一株低溫條件下高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本專利屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株低溫條件下高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)酯酵母又稱生香酵母，不是酵母分類學(xué)上的名詞，是指可生成較多量酯類物質(zhì) 的酵母的通稱，分屬于漢遜酵母屬、產(chǎn)骯酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬和酒香酵母屬等。 酯屬于一種有機(jī)化合物，低級酯是一類具有香氣的揮發(fā)性液體。產(chǎn)酯酵母大多是一些野生 酵母，它們在自然界中分布較廣，在釀造工業(yè)的原料、制造工序以及制成品中都有不同程度 的體現(xiàn)，在我國釀造行業(yè)中占有舉足輕重的地位，被廣泛用于白酒、黃酒、葡萄酒、醬油、豆 瓣、甜面醬、食醋等傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是產(chǎn)香的主要菌種之一。
[0003] 從20世紀(jì)60年代開始，產(chǎn)酯酵母便已用于白酒生產(chǎn)，彌補(bǔ)了白酒香氣不足和后味 較淡的缺點(diǎn)。產(chǎn)酯酵母不但適于液體培養(yǎng)，也適于半固態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)。據(jù)報道，當(dāng)前大多產(chǎn) 酯酵母在溫度為25~30°C，尤其是28°C時總酯生成量最高。專利號CN102199556A中公 開一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程及其構(gòu)建方法，專利號CN102586125A中公開的一株高產(chǎn) 酯的東方伊薩酵母菌、其組合物及應(yīng)用，專利號CN103184167A中公開的一株異常威克漢姆 酵母及其應(yīng)用，這些專利中涉及的菌株均為高產(chǎn)乙醇、乙酸乙酯的菌株，但產(chǎn)酯溫度都偏高 (25~28°C間），此外以上報道菌株的代謝產(chǎn)物種類多，在實(shí)際應(yīng)用中，不利于突出產(chǎn)品的 特有風(fēng)味。對于低溫條件下產(chǎn)酯高、且代謝產(chǎn)物單一的酵母，尚未見報道。而在發(fā)酵食品生 產(chǎn)過程中，生產(chǎn)企業(yè)為了增加產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)含量，大多都采用提高發(fā)酵溫度以創(chuàng)造有利 于在較高溫度下才能合成酯類物質(zhì)的微生物的生長環(huán)境，可見，產(chǎn)酯酵母發(fā)酵溫度高，帶來 的后果是增加工藝難度，能耗增加，生產(chǎn)成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中發(fā)酵溫度高帶來的工藝難度大、能耗增加、生 產(chǎn)成本高、代謝產(chǎn)物種類多等問題，本發(fā)明提供一種耐酸、耐鹽、耐乙醇、在低溫條件下即能 高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌，本發(fā)明目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0005] -株低溫條件下高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株為異常威克漢姆 酵母（Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0. 10370。
[0006] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述菌株產(chǎn)乙酸乙酯的最佳溫度為22 °C，耐酸性為 ρΗ2· 5~7. 0,耐鹽性為0~15% (NaCl% )，耐乙醇性為0~10% (v% )。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述菌株的篩選方式為：將曲藥、釀造醅或釀造原料用研 缽研磨后稱取l〇g至lOOmL無菌生理鹽水，搖床150r/min震蕩30min，稀釋涂布于初篩培養(yǎng) 基，挑選透明圈直徑和菌落直徑之比較大菌落即產(chǎn)酯顯著菌株，再將菌株轉(zhuǎn)接，進(jìn)行搖瓶發(fā) 酵復(fù)篩，測定發(fā)酵液酯含量，篩選獲得產(chǎn)酯能力強(qiáng)的菌株。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述產(chǎn)酯初篩培養(yǎng)條件為：初篩培養(yǎng)基：蛋白胨20%、葡 萄糖2%、酵母膏1 %，瓊脂2%、三丁酸甘油酯0. 4%，用去離子水配制，自然pH，28~30°C 培養(yǎng)1~3天，根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑之比判斷產(chǎn)酯性能。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為：將大米或麥芽糖化液與麩皮 浸提液按照體積比為5-9:3的比例進(jìn)行配置，調(diào)節(jié)PH至5. 0,在25-35Γ，150rpm條件下?lián)u 瓶培養(yǎng)24-120h。
[0010] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述大米或麥芽糖化液的制備為：50g大米或麥芽樣品 經(jīng)粉碎后，加2-6倍體積的水，蒸煮0. 5-2h，呈糊狀，冷卻后以每克原料4~8U的量加入糖 化酶α-淀粉酶，于60°C水浴0. 5-2h，液化完成后用lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0,然后以 每克原料40~100U的量加入糖化酶，60°C水浴，糖化完全，過濾、離心，收集上清液即為大 米汁或麥芽汁。
[0011] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述麩皮浸提液的制備為：稱取400g麩皮并加入1-5倍 水，90 °C水浴1 _2h，冷卻過濾，濾液即為麩皮浸提液。
[0012] 本發(fā)明還公開了所述菌株在傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)和食品工業(yè)中的應(yīng)用。
[0013] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述菌株在食醋、醬油、豆豉、面醬、釀造酒、蒸餾酒、配制 酒等行業(yè)中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所述菌株產(chǎn)乙酸乙酯的最佳溫度為22°C，耐酸性為 pH2. 5~7. 0 ;耐鹽性為0~15%(NaCl% );耐乙醇性為0~10% (v% )，在低溫條件下即 能使產(chǎn)酯量達(dá)到最大，且發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物僅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含雜醇油。本發(fā) 明菌株可作為重要功能菌應(yīng)用于食醋、醬油、豆豉、面醬、釀造酒、蒸餾酒、配制酒等傳統(tǒng)發(fā) 酵行業(yè)及食品工業(yè)中，降低傳統(tǒng)生產(chǎn)的發(fā)酵溫度，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)能耗及成本，同 時增加產(chǎn)品乙酸乙酯含量，改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品品質(zhì)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0015] 圖1為酵母菌Njsys-HDl的26SrDNADl/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0016] 圖2為酵母菌Njsys-HDl代謝產(chǎn)物圖；
[0017] 圖3乙酸乙酯質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0019] 實(shí)施例1產(chǎn)酯酵母菌的篩選
[0020] 將曲藥、發(fā)酵醅用研缽研磨后分別稱取10g至100ml無菌生理鹽水，搖床150r/ min震蕩30min即為菌懸液，進(jìn)行十倍系列稀釋，將稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基，挑選透明圈 直徑和菌落直徑之比較大菌落即產(chǎn)酯顯著菌株。再將菌株轉(zhuǎn)接，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，采用 HS-SPME-GC-MS方法測定發(fā)酵液酯種類，利用GB/T10345- 2007規(guī)定的白酒總酯的測定方 法測定發(fā)酵液乙酸乙酯含量，篩選獲得產(chǎn)乙酸乙酯能力強(qiáng)的菌株。
[0021] 產(chǎn)酯初篩培養(yǎng)條件為：初篩培養(yǎng)基：蛋白胨20% (質(zhì)量百分比，下同）、葡萄糖 2%、酵母膏1%，瓊脂2%、三丁酸甘油酯0. 4%，用去離子水配制，自然pH，28°C培養(yǎng)2天， 根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑之比判斷產(chǎn)酯性能。
[0022] 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的具體過程如下：
[0023] ①、大米汁發(fā)酵培養(yǎng)基的制作：50g大米經(jīng)粉碎后，加入4. 5倍體積的水，蒸煮lh， 呈糊狀，冷卻后以每克原料6U的量加入α-淀粉酶，于60°C水浴lh，液化完成后用lmol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0,然后以每克原料80U的量加入糖化酶60°C，60°C水浴，直至碘試不顯 藍(lán)色為止，后煮沸滅酶，糖化完全，過濾、離心，收集上清液即大米汁備用。
[0024] ②、麩皮浸提液的制備：稱取400g麩皮并加入5倍水，90°C水浴lh，冷卻過濾，收 集濾液備用，濾液即為麩皮浸提液。
[0025] ③、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將麩皮浸提液添加到大米汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，大米汁與麩皮浸提 液的體積比為7:3,調(diào)節(jié)PH至5. 0,在28°C，150rpm的條件下，搖瓶培養(yǎng)24h。
[0026] 發(fā)酵液酯種類的測定：采用HS-SPME-GC-MS方法測定，15mL頂空瓶中加入5~ 10mL澄清發(fā)酵液及1~5gNaCl，進(jìn)行頂空固相微萃取。頂空固相微萃取的條件為：三相 (Car/DVB/PDMS)萃取頭，60°C預(yù)熱 5 ~lOmin，萃取吸附 30 ~50min，GC解吸 3 ~lOmin。 發(fā)酵液酯種類的測定結(jié)果如圖2,圖3所示。
[0027] 實(shí)施例2產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌及其分子生物學(xué)鑒定
[0028] 對獲得的產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，利用酵母特異分類鑒定引物分 別擴(kuò)增菌株的26SrDNA片段，經(jīng)凝膠電泳檢測。隨后進(jìn)行測序比對，確定所篩得酵母的種 屬。將菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，酵母種屬及保藏編號 為：異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus)CGMCCNO:10370。
[0029] 酵母菌的種屬確認(rèn)過程如下：
[0030] 分離菌株的26SrDNA序列同源性鑒定：酵母菌DNA的提?。簩⒔湍妇罨蠼臃N 在液體YTO培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)12h后，取少量菌體到滅菌的1. 5mLEP管中，加入500ul CBTA緩沖液和50ul蝸牛酶（100mg/ul)，37°C，225r/min，震蕩2h后，加入lOOulSDS，接著在 65°C水浴15min和-80°C冰浴20min，反復(fù)凍融3次之后，加等體積氯仿酚異戊醇（25:24:1， v/v/v)震蕩lmin，靜置10min，12000g離心10min，取上清液到新的無菌EP管中，取上清 液450ul到新的EP中，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，常溫靜置lh后，20°C，13000g離心 20min，完成后，棄上清液，加入lml70%乙醇，靜置10min后4°C，13000g離心15min，棄乙 醇溶液（重復(fù)洗滌2次），吹干至無醇味，加入50ul無菌雙蒸水，65°C水浴lh，最后瓊脂糖 電泳檢測DNA有無。
[0031] 26SrDNA基因的擴(kuò)增：對所提的總DNA進(jìn)行26SrDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的引 物為一對通用引物，正向引物為NL-1 (5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'），反向引物為NL -4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。
[0032] ?0?反應(yīng)體系（50此）為：無菌超純水33.5111，10\?0?81^€615111，（1犯134111， Mg2+3ul，兩個引物各lul(10uM/ul)，Taq酶 0· 5ul，模板lul。
[0033]PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸 90s，共 35個循環(huán)，最后72°C延伸10min，最后通過140V電泳20min檢測結(jié)果。并寄往上海杰李生 物技術(shù)公司測序。
[0034] 數(shù)據(jù)分析：將擴(kuò)增序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比 對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和確定其分類地位。DNA MAN軟件對齊序列，Mega6.0軟件的鄰位法（Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng) 發(fā)育樹采用Neighbor-Joining(鄰位相接）算法、Boottrap1000次計(jì)算，結(jié)果如圖1所 不。Njsys-HDl菌株與Wickerhamomyces·