粒載體整合到酵母基因組內(nèi)的過程中上起到了同源序列的作用。該載體經(jīng)線性化處理后，可通過電融合或氯化鋰等方法被導入到漢遜酵母細胞中，進而通過同源重組穩(wěn)定整合到酵母染色體基因組內(nèi)，此重組酵母在發(fā)酵培養(yǎng)過程中表達的Bt重組融合蛋白在α-因子分泌信號肽的引導下得以分泌到胞外的培養(yǎng)基中。本發(fā)明提供了極大地提高Bt重組融合蛋白在漢遜酵母中生物產(chǎn)量的方法，按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明提供了使用一個復合增強子以極大地提高Bt基因在漢遜酵母中表達效率的方法，而該重組蛋白與天然蛋白或其它常規(guī)表達系統(tǒng)生產(chǎn)的該重組蛋白相類似，可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。在漢遜酵母細胞中，Bt融合蛋白基因表達效率的高低，直接關(guān)系到以后該重組蛋白的提取、加工利用及所生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品成本的高低，按照一個優(yōu)先的實施方案，為提高Bt 重組融合蛋白在漢遜酵母中的表達量，編碼Bt重組蛋白的基因可按照酵母所偏愛的密碼子進行優(yōu)化，以便使該外源基因在漢遜酵母細胞中更穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成蛋白時效率更高。同時，以漢遜酵母質(zhì)膜AIPase基因作為同源序列，可以將外源基因高效并穩(wěn)定地整合到酵母基因組中，從而得到能夠穩(wěn)定表達Bt重組蛋白的漢遜酵母工程菌株。發(fā)酵產(chǎn)品中Bt重組蛋白的純度直接關(guān)系到該重組蛋白的應用范圍，按照一個優(yōu)先的實施方案，為了快速純化Bt組蛋白，可以首先使用不同截流分子量的過濾裝置對酵母發(fā)酵液上清液進行預處理，然后再通過鎳柱親和層析，在純化過程中的每一個環(huán)節(jié)，都可使用SDS-PAGE電泳進行檢測，通過上述方法最終可獲得純度達到99. 9 %的Bt重組蛋白，可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。對本發(fā)明所使用的方法和其它相關(guān)事項極為重要的是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指的漢遜酵母細胞及其重組產(chǎn)物的加工應用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化酵母細胞的質(zhì)粒載體包含有密碼子優(yōu)化后的、編碼Bt的基因和操縱該基因或DNA序列在所說的酵母細胞中表達的一個組成型啟動子和一個復合增強子組成。在某些具體的實施方案中， 質(zhì)粒載體還包括一個選擇性或標記基因，主要用于重組漢遜酵母細胞的篩選和檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的組成型啟動子是酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAPDH)， 正如上面所述，按照某些具體的實施方案，從畢赤酵母中克隆得到甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列，然后將其插入到質(zhì)粒表達載體PPIC9K中并取代載體原位置上的誘導型啟動子-乙醇氧化酶啟動子，以便使該質(zhì)粒表達載體能夠以組成型方式表達外源蛋白。按照某些具體的實施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒表達載體用于轉(zhuǎn)化漢遜酵母，它所編碼的外源蛋白是重組Bt殺蟲蛋白，更進一步地說，該質(zhì)粒表達載體所編碼的重組Bt殺蟲蛋白與天然蛋白或其它常規(guī)表達系統(tǒng)生產(chǎn)的該蛋白類似，可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。本發(fā)明也提供了漢遜酵母細胞遺傳轉(zhuǎn)化以及酵母重組子篩選的方法，它包括以下步驟1)按照酵母所偏愛的密碼子，進行Bt融合蛋白基因(蛋白C端添加了 6xHis標簽) 的人工合成；2) TYMV-HCMV復合增強子的人工合成；幻畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的克?。?)漢遜酵母質(zhì)膜AIPase基因的克?。?)構(gòu)建一個質(zhì)粒表達載體，其中含有編碼Bt重組融合蛋白的基因序列，該融合蛋白基因首先與α -因子分泌信號肽核苷酸編碼序列相互拼接形成一個新的融合蛋白基因，然后它們被置于畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子控制之下。在該質(zhì)粒載體中，含有一個復合增強子序列，它能極大地提高Bt融合蛋白基因的表達效率。與此同時，該質(zhì)粒表達載體中還包含有用于外源基因整合到酵母基因組的同源序列，該序列可以是PMAl或其它同源序列；6)通過電融合法或其他轉(zhuǎn)化方法，將上述線性化后的質(zhì)粒表達載體DNA導入到酵母細胞中，并將轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細胞涂布于 RDB固體平板選擇培養(yǎng)基上，能夠在此培養(yǎng)基上生長的酵母單菌落就是含有外源基因的酵母重組子；7)挑選再生出的酵母細胞單菌落，逐一接種到含有不同濃度G418(濃度依次為 0. 5,1. 0,1. 5,2. Omg/mL)的YPD固體平板培養(yǎng)基上，那些能夠在高濃度G418平板上生長的酵母單菌落具有較高的外源基因拷貝數(shù)，有可能具有較高的外源蛋白表達水平。按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明提供了經(jīng)過優(yōu)化的重組漢遜酵母培養(yǎng)生長條件以及Bt重組融合蛋白的快速純化方法，它包括以下二個階段1)菌體培養(yǎng)和蛋白大量表達階段。以10%的接種量(占基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的比例)接種酵母工程菌，經(jīng)過M 72 小時的培養(yǎng)，酵母菌體的濕重將達到180 190g/L左右，在此培養(yǎng)過程中不斷補加碳源，并維持一定的PH值和溶氧量，使菌體高密度發(fā)酵，在酵母菌體生長的同時，重組Bt殺蟲蛋白基因得到高效表達；幻蛋白快速純化。發(fā)酵液經(jīng)過離心和兩次不同規(guī)格的濾膜過濾處理， 最后再經(jīng)過一次鎳柱親和層析處理，Bt重組蛋白的純度可達99. 9%以上。本發(fā)明在詳細介紹酵母表達系統(tǒng)時僅提到漢遜酵母A16菌株，然而，如本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘慕湍副磉_系統(tǒng)那樣，許多種酵母表達系統(tǒng)都可以利用本發(fā)明所提供的方法進行遺傳轉(zhuǎn)化、表達和生產(chǎn)。因此，所有這些酵母表達系統(tǒng)都應包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。就像下面實例中所要詳細描述的那樣，本發(fā)明描述的酵母轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載體是一個整合型的質(zhì)粒表達系統(tǒng)，按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒表達載體是一個得到改造后的PPIC9K，其原先的AOXl誘導型啟動子被畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成型啟動子所取代，此外，還添加了一個復合增強子序列以極大地提高外源基因在漢遜酵母中的表達效率。同時在該質(zhì)粒表達載體中還包含有用于外源基因整合到酵母基因組內(nèi)的同源序列，該序列可以是PMAl或其他同源序列。本發(fā)明包括以下幾個組成部分1)按照酵母所偏愛的密碼子，Bt融合蛋白基因的被人工合成出來，將該DNA序列插入到pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點內(nèi)，用得到的中間質(zhì)粒載體 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，使中間載體得到復制，然后進行DNA測序，分析所插入外源基因的正確性和完整性；幻根據(jù)已知序列，TYMV+HCMV復合增強子序列被合成出來， 該DNA序列插入到pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點內(nèi)，用得到的中間質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細胞，使中間載體得到復制，然后進行DNA測序，分析所插入DNA片段的正確性和完整性；3)根據(jù)已知序列(GenBank :U62648. 1)，合成兩端的引物，以畢赤酵母基因組DNA 為模板，經(jīng)PCR擴增，可獲得畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子，將該DNA序列插入到 pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點內(nèi)，用得到的中間質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞， 使中間載體得到復制，然后進行DNA測序，分析所插入外源DNA片段的正確性和完整性；4) 利用常規(guī)的分子生物學技術(shù)(內(nèi)切酶和連接酶處理)，將畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子插入到上述的PPIC9K中并取代載體原位置上的誘導型啟動子-乙醇氧化酶啟動子， 以便使該表達載體能夠以組成型方式表達外源蛋白基因；5)根據(jù)已知的PMAl基因序列，合成兩端的引物，以漢遜酵母基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，得到PMAl DNA序列，將其插入到pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點內(nèi)，用得到的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，使載體得到復制，然后測序分析PMAl基因的正確性和完整性；6)利用常規(guī)的分子生物學技術(shù)(內(nèi)切酶和連接酶處理)，將Bt融合蛋白基因、TYMV-HCMV復合增強子序列、PMAl基因和畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子分別定向插入到pPIC9K質(zhì)粒中的相應酶切位點內(nèi)，由此形成一個全新的、組成型和分泌型酵母質(zhì)粒表達載體；7)高表達酵母重組子的篩選，經(jīng)過電融合或其它遺傳轉(zhuǎn)化方法，將上述重組后的酵母質(zhì)粒表達載體(已線性化)導入酵母受體細胞，在RDB固體平板選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待酵母單菌落出現(xiàn)后，再將其逐一轉(zhuǎn)接到含不同濃度G418的YPD固體平板培養(yǎng)基上，能夠抵抗高濃度G418的酵母重組子由于具有較高的Bt 外源基因拷貝數(shù)，因而有可能具有較高的外源蛋白表達量，因此，挑選能夠在最高濃度G418 的YPD固體平板培養(yǎng)基上生長的酵母重組子進行后續(xù)的操作；8)提供重組漢遜酵母最適生長培養(yǎng)和表達的條件；9)發(fā)酵上清液分別經(jīng)離心、過濾和鎳柱親和層析等步驟后，可得到純度達99. 9%以上的Bt重組融合蛋白。(三)有益效果采用本發(fā)明所述方法，可有效地將密碼子優(yōu)化后的Bt外源基因通過PMAl基因序列以同源重組的方式整合到漢遜酵母基因組中，獲得的酵母工程菌株能夠以組成型方式穩(wěn)定和高效地表達Bt重組融合蛋白，同時提供了該重組蛋白的發(fā)酵和純化工藝，適用于規(guī)?；a(chǎn)Bt重組蛋白。


為了詳細描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，并以相應的繪圖作參考圖1TYMV-HCMV復合增強子組成示意圖曲線部分為EcoR I酶切位點；第9 113 核苷酸堿基源自TYMV的3’端非編碼區(qū)(單畫線部分)；第119 609核苷酸堿基源自HCMV 早基因增強子的第201 690部分(雙畫線部分)；虛線部分為Not I酶切位點。圖2Bt毒蛋白基因密碼子優(yōu)化和改造前后對比N代表密碼子優(yōu)化和改造前的基因序列；M代表密碼子優(yōu)化和改造后的基因序列；圖3組成型酵母高效表達載體EBt-ATP-GPIC9K和WBt_ATP_GPIC9K的構(gòu)建全過程；圖4SDS-PAGE電泳檢測Bt重組融合蛋白表達情況M為標準分子量蛋白(BluePlus Proteinmarker 16 94KDa，北京 TransGen Biotech 公司產(chǎn)品)；CK_ 為陰性對照， GPIC9K轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株培養(yǎng)72小時發(fā)酵液上清；1 4分別源自WBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化酵母不同重組子培養(yǎng)72小時發(fā)酵上清液；5 8分別源自EBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化酵母重組子培養(yǎng)72小時發(fā)酵上清液，Bt重組融合蛋白的分子量約為68. 5kD ；圖5不同培養(yǎng)時間下的Bt重組蛋白的表達情況及親和層析后的Bt重組融合蛋白檢測M為標準分子量蛋白(Blue Plus Protein marker 16 94KDa，北京TransGen Biotech公司產(chǎn)品)；1 4泳道培養(yǎng)時間分別為iai、24h、4 !和7 的發(fā)酵上清液；5為鎳柱親和層析后的Bt重組蛋白。圖6使用ELISA方法檢測不同酵母重組子Bt重組蛋白表達情況A1 3、Bl 3 為EBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化酵母重組子發(fā)酵上清液；Cl 3和Dl 3為WBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化酵母重組子上清液；El為陽性對照；E2 3為陰性對照。
具體實施例方式下面以漢遜酵母組成型表達Bt重組融合蛋白為例，描述一些優(yōu)先的實施方案，但本發(fā)明的應用不僅限于此。本發(fā)明的進一步描述只是一些特別的優(yōu)先實施方案，是按照專利申請要求以及為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進一步的改進和變化。實施例1 :TYMV-HCMV復合增強子的人工合成根據(jù)業(yè)已公布的Turnip yellowmosaic virus (TYMV)(見 GenBank，登錄號 X07441)，和 Human cytomegalovirus (HCMV)(見 GenBank，登錄號K03104)的 DNA 序列， 按照酵母所偏愛的密碼子(Siarp P M，et al.，1986)，人工設計和合成了一個新的復合增強子序列(見SEQ ID NO :1)，在該序列中，有105個核苷酸堿基為TYMV的3’端非編碼區(qū) (TYMV基因組的第6214 6318核苷酸堿基)(見附圖1中單畫線部分)，有490個核苷酸堿基源自HCMV的早期基因增強子的核心部分(第201 690的核苷酸堿基)(見附圖1的雙畫線部分，與此同時，為便于此后酵母表達載體的構(gòu)建，在人工合成該復合增強子序列的過程中，在該DNA序列的5’端合成和添加了限制性酶切位點EcoR I ；在該DNA序列的3’端添加了限制性酶切位點Not I (上述DNA的合成和拼接工作由上海博亞生物技術(shù)公司代為完成)O實施例2 密碼子優(yōu)化后的Bt基因的人工合成Bt基因最初源于蘇云金芽孢桿菌，其密碼子為原核生物所偏好，而漢遜酵母屬于真核生物，故它們在基因密碼子偏好方面存在著一定的差異，而這種差異很可能會影響到 Bt基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在漢遜酵母細胞中的穩(wěn)定性和表達效率。為提高Bt的生物產(chǎn)量，根據(jù)業(yè)已公布的Bt基因的DNA序列(原為植物偏好的密碼子)和氨基酸序列(見GenBank， 登錄號AR110596)，在不改變其氨基酸序列的前提下(見SEQ ID NO :2)，按照酵母所偏愛的密碼子(Siarp P M，et al.，1986)，人工設計和合成了新的Bt成熟蛋白的DNA編碼序列，密碼子優(yōu)化和改造后的Bt基因與改造前相比，改變了其中的422個核苷酸堿基，總共涉及到340個密碼子，而G+C含量由原來的48 %變?yōu)楝F(xiàn)在的35 %，基因改造前后對比見附圖2。與此同時，為了便于此后酵母表達載體的構(gòu)建及重組蛋白的純化，在人工合成該 Bt核苷酸編碼序列的過程中，在該基因的5’端第一個翻譯起始密碼子ATG前合成和添加了限制性酶切位點》10 I以及酵母Kex2基因表達產(chǎn)物切割識別序列ΟΙΟαΔΟΔΔΔΔ Δ (見SEQ ID NO 3)；在該基因的3，端終止密碼子TAA前增加了 6xHis標簽結(jié)構(gòu)編碼序列 CMCATCAIGAT_C4IC:M，在TAA后增加了兩個限制性酶切位點EcoR I和Not I (上述基因合成和拼接工作由上海博亞生物技術(shù)公司代為完成)。實施例3 :TYMV-HCMV復合增強子和Bt基因的克隆將上述人工合成的TYMV-HCMV復合增強子序列及Bt融合蛋白基因DNA片段分別直接插入到pEASY-Tl (購自北京TransGenic公司)質(zhì)粒中的T位點內(nèi)，按照該公司所提供的方法，得到含有中間質(zhì)粒載體TYMV-HCMV-T和Bt-T的細菌克隆(見附圖幻，然后，通過 DNA測序，確定其所含的TYMV-HCMV-T復合增強子和Bt-T基因序列是正確和完整的(DNA測序由北京標凱科技有限公司完成)。實施例4 畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的克隆根據(jù)已知的畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列(GenBank :U62648. 1)，分別合成位于啟動子兩端的引物F和R，其中F為5 ‘ -ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGT C-C-3 ‘(劃線部分為 BamH I 切點)，R 為 5 ‘ -ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3 ‘(劃線部分為Mc I切點)，以畢赤酵母基因組DNA為模板(基因組提取方法參見《分子克隆實驗指南第三版》485頁)，以F和R為引物，通過PCR，擴增獲得甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列(GAPDH)，將擴增片段直接插入到pEASY-Tl質(zhì)粒中的T位點內(nèi)，按照該公司所提供的方法，得到含有中間質(zhì)粒載體GAPDH-T的細菌克隆(見附圖3)，然后，通過核苷酸測序分析，確定GAPDH是正確和完整的，見SEQ ID NO :4。實施例5 漢遜酵母質(zhì)膜ATP酶基因的克隆根據(jù)已知的漢遜酵母質(zhì)膜ATP酶基因核苷酸序列(見GeneBank :AF109913)，分別設計和合成引物 primer 1 和 primer2，其中 Primerl 序列為5-ATCATATGATGCTGCAACTG AACCAACCAAGGAG-3，，Primer2 序列為5’ -ATGCATGCTCAGTTGGACTTCTCGTGCTGAGTAGAG-3’。 Primerl和primer2分別添加有Nde I (CATATG)和Sph I (GCATGC)限制性內(nèi)切酶切位點， 用于后續(xù)的酵母表達載體的構(gòu)建。以漢遜酵母基因組DNA為模板，PCR擴增漢遜酵母質(zhì)膜 ATP酶基因，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割目的條帶并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，然后直接連接到pEASY-Tl質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(購自TransGenic 公司)，按照該公司所提供的方法，得到含有質(zhì)膜ATP酶基因的細菌克隆ATP-T(見附圖3)， 然后，通過核苷酸測序分析，確定質(zhì)膜ATP酶基因是正確的，見SEQ ID NO :5。實施例6 表達載體 EBt-ATP-GPIC9K 和 WBt_ATP_GPIC9K 的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamH I和Mc I進行雙酶切，將連接在中間質(zhì)粒載體GAPDH-T中的GAPDH DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒PPIC9K(美國hvitrogen公司產(chǎn)品)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的PPIC9K質(zhì)粒DNA，然后將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到中間質(zhì)粒載體GPIC9K (見附圖幻，然后用上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞DH5 α (購自美國 GIBCO公司)以方便進行該質(zhì)粒的復制和保存。用限制性內(nèi)切酶Nde I和Sph I進行雙酶切，將連接在中間質(zhì)粒載體ATP-T中的漢遜酵母質(zhì)膜ATP酶基因DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒GPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的GPIC9K質(zhì)粒DNA，然后將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到中間質(zhì)粒載體ATP-GPIC9K(見附圖幻，然后用上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞DH5 α以方便進行該質(zhì)粒的復制和保存。用限制性內(nèi)切酶Β ο I和Not I進行雙酶切，將插入在中間質(zhì)粒載體Bt-T中的Bt基因DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒ATP-GPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的ATP-GPIC9K 質(zhì)粒DNA，將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到漢遜酵母表達載體 WBt-ATP-GPIC9K(見附圖3)，在該表達載體中不含有TYMV-HCMV復合增強子序列，主要作為陰性對照以說明TYMV-HCMV復合增強子對Bt外源基因表達的增強作用。用上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞DH5 α (購自美國GIBCO公司)以方便進行該質(zhì)粒的復制和保存。用限制性內(nèi)切酶Β ο I和EcoR I進行雙酶切，將插入在中間質(zhì)粒載體Bt-T中的 Bt基因DNA片段切下來；用EcoR I和Not I進行雙酶切，將TYMV-HCMV復合增強子DNA序列自中間質(zhì)粒載體TYMV-HCMV-T上切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分別分離和回收上述DNA 片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒ATP-GPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的ATP-GPIC9K質(zhì)粒DNA，將上述三個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到漢遜酵母表達載體EBt-ATP-GPIC9K(見附圖幻，在該表達載體中含有TYMV-HCMV復合增強子序列，然后用上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞DH5 α (購自美國GIBCO公司)以方便進行該質(zhì)粒的復制和保存。質(zhì)粒載體pPIC9K購自美國^ivitrogen公司，它是一個甲醇誘導型表達質(zhì)粒載體， 含有一個誘導型啟動子-醇氧化酶啟動子(AOXl)，在甲醇的誘導下，可調(diào)控下游插入外源基因的高效表達。在該表達載體多克隆位點前含有α-因子分泌信號肽核苷酸編碼序列， 在與外源基因融合表達后，可引導外源重組蛋白向酵母細胞外分泌。在分泌到胞外的過程中，該信號肽可以被酵母Kex2基因表達產(chǎn)物切割下來，從而不改變重組蛋白的N端序列。實施例7 線性化質(zhì)粒表達載體DNA的制備首先用堿裂解法(參見分子克隆試驗指南)，從上述的大腸桿菌DH5 α細胞中小分別制備提取EBt-ATP-GPIC9K和WBt-ATP-GPIC9K質(zhì)粒DNA，然后用1 2倍過量的限制性內(nèi)切酶)(ba I進行酶切，使之完全線性化，可利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。然后用酚和氯仿分別抽提上述酶切產(chǎn)物，乙醇沉淀，棄上清，收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥后，將沉淀重新溶解在無菌的去離子水中，-20°C保存?zhèn)溆?。實施? 酵母細胞的遺傳轉(zhuǎn)化將_72°C保存的漢遜酵母菌液(菌株A16由中國農(nóng)業(yè)大學李穎教授惠贈)接種到 5mL YPD中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，37°C震蕩培養(yǎng)1天左右，將培養(yǎng)好的菌液以接種量重新接種于IOOmL YPD中，37°C震蕩過夜培養(yǎng)(8h)至OD6tltl = 1. 3 1. 5,4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在40mL溶液a (50mM磷酸鉀緩沖液，pH7. 5,25mM DTT)中，37°C溫浴15min，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在200mL冰預冷的溶液b (270mM蔗糖，IOmMTris-HCl，pH7. 5，ImM MgCl2) 中，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在IOOmL預冷的溶液b中， 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在ImL預冷的溶液b中，吸取 80uL于1. 5mL離心管中，與上述線性化表達載體EBt-ATP-GPIC9K和WBt-ATP-GPIC9K質(zhì)粒DNAG 5ug)分別充分混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰浴后的0. 2cm無菌電擊杯中，利用電擊儀 ft~eCiSi0nPulSeTM(BTX公司產(chǎn)品)將線性化的表達載體質(zhì)粒DNA導入酵母感受態(tài)細胞中，使用的電擊參數(shù)為電壓1. 5kV,電容50uF，電阻125 Ω。電擊完成后，立即向電擊杯中加入ImL 室溫的YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，2%葡萄糖)，充分混勻后，37°C靜置1小時，然后涂布于固體YPD培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基中加入了 2%瓊脂粉，0.2mg/mL G418)上，平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中2 3天，至轉(zhuǎn)化重組子出現(xiàn)。實施例9 高表達酵母菌株的篩選將在YPD培養(yǎng)基(0. 2mg/mL G418)上生長的酵母單菌落(轉(zhuǎn)化子)用無菌牙簽逐一挑取到含有梯度G418的YPD培養(yǎng)基(分別含有0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL、2mg/mL G418)上，平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中1 2天。隨著攜帶有G418抗性基因的外源質(zhì)粒整合到酵母基因組中的拷貝數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化子對G418的抗性增強。挑取能夠在含有ang/mL G418的YPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子，接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基[1 %酵母提取物，2%酪蛋白胨，IOOmM 磷酸鉀緩沖液(ρΗ7· 0)，1. 34% ΥΝΒ，0· 00004% Biotin，甘油(ν/ν)]中，37°C 震蕩培養(yǎng)4天，發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集可能含有重組CP4-EPSPS蛋白的上清液，進行SDS-PAGE電泳檢測。從附圖4可知，在經(jīng)表達載體EBt-ATP_GPIC9K轉(zhuǎn)化所獲得的重組酵母菌株培養(yǎng)上清液泳道中含有Bt目標蛋白帶，而在經(jīng)表達載體WBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化所獲得的重組酵母菌株培養(yǎng)上清液泳道中則沒有Bt目標蛋白帶(培養(yǎng)7 后檢測)。該結(jié)果表明TYMV-HCMV 復合增強子對提高Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中的表達量方面起到了關(guān)鍵作用。隨機挑取部分能夠在ang/mL G418的YPD平板上生長的酵母轉(zhuǎn)化子，發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清進行ELISA檢測。Bt ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司，按照試劑盒所提供的方法，分別取100微升發(fā)酵上清液添加到酶鏈反應板的各小孔中，后依次沖洗、添加酶標抗體、TMB顯色底物，在650nm的波長下測定吸光度。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有能夠在ang/mL G418的YPD平板上生長的6個EBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化重組子都能產(chǎn)生陽性反應，且差別不明顯。從中隨機挑選出一株作為工程菌加以保存，并將其命名為HP-Bt。而在經(jīng)表達載體 WBt-ATP-GPIC9K轉(zhuǎn)化的6個酵母重組子與陰性對照一樣均不能產(chǎn)生陽性反應(見附圖5)。實施例10 重組酵母菌的高密度發(fā)酵1、種子液的制備挑取單菌落，將重組酵母菌株HP-Bt接種于IOmL BMGY培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，以10%的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL BMGY培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，再以10%的接種量轉(zhuǎn)接于IL BMGY培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，將其轉(zhuǎn)接到3L BMGY培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)2 天，作為高密度發(fā)酵的種子液。2、重組酵母在50L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵本發(fā)酵過程可以分為兩個階段1)初培養(yǎng)階段在50L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術(shù)有限責任公司)中盛放了 30L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[lOXBasal Salts :2. 67%磷酸、0. 093%硫酸鈣、1. 82%硫酸鉀、1. 49%硫酸鎂、0. 413%氫氧化鉀+4%甘油]，在接種前先加入氨水使該培養(yǎng)基的PH值維持在4. 0左右(研究發(fā)現(xiàn)，低pH可防止目標蛋白的酶降解，在PH高于5時，目標蛋白的表達量降低)，再按照下述比例，在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL微量鹽溶液PTMl (0. 6%硫酸銅，0. 008%碘化鈉，0. 3%硫酸錳，0. 02%鉬酸鈉，0. 002%硼酸，0. 05%氯化鈷，2%氯化鋅，6. 5%硫酸亞鐵，0. 025%生物素，0. 5%硫酸)。按 10%的比例(與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的體積之比)接種此前制備好的種子液，37°c通氣攪拌 (轉(zhuǎn)速為375轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)M小時左右。在該階段的進行過程中，隨著酵母菌體的生長， 培養(yǎng)基中的溶氧量將由100%逐漸降低，當培養(yǎng)基中的碳源消耗完后，溶氧量將再度升高至 80%以上，此時菌體的濕重將達85 95g/L。2)蛋白大量表達階段( 72h)從接種后的第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量為 18mL/L/天。37°C通氣攪拌培養(yǎng)，4 后菌體的濕重將達170 180g/L。隨著菌體的生長， PH值逐漸降低，用氨水維持pH值在4. 0左右，同時調(diào)整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20%以上。每隔M小時取數(shù)毫升發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 4°C下離心10分鐘，取30uL發(fā)酵液上清液進行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)有肉眼可觀察到的一條蛋白帶，分子量約為68. 5kDa，與推測中的Bt重組蛋白分子量基本吻合。此外，從電泳圖中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)72小時后，Bt重組蛋白表達量達到最高峰(見附圖6)。實施例10 重組蛋白的純化待一個發(fā)酵周期全部結(jié)束之后，留取500mL發(fā)酵液作為種子液(接種量為5% ) 直接進行下一輪的發(fā)酵過程。類似的操作累計進行3輪，在每輪發(fā)酵過程中，均對菌體的生長量和Bt重組蛋白的表達量進行了測定。另外，在每輪發(fā)酵過程完全結(jié)束后，還取少許菌液涂布于YPD固體平板上，并從中任意挑取10個酵母單菌落，快速提取其基因組(蔡傳奇等，2001) DNA，進行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體的生物量、生長速度以及重組蛋白的表達量在各輪發(fā)酵過程中基本保持穩(wěn)定，另外，PCR的檢測結(jié)果也證實重組漢遜酵母菌株具有很好的遺傳穩(wěn)定性(見表2)。表2. HP-Bt菌株的遺傳穩(wěn)定性和外源蛋白表達穩(wěn)定性的測定
PCR陽性生長對小時的菌體濕重(g/L)誘導72小時財表達量(mg/L)100%8941100%9143100%9041在一個發(fā)酵周期結(jié)束之后，除留下500mL發(fā)酵液作為種子液外，其余的發(fā)酵液用于Bt重組蛋白的純化。發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 4°C離心10分鐘，留取上清。發(fā)酵液上清用截流分子量為IOKDa的納濾膜(上海朗極化工科技有限公司，產(chǎn)品編號』似6538，使用方法見該公司說明)處理，保留回流液，終體積約為700mL。將此回流液進行脫鹽處理，向700mL回流液中加入6. 3L蒸餾水，即將回流液稀釋10倍，然后將稀釋液再次通過上述IOKDa的納濾膜處理，此時得到的回流液中鹽離子濃度也相應稀釋10倍，如此重復操作5次，即回流液中鹽離子濃度稀釋IO5倍，最終得到700mL回流液，將此回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉(純度大約為13%左右)。將上述蛋白凍干粉重新懸浮于50mL的20mM Tris-HCl緩沖液中(pH7. 9，含5mM咪 P坐，0. 5M NaCl)。準備20mL的鎳柱，首先用無菌水洗柱(10倍柱床體積)，流速lmL/mim，然后用上樣緩沖液I (IOmM Tris-HCl，pH7. 9，含0. 25M NaCl)進行平衡(10倍柱床體積)，流速為lmL/min。將50mL的上述蛋白樣品液以lmL/min的速度加入到柱子中。用上樣緩沖液I 繼續(xù)平衡(10個柱床體積)，然后分別用含有50mM、IOOmM及400mM咪唑的IOmMTris-HCl緩沖液(pH7. 9，含0. 25M NaCl)進行洗脫，流速為2mL/min，收集各階段的洗脫峰，在SDS-PAGE 電泳后，用UVP凝膠成像儀檢測Bt重組蛋白回收純度。在上述純化流程中，每個操作步驟之后都留取少量樣品以便進行總蛋白量、純度和回收率的測定(見表幻。用Bradford法檢測蛋白的濃度。最終制得的重組蛋白純品進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色和脫色后，電泳圖經(jīng)LabWork軟件(美國UVP公司產(chǎn)品)分析，結(jié)果顯示Bt重組蛋白濃度達到99. 9%以上 (見附圖6)，重組蛋白的表達量約為41mg/L。表3. Bt重組蛋白的純化
權(quán)利要求
1.一種使用復合增強子以提高Bt融合蛋白在漢遜酵母表達量的方法。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的復合增強子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1中的方法，編碼Bt融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1中的方法，需構(gòu)建一種表達質(zhì)粒載體，其特征在于它含有權(quán)利要求2所述的復合增強子序列及權(quán)利要求3中所述的編碼Bt融合蛋白的DNA序列。
5.如權(quán)利4中所述的表達載體，其特征在于，在構(gòu)建表達載體時，采用的起始載體為 PPIC9K或其他能夠組成型表達并分泌重組蛋白到胞外的質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求1中的方法，需要一種酵母宿主細胞，其特征在于它包含權(quán)利要求4和5 中所述的表達載體。
7.如權(quán)利要求6中所述的宿主細胞，它是指漢遜酵母菌株A16或其他能夠表達外源基因的酵母菌株。
8.利用權(quán)利要求7所述的漢遜酵母菌株A16高效表達和生產(chǎn)Bt重組融合蛋白的方法， 其中包括了四個階段1)種子液制備挑取酵母單菌落，接種于IOmLYPD液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜后，將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于IOOmL YPD培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)M小時后，該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于3L BMGY培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)48小時，然后將其作為種子液；2)初培養(yǎng)階段在20L發(fā)酵罐中盛放了IOL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[lOXBasal Salts 2. 67%磷酸、0. 093%硫酸鈣、1. 82%硫酸鉀、1. 49%硫酸鎂、0. 413%氫氧化鉀+4%甘油]， 在接種前先加入氨水使該培養(yǎng)基的PH值維持在4. 0左右，再按照下述比例，在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL微量鹽溶液PTM1(0. 6%硫酸銅，0. 008%碘化鈉，0. 3%硫酸錳， 0. 02 %鉬酸鈉，0. 002 %硼酸，0. 05 %氯化鈷，2 %氯化鋅，6. 5 %硫酸亞鐵，0. 025 %生物素， 0. 5%硫酸)。按占基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的比例接種此前制備好的種子液，37°C通氣攪拌(轉(zhuǎn)速自始至終維持在375轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)M小時左右；3)蛋白大量表達階段從接種后的第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量為18mL/L/天。37°C通氣攪拌培養(yǎng)至72h，用氨水維持 PH值在4. 0左右，同時調(diào)整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20%以上。4)發(fā)酵液經(jīng)5000rpm4°C離心10分鐘，留取上清。用截流分子量為IOKDa的納濾膜處理上清液，保留回流液。用蒸餾水將回流液稀釋10倍，然后再通過IOKDa的納濾膜處理，如此重復操作5次。將回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的Bt重組蛋白凍干粉。將其重新懸浮于50mL的20mMTris-HCl緩沖液中(pH7. 9，含5mM咪唑，0. 5M NaCl)。準備20mL的鎳柱， 首先用無菌水洗柱(10倍柱床體積)，流速lmL/mim，然后用上樣緩沖液I (IOmM Tris-HCl, PH7.9，含0.25M NaCl)進行平衡(10倍柱床體積)，流速為lmL/min。將上述蛋白樣品液以 lmL/min的速度加入到柱子中。用上樣緩沖液I繼續(xù)平衡(10個柱床體積)，然后分別用含有 50mM、100mM 及 400mM 咪唑的 IOmM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 9，含 0. 25MNaCl)進行洗脫，流速為2mL/min，收集含Bt目標蛋白階段的洗脫液，匯合后凍干。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的Bt重組融合蛋白經(jīng)高度純化后可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。
全文摘要
一種提高Bt殺蟲蛋白在漢遜酵母中表達量的方法，本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及使用一個復合增強子以實現(xiàn)Bt融合蛋白基因在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式高效表達的方法，其中包括1)使用一個復合增強子以提高密碼子優(yōu)化后的Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中的產(chǎn)量；2)采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調(diào)控Bt融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型的方式表達；3)優(yōu)化后的漢遜酵母發(fā)酵培養(yǎng)生長條件；4)利用納濾及鎳柱親和層析快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法制備的Bt重組融合蛋白可作為蛋白質(zhì)標準物質(zhì)備選物應用于蛋白質(zhì)溯源研究等領(lǐng)域。
文檔編號G01N33/68GK102533841SQ201210030218
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者劉德虎, 劉樹鵬, 李剛強, 王楠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所