專利名稱：微流體裝置及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微流體裝置。
背景技術：
目前的微流體裝置(“芯片”)和系統(tǒng)允許對小體積(一般為幾微升)進行半自動 化和自動化操作。樣品處理和測定的小型化提供了速度和靈敏度的同時提高，以及規(guī)模的 經(jīng)濟性——運行測定和獲得期望信息所需的試劑、樣品和空間更少，并且減少對單個樣品 和試劑的操作減少了誤差的機會。已改造或計劃將微流體裝置和系統(tǒng)用于多種化學和生化 分析，包括蛋白質(zhì)晶體學、無細胞蛋白質(zhì)合成、氣相色譜、細胞分離、電泳、聚合酶鏈式反應 (PCR)等等。PCR和其它基于核酸的方法的出現(xiàn)以及人基因組測序的完成產(chǎn)生了多種基于核酸 的診斷和檢測，這不斷地需要更精確和靈敏的分析工具。對基因表達、多態(tài)性、突變(可遺 傳的或其他的)等的認識已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成衛(wèi)生保健的改善，這繼而要求更精確和靈敏的分析 工具。更早地檢測和診斷遺傳疾病、癌癥和感染提供了直接的有益影響——可更有效地治 療疾病的早期階段，并且成功的程度經(jīng)常更高，因此大大改善了受試者的結(jié)局和生活質(zhì)量。定量實時PCR(RT-PCR)是目前用于檢測相對稀有的多態(tài)性的“金標準”，但是其要 求在可靠地檢測差異之前樣品中存在20%或更高的差異。因為PCR是指數(shù)性技術，所以 其內(nèi)在地具有高靈敏度，原則上允許檢測單個分子。但是，任何非特異性擴增或污染均可 導致假陽性，由此使其很難可靠地檢測稀有序列。在靶序列與可能以更高水平存在的其它 種類非常相似時特別是這樣，因此可能限制測定在檢測稀有分子種類時的靈敏度，稀有癌 細胞群體中單核苷酸多態(tài)性的存在可能由于具有幾乎相同序列的高背景正常分子而不可 見。另外，實時監(jiān)測指數(shù)反應具有高動態(tài)范圍，但是區(qū)分能力有限，兩個序列相對豐度的差 異低于約20%可能就難以檢測。在許多應用中，可能需要高得多的靈敏度。例如，從循環(huán)血 中檢測胎兒非整倍性會需要準確檢測約1-6%的等位基因差異(Lo等人，1998. Am JHuman Genetics)。數(shù)字化PCR 首先由 Vogelstein 和 Kinzler 在 1999 年報道(Proc. NatlAcad. Sci USA 96 =9236-9241)。數(shù)字化PCR技術提供對單個分子的擴增，但是使用常規(guī)96孔和384 孔板對微升體積反應器進行宏觀實現(xiàn)可能必須克服非特異性擴增、污染、高試劑成本以及 反應數(shù)不大的問題。因此，通過數(shù)字化PCR進行定量分析要求以低假陽性率可靠地擴增單 個分子，這通常要求對微升體積反應器進行仔細優(yōu)化。另外，數(shù)字化PCR分析的準確性依賴 于反應的數(shù)目。對差異的可靠檢測將需要成千上萬至數(shù)百萬個反應。這無法使用現(xiàn)有 方法來實現(xiàn)。正在出現(xiàn)的微流體技術通過小體積區(qū)室提供了高靈敏度、可放大性和規(guī)模經(jīng)濟性，由此允許充分實現(xiàn)數(shù)字化PCR的能力。減小測定的規(guī)模不僅僅帶來規(guī)模上的經(jīng)濟性——可使用更少的樣品和對一個樣 品運行更多的檢測是最明顯的益處，而且還可實現(xiàn)在使用“常規(guī)”的體積和樣品大小時不實 際或者不可能的生物學測定。在一些情況下，可以簡單地縮小常規(guī)測定的規(guī)模，例如使用1 微升體積代替100微升；而在另一些情況下，可能需要在建立測定的方式、所分析的數(shù)據(jù)或 者其它方面進行重大的修改。Zhang等，2006 (Biotechnology Advances 24 :243_284)綜述 了用于DNA擴增的PCR微流體裝置以及多種可用于微流體應用的方法、材料和技術。將溶液區(qū)室化為很多小體積反應可用于許多領域中。包含閥和流體通道的微流體 裝置允許以規(guī)則的空間排列形成平面(二維)乳液。這種規(guī)則排列具有可以隨時間追蹤每 個液滴或者對其成像的優(yōu)點。這在要求隨時間監(jiān)測讀數(shù)的測定(例如實時聚合酶鏈式反 應)中特別重要。此外，這些方法允許精確定義的陣列，其中每個液滴具有基本相同的體 積。利用通過閥進行區(qū)室化的微流體數(shù)字化PCR已用于環(huán)境細菌的多基因分析 (Warren等人，2006. PNAS 103 17807-17812),以及用于造血細胞的轉(zhuǎn)錄因子譜測定 (Ottesen等，2006. Science 314 1464-1467) 用于這些實驗的微流體裝置提供了約9000 個獨立IOnL反應的區(qū)室化陣列。現(xiàn)有微流體裝置中可實現(xiàn)的PCR反應的密度和最小體積可具有實際的局限性。 隨著陣列密度的增加，個體反應室的體積減少，閥可能占據(jù)過多的空間，使其變得不可 行?？梢钥煽恐圃斓奈⒘黧w閥的最大密度(根據(jù)間距約200微米的50X50的室陣列，通 常為約2500cm2)提供了可制造的獨立閥限定的反應室數(shù)目的上限(Thorsen等人，2002. Science298 580-584)以及2)可在透氣性彈性體裝置中實施而在熱循環(huán)過程中沒有過量 試劑蒸發(fā)的PCR反應的最小體積(約InL)。在數(shù)字化PCR中密度和規(guī)模特別重要，這是因 為準確的測量需要將單個樣品區(qū)室化成數(shù)千至數(shù)百萬個獨立反應，使得其在裝置面積和試 劑消耗方面非常昂貴。因此，顯著增加測定密度并減少測定體積的新方法是實現(xiàn)此技術全 部潛力的中心問題。盡管已知多種材料可用于微流體應用，但是硅酮橡膠材料(例如聚二甲硅氧烷或 PDMS)由于其操作便利性和適于微流體裝置的整體結(jié)構(gòu)而是優(yōu)選的，PDMS顯示高透氣性， 使得可以填充盲端結(jié)構(gòu)。另外，PDMS對水蒸汽具有高透過性。因此，在PDMS構(gòu)建的微流體 裝置中進行的一些過程(特別是要求高溫的，例如PCR)可能由于快速蒸發(fā)而使小的水反應 體積變干，反應可能失敗?？朔@一局限性的努力使用了外部水化方法。盡管這一嘗試在一定程度上減少了 蒸發(fā)率，但是即使使用這種水化，能夠成功使用的樣品體積大小仍然受到蒸發(fā)的限制。這限 制了該系統(tǒng)整合能夠?qū)崿F(xiàn)高密度陣列的極小體積的樣品大小(例如皮升或更小的量級上， 從而實現(xiàn)大樣品數(shù))從而改善該裝置效用的能力。US 7，118，910公開了用于實施PCR測定的微流體裝置，還公開了在微流體裝置中 使用流體_流體防護通道來減少流體從裝置中蒸發(fā)。US 6，555，389公開了通過毛細管通道從流體儲器補充蒸發(fā)所致的流體損失，從而 補償微流體裝置中蒸發(fā)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及微流體裝置。本發(fā)明還涉及這樣的微流體裝置，其包含與彈性體基底 中形成的流動通道流體連通的多個反應室、防止從所述多個反應室蒸發(fā)的蒸汽屏障以及分 隔所述多個反應室中每一個的連續(xù)相流體。還提供了使用所述微流體裝置對靶核酸進行數(shù) 字化定量的方法。本發(fā)明提供了下述微流體裝置，所述裝置使反應室密度提高了三個數(shù)量級，實現(xiàn) 了高達約10000000個反應室/平方英寸(約1.5 X IO6個/cm2)的密度，而同時將每個測定 的體積減少相當?shù)牧?。所述裝置提供了 PL體積乳液陣列的測定區(qū)室化，而不需要閥來分隔 各個反應室。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了微流體裝置，其包含與彈性體基底中形成的流動 通道流體連通的多個反應室、防止從所述多個反應室蒸發(fā)的蒸汽屏障以及分隔所述多個反 應室中每一個的連續(xù)相流體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了微流體裝置，其包含與彈性體基底中形成的流動 通道流體連通的多個反應室，以及共面施加到多個反應室并且通過彈性體層與反應室隔開 的蒸汽屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述微流體裝置還包含沿流動通道設置的多個閥，所述 多個閥中的每一個包含一個或多個與所述流動通道相交的控制通道。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述閥位于所述流動通道的第一和第二端。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室為皮升或飛升體積。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室為盲端反應室。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室含有一種或多種預先放置的試劑。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室以5000個室/cm2或更高的密度存在。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了對包含與含有第一流體之流動通道流體連通的 多個反應室的微流體裝置中的流體進行區(qū)室化的方法；用第二流體沖洗所述流動通道并置 換所述流動通道的第一流體但不置換反應室中的第一流體，所述第二流體不與所述第一流 體混溶；其中每個所述多個反應室中的所述第一流體通過所述流動通道中的第二流體與每 個其它反應室中的第一流體分隔開。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了對靶核酸進行數(shù)字化定量的方法，所述方法包 括用包含靶核酸的第一流體填充與微流體陣列的流動通道流體連通的多個反應室；用第二 流體沖洗所述流動通道并置換所述流動通道的第一流體但不置換反應室中的第一流體，所 述第二流體不與所述第一流體混溶；其中每個所述多個反應室中的所述第一流體通過所述 流動通道中的第二流體與每個其它反應室中的第一流體分隔開；以及孵育所述微流體陣 列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室為皮升或飛升體積。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述第一流體是水溶液。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述第二流體是非水流體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述第一流體包含PCR反應混合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述第一流體包含樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室是盲端反應室。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述反應室含有一種或多種預先放置試劑。根據(jù)本發(fā) 明的另一個方面，所述靶核酸在第一流體中為合適的濃度，從而在多個反應室中平均而言 為每個反應室提供少于約一個靶核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述靶核酸在第一流體中為合適的濃度，從而在多個 反應室中平均而言為每個反應室提供少于約0. 5個靶核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，所述孵育步驟包括熱循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了微流體裝置，其包含與彈性體基底中形成的流 動通道相連的多個反應室，以及防止兩個或更多個反應室之間流體連通的流體屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述裝置還包含共面施加于多個反應室并通過彈性體 層與所述反應室隔開的蒸汽屏障。本發(fā)明內(nèi)容不一定描述了本發(fā)明的全部特征。參考下述本發(fā)明具體實施方式
，本 領域技術人員將明了本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點。


從參考附圖的下列說明中，本發(fā)明的這些和其它特征將進一步顯現(xiàn)，其中圖1顯示了微流體裝置制造方法的示意圖。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的微流體陣列示意圖，(a)特征為 1〃 XI" (2. 54cmX2. 54cm)面積中1000000個反應室的微流體陣列，(b)插圖A顯示加樣 區(qū)，(c)插圖B顯示微制造的反應室和進料通道，(d)反應室?guī)缀螛?gòu)造的三維顯示。在該實 施例中，所述室的底面每邊長10微米，高40微米，總體積4皮升(pL)。(e)如(a)所示的 微流體陣列，沒有閥通道，(f)插圖D。(g)如A中所示的微流體陣列，沒有閥通道但包含水 化通道。圖3顯示分隔反應室中流體的示意圖。在(A)中，通道和反應室中充有第一流體 (F1-點)。在(B)中，引導第二流體(F2-方格)流入所述通道，所述第二流體置換所述通道 中的第一流體，但是第一流體仍保留在所述反應室中(由第二流體的流動所“斷開”)。在 (C)中，通道中的第一流體被置換，僅保留在反應室中以及反應室進入通道的一部分中。流 體流動的方向由箭頭顯示。圖4顯示精確度和特異性隨體積縮放的統(tǒng)計曲線，(A)作為室個數(shù)的函數(shù)，使用數(shù) 字化PCR在差異的兩個等位基因測量值的分離的數(shù)值計算。由隨機二項式噪聲(取樣 噪聲)所確定的預計標準差(σ)對差異進行歸一化。針對與50%的反應室中陽性擴增相 對應的模板濃度進行計算。在約1000000個室下實現(xiàn)5 σ的分離。(B)為檢測以百萬分之 一比率存在的稀有種類，作為室體積函數(shù)的特異性和非特異性擴增的效率比的數(shù)值計算。圖5顯示對以每室10個拷貝加載的基因組DNA (陽性對照)和無模板對照(陰性 對照)樣品進行GAPDH擴增的熒光圖像。窄線顯示一組與同一流動通道連接的反應室。粗 線顯示蒸汽屏障的邊界。在裝置的底部可見由于樣品失水導致的擴增失敗的邊緣效應。陽 性對照反應室(區(qū)域A、D和E)中的PCR反應包含靶DNA和用于擴增所需試劑，而區(qū)域B和 C中的陰性對照反應室缺少靶DNA。亮區(qū)顯示靶DNA的成功PCR擴增。圖6顯示本發(fā)明微流體裝置中的PCR反應的擴增曲線。圖7顯示使用本發(fā)明平面乳液陣列的染色體21 (C21)相對于染色體9(C9)增加3 %的檢測結(jié)果。將6 %的三體型2IDNA摻入基因組DNA樣品中，最終導致C21相對于C9增 加3% (實心菱形)。來自染色體正常個體的純化基因組DNA具有1 1的C21 C9比值 (實心正方形)。圖8顯示檢測JAK2中野生型與V617突變體不同比值的測定結(jié)果。將不同量的突 變質(zhì)粒加入恒定量的野生型中(0. 5的填充系數(shù))。(A)顯示獲得的比值(深色條)和理論 比值(淺色條)。(B)顯示與A中相同的比值，但是是0.1%與對照樣品的比值。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及微流體裝置，其包含與彈性體基底中形成的流動通道流體連通的多個 反應室、防止從多個反應室蒸發(fā)的蒸汽屏障以及分隔多個反應室中每一個的連續(xù)相流體。 還提供了使用所述微流體裝置對靶核酸進行數(shù)字化定量的方法?！傲鲃油ǖ馈?一般指可流過流體的通路。“反應室”、“反應孔”或“孔”是發(fā)生化學或酶促反應的有界區(qū)域。其可以由壁以及 一個或多個閥限定邊界?；蛘撸磻铱梢杂杀诤土黧w屏障限定邊界。反應室的“壁”包括 限定該室邊界的所有流體、固體或半固體表面。反應室與一個或多個流動通道相連接；所述 連接包括開口，其允許通過一個或多個流動通道填充和/或排空所述反應室。根據(jù)本發(fā)明 一些實施方案的微流體裝置中的多個反應室可以排布成規(guī)則的陣列，這種排布可稱為微流 體陣列?！胺指舻姆磻摇笔遣慌c另一個反應室或流動通道流體連通的反應室?？梢岳缤?過閥或者通過流體屏障來防止流體連通。例如，所述流體屏障可以是由不與反應室中材料 (通常為另一種流體)混溶的流體形成?！懊ざ朔磻摇笔蔷哂袉蝹€進入端口或開口的反應室，其允許流體進入，但缺少獨 立的出口。“死端(dead end)填充”是在壓力下用流體填充死端或盲端反應室的方法。當流 體開始注入通道結(jié)構(gòu)時，其會沿著阻力最小的通道流動并留下一些未填充或者部分填充的 區(qū)域?？裳芯课⒘黧w制造中所用的一些彈性體材料的透氣性，以允許對死端通道進行填充。 通過閉合所有出口閥并在壓力下注入流體(高達約300psi或約200kPa)，加壓流體填充通 道并壓縮裝置的室或通道中的任何氣體(空氣)。加壓氣體會通過所述彈性體擴散出去，留 下被所述流體填充的末端或盲端反應室?！霸噭睆V義地表示反應中所用的除分析物(例如所分析的細胞、代謝物或核酸) 之外的任何物質(zhì)。用于核酸擴增反應的試劑實例包括但不限于緩沖劑、表面活性劑、金屬離 子、DNA或RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、激酶或磷酸酶、引物、模板或靶核酸、核苷酸、標記、染料、 核酸酶等。用于酶反應的試劑包括如底物、輔因子、緩沖劑、金屬離子、抑制劑和活化劑。用 于基于細胞之反應的試劑包括但不限于上述用于酶反應及核酸檢測的試劑，以及細胞、細 胞特異性染料或與細胞受體結(jié)合的配體(例如激動劑和拮抗劑)。表面活性劑例如吐溫-20 可包含在反應混合物中，以減少試劑在彈性體表面上的吸附。引物是短(通常10-30個核苷酸)核酸或寡核苷酸，其與靶核酸退火并由核酸聚 合酶延伸。引物可以與靶核酸完全互補(引物與靶核酸所有核苷酸之間100%匹配)，或者 可以基本上互補(小于100% )，使得引物在靶核酸的位置選擇性雜交。探針是與靶核酸特異性雜交的核酸序列。所述雜交是可檢測的，例如通過僅在形成雙鏈構(gòu)造時改變熒光特性的熒光標記或染料(例如DNA染料)或者通過熒光(例如分子 信標)。探針可以是任何適當長度，以提供與靶核酸序列的充分互補性并在反應條件下退 火。用于雜交中的探針可包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)探針和肽 核酸。用于鑒定單核苷酸多態(tài)性或其它涉及少量核苷酸突變的雜交方法描述于美國專利 6，270，961 ；6, 025，136 ；和6，872，530。用于本發(fā)明的合適雜交探針包括寡核苷酸、多核苷 酸、LNA和PNA，其長度為約6至約400個核苷酸、約20至約200個核苷酸、或者約30至約 100個核苷酸。寡核苷酸是不同長度的核酸，可用作檢測和/或擴增特定核酸的探針、引物。合 成寡核苷酸的多種方法是本領域已知的，例如參見Bonora GM. etal. Nucleic Acid Res. (1990) 18(11) 3155-9 ；Lashkari DA.等 PNAS(1995)92(17) :7912_5 ;McGall G.等 PNAS (1996)93(24) 13555-60 ；Albert TJ.等 Nucleic Acid Res. (2003)31 (7) :e35 ； Gao X.等 Biopolymers (2004) 73 (5) 579-96 ；和 Moorcroft MJ.等 Nucleic Acid Res. (2005)33(8) :e75). Gait, 1-22 頁；Atkinson 等，35-81 頁；Sproat 等，83-115 頁；和 Wu 等， 135-151 頁，Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, Μ· J. Gait 編輯，1984, IRL Press, Oxford ；或者 Molecular Cloning :a LaboratoryManual 第三版.Sambrook 禾口 Russell. CSHL Press, Cold Spring Harbour, New York。一些核酸或寡核苷酸可含有提供改變或改進的酶穩(wěn)定性或者寡核苷酸中構(gòu)象 限制的單體。例如，雙環(huán)核苷可對寡核苷酸提供構(gòu)象限制，并可提供與未修飾寡核苷酸 相比不同的雜交或穩(wěn)定性譜。LNA核苷是雙環(huán)核苷的一個實例，其具有2' -4'環(huán)鍵，如 US 6，268，490、US 6，794，499、US 7，034，133所述(均通過引用并入本文)。合成和聚 合包含LNA之核酸聚合物的方法描述于例如WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、 WOO1/25248, WO 0148190、WO 02/28875、WO 03/006475, W003/09547, WO 2004/083430、US 6，268，490、US 6，794，499、美國專利 No. 7，034，133?！耙诲伔?one-pot) ”過程或反應是在單個反應室中進行并且沒有多個獨立的試劑 添加和反應步驟的過程。在一鍋法反應中，反應所必需的試劑基本上同時混合在單一反應 介質(zhì)中。例如，一鍋法PCR反應可以將用于擴增反應和檢測的試劑合并在單個反應室中，擴 增和檢測在同一反應室中進行?？梢詫糜跀U增和檢測特異性靶核酸的所有試劑(包 括靶核酸、引物、探針、聚合酶、核苷酸、緩沖液、鹽等)的反應混合物合并，將此單混合物注 入本發(fā)明的微流體裝置。用所述反應混合物充滿全部反應室，分隔所述室并進行熱循環(huán)。特 異性擴增產(chǎn)物的檢測可以在熱循環(huán)進行的同時進行，或在之后進行，或以上兩者均有。作為 一鍋法的變型，可在所述裝置的合成過程中或之后將試劑置于本發(fā)明微流體裝置的反應室 陣列或亞陣列中。將包含其余所有擴增所需試劑的反應混合物注入本發(fā)明的微流體裝置， 最后在反應室中將引物和探針與反應混合物混合。同樣，特異性擴增產(chǎn)物的檢測可以在熱 循環(huán)進行的同時進行，或在之后進行，或以上兩者均有?！傲黧w連通”如果存在連接兩者之間且不留下流體的連續(xù)通路，則微流體裝置的 兩個或更多個元件(例如流動通道、注入口、出口、通路、反應室、入口或其它由邊界限定的 空間)是流體連通的。流體連通可以由屏障、閥、泵或其它控制裝置來調(diào)節(jié)，以允許可控地 中斷流體連通并分隔所述微流體裝置的一個或多個元件。在其內(nèi)具有第一相的第一流體的 兩個或更多個元件之間的流體連通還可由第二相的不混溶流體來介導。當所述不混溶流體引入所述元件之一時，其排出第一流體。例如，在乳液中，該乳液中的連續(xù)相中斷或阻止分 散相微滴的流體連通。在本發(fā)明的一些實施方案中，不混溶流體可以是屏障或閥(“流體屏障”或“流體 閥”)，其介導或阻止本發(fā)明微流體裝置反應室中液滴之間的流體連通。不受理論的限制，本文提供的方法利用了第一流體、一個或多個通道壁或反應室 壁以及與第一流體不混溶的第二流體之間的表面張力，以建立微尺度液滴的規(guī)則陣列，其 位置和大小由微流體通道的結(jié)構(gòu)精確限定。乳液在將兩種不混溶流體相組合時形成，一種流體(分散相)以液滴或膠體的形 式懸于另一種流體中(連續(xù)相)。所述連續(xù)相形成液滴之間的屏障，如果乳液是穩(wěn)定的(防 止液滴聚結(jié))，則每個液滴可以是獨立的反應容器。使用表面活性劑是穩(wěn)定乳液的一種方 式。另一種方式是利用分散相、一個或多個通道或反應室壁與連續(xù)相之間的表面張力，與腔 室化微流體裝置相組合(其允許實現(xiàn)微尺度液滴的規(guī)則陣列，其位置和大小由微流體裝置 的結(jié)構(gòu)精確限定)，從而不允許其互相接觸。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置的結(jié)構(gòu)包含微流體通道的線性陣列，所述 微流體通道通過進入通道與一系列納升(nL)、皮升(pL)或飛升(fL)體積的室相連。將第 一流體(例如包含PCR擴增所需全部組分的測定混合物)首先在壓力下引入流動通道，使 其對所有反應室進行死端填充。環(huán)境空氣被壓入透氣性彈性體裝置體內(nèi)并離開反應室。以 有限稀釋加載的模板分子根據(jù)泊松統(tǒng)計隨機分布于室陣列中。一旦室被填充，則通過流動 通道注入第二流體以代替第一流體。不受理論的限制，相界面前進經(jīng)過每個室，在通道收縮 處產(chǎn)生表面張力驅(qū)動的不穩(wěn)定性，導致水溶液的液滴分離，其位置和體積由室的幾何形狀 精確限定。由于表面張力，這些水性液滴仍被限制于室的大橫截面上，實現(xiàn)了熱循環(huán)過程中 每個液滴的精確定位。多層軟式光刻技術(Multilayer soft lithography, MSL)是軟彈性體加工中公 知的制造技術，其允許靈活且可靠地制造具有成千上萬個微觀反應室、閥、泵、流體邏輯元 件及其它組件的微流體裝置。Xia &ffhitesides, 1998 (Angewandte Chemie-International Edition 37 551-575 ；通過引用并入本文)記載并綜述了用于軟式光刻技術(包括MSL)的 過程、材料和技術。簡言之，多層軟式光刻法(MSL)的一般思想是彼此重疊堆積厚度不同的彈性體 (例如PDMS)層。在獨立的片層上形成化學計量比分別低于或高于10 1的PDMS薄層 和厚層。事先在所述片層上制成的抗光蝕圖案將限定所述裝置的微流體通道。然后，將厚 層從所述片層上剝離，并置于薄片層上。烘烤后，各個層的過量組分將粘合形成由兩層通 道組成的PDMS “芯片”。操作彈性體以及將它們應用于微流體應用的方法是本領域已知 的，參見例如美國專利 No. 6，929，030 ；Scherer 等 Science 2000，290，1536-1539 ；Unger 等 Science 2000，288，113-116 ；McDonald 等 Acc. Chem. Res. 2002，35，491-499 ；Thorsen, T.等，.Science 2002,298,580-584 ；Liu, J.等 Anal. Chem. 2003，75，4718-4723 ;Rolland 等 2004 JACS126 :2322-2323，PCT 公開 WO 02/43615 和 WO 01/01025。多種軟聚合物(一般稱為彈性體)可用于微流體裝置和系統(tǒng)中。彈性體一般具有 大范圍熱穩(wěn)定性、高潤滑性、斥水性和生理惰性的特征。彈性體的其它期望特征可以根據(jù)應 用而不同。針對預期目的選擇適當?shù)膹椥泽w或彈性體組合在本領域技術人員能力之內(nèi)。彈
10性體的例子包括硅氧烷、聚二甲硅氧烷(PDMS)、可光固化全氟聚醚(PFPE)、氟硅酮、聚異戊 二烯、聚丁二烯、聚氯丁烯、聚異丁烯、聚氨酯、聚(苯乙烯_ 丁二烯_苯乙烯)、乙烯基硅烷 交聯(lián)的硅氧烷，等等。彈性體可以是光學上透明的或者不透明的，或者具有不同程度的透 明度。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用生物相容性彈性體可能是理想的。PDMS是最先開 發(fā)且較為廣泛地使用于軟式光刻應用的彈性體之一。盡管在本發(fā)明的多個實施方案中描 述的彈性體為PDMS，但其僅為示例性目的，替代性彈性體的選擇在本領域技術人員的知識 范圍之內(nèi)。適用于微流體應用的多種彈性體以及其多種性質(zhì)和應用實例描述于美國專利 No. 6，929，030。設計在硅片層或其它合適支持物上的抗光蝕劑圖案提供了用于鑄造層的模具。一 般地，抗光蝕劑可分為正性或負性。正性抗光蝕劑能夠?qū)崿F(xiàn)極高的分辨率。它們在堿性溶 液例如KOH中溶解度很高；但是，感光性溶解抑制劑例如重氮萘醌(diazonaphthaquinone， DQ)通常用于阻斷這種作用。與紫外線(UV)的光反應破壞DQ，允許抗光蝕劑溶于顯影液 中。處理此類型抗光蝕劑的思想是除去所有暴露于UV光的部分。正性抗光蝕劑的實例有 SPR220-7(Shipley Company LLC)。負性抗光蝕劑一般包含非感光底物、感光性交聯(lián)劑以及涂覆溶劑。在暴露于UV光 后，交聯(lián)劑被活化，導致形成堅硬的環(huán)氧樹脂。用顯影液洗去抗光蝕劑剩余未曝光的部分。 SU8 (MicroChem)是負性抗光蝕劑的一個例子，其在兩種MSL模具中均可使用。另外，作為環(huán) 氧樹脂的SU8非常堅硬，可抵抗隨后的光刻過程。使用特定抗光蝕劑的詳細方法和技術可 從多個制造商獲得，本文不再贅述。特定抗光蝕劑的例子僅用于說明目的，不認為對本發(fā)明 有限制作用。在制備過程中可將其它組件并入所述微流體裝置中，在MSL過程中可整合微米級 別的閥、泵、通道、流體多路器、灌注腔室等。制備和整合這些組件的方法描述于例如美國 專利 No. 7，144，616,7, 113，910,7, 040，338,6, 929，030,6, 899，137,6, 408，878,6, 793，753、 6，540，895 ；US 專利申請 2004/0224380,2004/0112442 ；PCT 申請 WO 2006/060748。在皮升體積范圍中進行測定時，蒸發(fā)是需要克服的障礙。在制造微流體裝置的過 程中，可將蒸汽屏障引入所述裝置中將放置或傳送流體并且不希望流體損失的反應室和通 道的附近。蒸汽屏障可包含任何適當?shù)牟牧?。適當?shù)牟牧蟽?yōu)選是光學上透明的、不透過水 蒸氣、不與基底反應的，所述基底包括所述微流體裝置和用于測定混合物的流體或者用于 排出流動通道中測定混合物的不混溶的油或流體，并且能夠承受用于制備微流體陣列和使 用它們的測定中的溫度范圍。另外，使用可與所用彈性體結(jié)合的材料是理想的。良好的結(jié) 合可以是彈性體的一種特性，或者可通過施加一個或多個粘合層來實現(xiàn)或者通過材料表面 改性實現(xiàn)(例如，通過暴露于氧等離子體)。合適材料的實例有醋酸酯、聚乙烯或基于聚乙 烯的片、聚二甲苯聚合物(Parylene N, C，D)，其它包括玻璃、硅、石英、云母。也可使用其 它聚合物材料，這些聚合物材料可以以預制膜的形式沉積或者通過其他聚合物加工技術沉 積，例如沉積將凝固成膜的液體(實例包括樹脂制劑、聚合物溶液、前體混合物等)，或者通 過汽相沉積聚合物(例如Parylene)或者通過蒸發(fā)，其中材料在表面上濃縮，或者通過噴涂 氣溶膠，等等。在制造微流體裝置的過程中，將蒸汽屏障與陣列的至少一側(cè)共面地施加或放置。 彈性體層將所述蒸汽屏障與陣列反應室的一個壁隔開，所述彈性體的厚度足以吸收被死端填充所壓入彈性體的氣體。此厚度可以為例如約10至約500 μ m,或者約50至約250 μ m， 或者約75至約225 μ m，或者約100至約200 μ m，或者約125至約175 μ m。不受理論的限 制，此幾何形狀提供了基本為二維的水蒸氣梯度的建立，使得僅僅通過陣列的側(cè)面發(fā)生輸 送(蒸發(fā))O在一個優(yōu)選實施例中，所述陣列兩個平面的側(cè)面都有蒸汽屏障。在本發(fā)明的一些 實施方案中，微流體陣列位于硅基底(所述陣列的底部)與所述陣列上方的醋酸酯或聚乙 烯片之間，對于利用如所述設置的兩個蒸汽屏障的裝置，所述屏障可分開任何適當?shù)木嚯x， 其根據(jù)反應室的高度和任何位于反應室陣列之上或之下的流動通道、閥等額外層的存在情 況而不同。制造過程的簡單示意圖顯示于圖1。(A)使用標準軟式光刻技術將模構(gòu)造 (feature) 120鑄造于晶片121上。(B)將液體PDMS置于晶片頂上并部分硬化，使得其厚度 略高于所述構(gòu)造的高度。(C)將蒸汽屏障123施加于PDMS層122頂上，并覆蓋PDMS第二層 124。(D)在脫氣和烘烤之后，將所述裝置從模上剝離，在固化的PDMS上留下負印。參照圖2a_d，根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的裝置示意圖一般性地顯示于100。圖2b 顯示圖2a的A插圖；圖2c顯示圖2d的B插圖；圖2d顯示反應室114的三維圖，為圖2c的 插圖C。該示例性裝置包括與用于加載反應室114的一系列級聯(lián)流動通道105、107、109流 體連通的13條一級流動通道103。每個一級流動通道提供了亞陣列，可以載入包含反應混 合物、樣品等的流體，并且可以獨立于流動通道，從而使得能夠在同一裝置上加載和處理多 于一種的樣品或者對相同樣品進行多于一種的反應。閥流動通道102a、102b與主流動通道103相交，其位于反應室陣列的側(cè)面。來自 注入口 104的流體流動由閥108調(diào)節(jié)；閥108由閥流動通道102a、b中的流體壓力打開或 關閉。沿著閥流動通道102a的所有閥可以由注入口 106a同時操作；沿著閥流動通道102b 的所有閥可以由注入口 106b同時操作。反應室114通過反應室進入通道112與反應室流 動通道110流體連通。在圖2c和2d中所示的實施方案中，反應室114是盲端室，其具有單 個填充口而沒有獨立的出口。圖2d中舉例說明的反應室114高度大于寬度，其在反應室底 部具有進入流動通道。反應室的其它構(gòu)造是可能的。例如，例如圖2d中所示的反應室可具 有小“著地”面積(寬X長)，而高度大于寬度或長度。此類“垂直”構(gòu)造可提供更大的樣 品體積并使得所述室的面密度盡可能大。更大的反應體積可允許在反應室中包含更大量的 熒光團(或其它檢測標簽或信號產(chǎn)生試劑)，由此產(chǎn)生更強的檢測信號。參照圖2e和2f，130 一般性地顯示了缺少閥通道102a、b、閥108和閥流動通道 106a、b的本發(fā)明一個替代性實施方案的示意圖。圖2f顯示圖2e的插圖D，圖2f的插圖B 如圖2c中所示。用于加載反應室114的流動通道103、105、107、109如上所述。獨立于閥流動通道和主流體通道進行填充和操作的水化通道可包含在陣列的外 圍，以對接近陣列邊緣的反應室進行水化。參照圖2g，本發(fā)明一個替代性實施方案的示意 圖一般地顯示于140。此實施方案包含如圖2a-d和e-f所示的注入口 104和流動通道，還 包含水化通道142和端口 144。水化通道142在主流動通道103上方或下方的層中形成， 通過足夠厚的彈性體與流動通道和反應室(包括主流動通道103)分隔開，從而使得水化通 道中的流體流動和加壓顯著限定主流動通道103或流動通道105、107或109中的流體流動 (未顯示)。術語“顯著限定”(或類似術語)用于表示與水化通道不包含流體或者在處于壓力之下時流入、流向或流經(jīng)流動通道或反應位置的流體流動相比，流入、流向或流經(jīng)流動 通道或反應室的流體流動減少不超過40%、通常不低于30%，優(yōu)選低于20%或者更優(yōu)選低 于10%。水化通道142可以具有與流動通道103、105、107或109大致相同的內(nèi)徑。本領域技術人員了解，本文公開的多種特征可以合并到本發(fā)明的一些實施方案 中。例如，微流體裝置可包含如圖2a和b所示的閥流動通道，以及水化通道。還考慮了水 化通道的其它構(gòu)造；例如可沿微流體裝置的邊緣放置一系列分離的水化通道。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的裝置可以制造成包含多個獨立的注入口，其每個與獨 立的部分或亞陣列相接，高密度陣列允許在單個裝置上使用空間多重法進行多樣品分析。 例如，約1000000個反應的陣列可分為40個獨立的部分，每個部分由約25000個反應室構(gòu) 成。與每個獨立亞陣列相接的獨立注入口使得能夠?qū)嵤┒鄻悠贩治觥？蓪㈩A加載策略應用于陣列上限定區(qū)域內(nèi)的空間多重性獨立測定。簡言之，可使 用一個或多個閥分隔陣列上的部分，在其中可死端載入溶液中不同的試劑組(例如不同的 引物和/或探針組)。隨后，可用空氣沖刷流動通道以除去過量的試劑，將所述裝置在約 80°C下孵育以從反應混合物中蒸發(fā)水，在陣列中限定的部分中留下干燥引物和探針。使用 這些預加載裝置，可將包含溶液中靶核酸的樣品引入陣列的所有反應室，并分析多種靶核 酸(例如對于具有40個獨立部分的陣列，可分析高達40種不同的靶核酸)。在圖2a_d中舉例的裝置中，閥流動通道提供了位于裝置邊緣的閥。如圖2e_g中 所示，也可使用微流體裝置的閥實施方案。在這些實施方案中，可通過微流體裝置外部的閥 控制流入、流出和流經(jīng)流動通道或水化通道的流體。為了將反應混合物(第一流體)載入反應室，用通過注入口 104注入的第一流體 (F1，圖3)對反應室(114)進行死端填充。這樣，所有反應室通過反應室進入通道與流動通 道流體連通。隨后，將第二流體(F2)注入到注入口，隨著其通過流動通道流動，F(xiàn)2排出F115第一流體可以是水溶液，例如用于測定中的反應混合物。例如，對于聚合酶鏈式反 應(PCR)測定，第一流體可包含PCR必需的所有試劑——模板核酸、核苷酸、引物、合適的核 酸聚合酶、緩沖劑、鹽。根據(jù)所述測定的預定用途，第一流體還可包含染料、標記、探針或用 于檢測PCR測定產(chǎn)物的其它試劑。第二流體與第一流體不混溶，并且也與構(gòu)成微流體裝置 的材料相容。第二流體可以是與制造裝置的PDMS彈性體相容的油，例如氟化油?！跋嗳荨北?示第二流體不以有害方式與裝置相互作用或反應，例如，彈性體在暴露于該流體時不吸收 流體或膨脹，并且所述裝置的物理性質(zhì)不變(彈性或剛性基本不變)。可用于包含PDMS的 微流體裝置的第二流體的實例包括全氟己烷(Fluorinert )、氟化硅氧烷油類、氟化油類 (例如FC40, FC43，F(xiàn)C70, FC-72，F(xiàn)C-77，F(xiàn)C-84，F(xiàn)C-87等，可得自3M或其它供應者)以及高 分子量油類例如石蠟油。反應室的具體尺寸和密度以及本發(fā)明微流體裝置的其它特征僅受限于多層軟式 光刻(MSL)法本身的限制。目前的MSL方法通常能夠制造小至Ιμπι的構(gòu)造。例如，本發(fā)明 的微流體裝置可包含數(shù)量為約50000至約108或其間任何量、或者約100000至約5χ106或 其間任何量、或者約200000至約2X IO6或其間任何量、或者約250000至約IO6或其間任何 量的反應室陣列，其取決于裝置的總尺寸。反應室的密度可以通過單位面積上的數(shù)量來表示。例如，一些裝置可具有以下 反應室密度每平方厘米約1000至約2Χ106或其間任何量，每平方厘米約5000至約IO6
13或其間任何量，約10000至約500000或其間任何量。例如，反應室的密度可以為每平方 厘米約 1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、 30000,35000,40000,45000,50000,100,000,150, 000,200, 000,250, 000,300, 000、350000、 400，000,450, 000,500, 000,550, 000,600,000,650,000,700,000,750,000,800,000、 850，000,900, 000,950, 000,1, 000，000,1, 050，000,1, 100，000,1, 150，000,1, 200，000、 1，250，000,1，300，000,1，350，000,1，400，000,1，450，000,1，500，000,1，550，000, 1，600，000,1，650，000,1，700，000,1，750，000,1，800，000,1，850，000,1，900，000, 1，950，000,2, 000，000?？芍糜谖⒘黧w裝置中的反應室的密度也可不同。例如，具有約10微米間距的5 μ m3 反應室代表每平方厘米IO6個反應室的總密度(每個室約125fL)。所述室的間距會隨著裝 置的預定用途而不同；較大的間隔可能是需要較大體積的反應所必需的(例如，如果將整 個細胞置于反應室或者如果靶分子不能使用便利方法充分濃縮)。對于一些微流體裝置，間 距可能必須根據(jù)經(jīng)驗確定，對最佳間距的確定在本領域技術人員能力范圍內(nèi)。例如，間距可 以為約1至約1000 μ m或其間任何量，約2至約80 μ m或其間任何量，5至約60 μ m或其間 任何量，約10至約40 μ m或其間任何量，約20至約50 μ m或其間任何量。例如，間距可以 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95 或 100 μ m。小體積液滴中單個顆粒的區(qū)室化使該顆粒、細胞或分子的有效濃度能夠很高。區(qū) 室化的一個方法是利用乳液，其中水性液滴在至少一側(cè)被第二液相例如油所分離。根據(jù)本 發(fā)明一些實施方案的包含具有限定的微腔室(反應室)的流體通道的微流體裝置允許形 成具有規(guī)則空間排列的平面(2維乳液)，不需要閥來限定反應室，因此消除了它們可能對 反應室陣列中間距和反應室密度產(chǎn)生的限制。在與擴增方法聯(lián)用時，這種濃度增強允許對 單分子進行計數(shù)，即數(shù)字化定量。不受理論的限制，通過此類區(qū)室化對生物物質(zhì)濃度的提 高提供了提高檢測和測定靈敏度的手段。所述顆粒的濃度可表示為相對于每個陣列孔的平 均數(shù)。例如，在每個孔平均含有1個顆粒的反應室陣列中，一些反應室可含有0個，一些可 含有1個，而一些可含有兩個或更多個顆粒。又例如，在每個孔平均含有0. 1個顆粒的反應 室陣列中，大多數(shù)反應室預計含有0個顆粒，約10%的預計含有1個顆粒，極少數(shù)可含有2 個或更多個顆粒。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述顆?？梢匀缦旅總€反應室的平均濃度 提供約 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1· 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7、 1. 8、1· 9、2· 0、2· 1、2· 2、2· 3、2· 4、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、 3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0 或其間任何量。顆?？梢允强闪鬟^微尺度系統(tǒng)的任何離散物質(zhì)。示例性顆粒包括珠、核酸、靶 核酸、蛋白質(zhì)、生物細胞、分子等。例如，可以使用聚合物珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、 乳膠、尼龍等)、二氧化硅或硅珠、粘土或粘土珠、瓷珠、玻璃珠、磁珠、金屬珠、無機化合 物珠和有機化合物珠。許多種顆粒是市售的，例如，通常用于色譜的那些(參見，例如 1999 Sigma “ Biochemicals and Reagents for Life Sciences Research " Catalog fromSigma (Saint Louis，Mo.)，例如 1921—2007 頁；1999 Suppleco" Chromatography Products" Catalogue等)，以及常用于親和純化的那些(例如來自Dynal的Dynabeads.
14TM,以及許多衍生的珠，例如多種衍生的Dynabeads. TM.(例如多種磁性Dynabeads. TM.，其 通常包含偶聯(lián)試劑)，例如由Promega，Baxter Immunotherapy Group以及許多其它來源提 供的)。例如，含有單個DNA分子的1微升體積溶液的區(qū)室化具有IO6L4的濃度。將此溶 液區(qū)室化成各為1皮升體積的1000000個液滴得到999999個濃度為0的液滴以及1個有 效濃度為IO12L-1的液滴，增強了 1000000倍。在另一個實例中，本發(fā)明的微流體裝置可用于 將反應室中的細胞區(qū)室化(例如約IOOpL的體積)。單細胞的分離使得細胞對其環(huán)境施加 大的影響，并分泌充分濃縮足以用于檢測的分子。皮升(pL)體積液滴具有大的表面積體積比，熱循環(huán)過程中的試劑蒸發(fā)可破壞單 分子的可靠擴增，這一現(xiàn)象在由已知具有非常高透氣性的PDMS制成的裝置中特別嚴重。這 種蒸發(fā)在平面乳液陣列中可能是明顯的，在所述陣列中垂直于平面的方向上具有顯著的梯 度。為了控制這種蒸發(fā)，可將蒸汽屏障嵌入所述裝置中并位于陣列的側(cè)面。這樣，除去了 垂直于陣列平面的梯度蒸發(fā)損失，使得可以在PL體積反應中成功擴增靶核酸。“皮升體積” 通常描述小體積，其為約1至約IOOOpL或其間任何量、約1至約500pL或其間任何量、約1 至約200pL或其間任何量、約1至約IOOpL或其間任何量、或約1至約50pL或其間任何量。 例如，本發(fā)明微流體裝置形成的反應混合物的體積或者本發(fā)明方法所用的反應混合物的體 積可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、 230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950 或 1000pL。根據(jù)本發(fā)明的多個實施方案，亞皮升反應體積也可以是實用并且可用的。如所討 論的，常規(guī)平版印刷制造技術可實現(xiàn)小至1微米的構(gòu)造，因此能夠限定具有飛升至皮升級 體積的室。例如，微流體裝置中Iym3的室將具有約1飛升(fL)的體積；約5 μ m3的室將 具有約125fL的體積。亞皮升體積一般描述約1至約IOOOfL或其間任何量、10至約500fL 或其間任何量、或100至約500fL或其間任何量的小體積。例如，本發(fā)明微流體裝置形成的 反應混合物體積或者本發(fā)明方法中使用的反應混合物體積可以是約1、5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、 145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950 或者 IOOOfL0或者，反應室可通過其立方微米體積或類似維度而不是由液滴體積來描述。確定 單位之間的必要轉(zhuǎn)換在本領域技術人員的能力范圍之內(nèi)，例如從立方微米至皮升，等。除了限制或防止反應室中的反應混合物蒸發(fā)之外，還控制反應條件。如果在控溫反應中利用所述裝置(例如在一個或多個溫度下孵育一段時間，作為 單次孵育或一系列循環(huán)溫度，例如PCR或其它擴增或延伸反應中所用的熱循環(huán))，則可以 將彈性體裝置固定在支持物上，例如玻璃載玻片或硅片。所述裝置可置于溫度和/或環(huán)境 受控孵箱中，或者對于熱循環(huán)反應，所述裝置可置于任何數(shù)量的熱循環(huán)板上。用于熱循環(huán) 的裝置是已知的，并且是可獲得的。一般來說，包含反應室陣列的微流體裝置可置于熱循 環(huán)板，以實現(xiàn)反應的熱循環(huán)。多種此類熱循環(huán)板可獲得自商業(yè)來源，例如BioRad、Thermo、Eppendorf, Techne, Applied biosystems等等?；蛘撸鲅b置的基底可含有主動加熱元 件和溫度傳感元件，以提供必要的熱循環(huán)條件。例如硅基底中加熱器和溫度傳感器的制造 是本領域已知的。對于PCR來說，熱循環(huán)需要對溫度和反應物在特定溫度下孵育的時間這兩者進行 精確控制。模板或靶核酸變性、退火和延伸的溫度范圍根據(jù)所進行的具體擴增反應、所用引 物的互補性、靶核酸的組成以及所選的具體聚合酶而不同。其它擴增方法可能不需多輪熱 循環(huán)，但是仍可能受益于反應條件的溫度和時間調(diào)節(jié)。例如，多種等溫核酸擴增策略例如滾 環(huán)擴增是已知的，并且包括在本發(fā)明中。監(jiān)測所述裝置和反應室之溫度特征的能力也是有用的。可將傳感器引入所述微 流體裝置中，例如熱電偶或熱敏電阻或熱電傳感器?？赏ㄟ^使用紅外照相機或使用熱變 色材料監(jiān)測溫度。這些及其它用于監(jiān)測微流體裝置中溫度特征的方法描述于美國專利 No. 7，118，910。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置和方法的應用多且各有不同。本文所述的 微流體裝置和方法的用途或應用以及包括用途或應用的方法不限于任何特定申請或其用 途。在本發(fā)明的一些實施方案中，考慮下列用途和應用。樣品、測定和測定條件存在眾多可應用本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置的測定和用途。這些用途的綜 述以及方法和方案的參考文獻和公開在PCT公開W000/50172中提供。本文舉例的所選測 定用于說明性目的，而不認為具有限制性。單細胞測定?；谖⒘黧w的單細胞分析可用于多種目的，例如細胞分選、核酸純化 和擴增、膜片鉗、鈣流量測定以及全細胞電泳。另外，在微流體裝置中對一個或少量單細胞 進行捕獲和成像可用于監(jiān)測細胞對不同濃度的一種或數(shù)種化學刺激的反應。微流體裝置或包含此類裝置的系統(tǒng)可提供用于以允許隨后進行刺激和分析的形 式分選和捕獲細胞亞群的細胞操作能力。此類系統(tǒng)可允許從群體中選擇單個細胞、將該細 胞捕獲至可尋址室陣列中的任何位置、應用一種或多種反應條件以及對每個反應室成像。 此功能可提供對多個單細胞進行化學遺傳學研究的工具?；诩毎奈⒘黧w測定的實施例 描述于例如PCT公布WO 98/00231和WO 98/45481。基于細胞的微流體測定可用于篩選細 胞配體(例如受體配體、藥物、輔因子等)的結(jié)合和/或內(nèi)化。本發(fā)明一些實施方案的微流體陣列中的顆粒可存在固體或半固體表面，用于連接 多種連接化學物質(zhì)中的任意種，從而允許將目的生物及化學組分并入陣列的顆粒成員中。 多種天然和合成的有機及無機聚合物可用作固體表面材料。示例性聚合物包括聚乙烯、聚 丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、人造絲、尼龍、 聚丁酸乙烯酯、聚二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素等。很 多種連接化學物質(zhì)可用于將分子連接到多種固體或半固體顆粒支持元件上。本領域技術人 員了解并且可根據(jù)預定應用容易地選擇合適的化學物質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置可用于結(jié)構(gòu)生物學應 用，例如蛋白質(zhì)晶體學。可用于此類應用的方法和技術描述于例如Hansen & Quake，2003. Current Opinion in Structural Biologyll3 538-544 ；Hansen et al,2006. J Am Chem Soc. 128 3142-3143 ；美國專利 no. 7，217，321。
根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置可適用于包括篩選其它生物學組分的用 途，所述組分包括細胞、抗體、抗體配體、蛋白質(zhì)、肽等。也已知此類細胞、抗體和抗體配體的 存在與否與希望或不希望的特征相關聯(lián)。可將樣品的有限稀釋物施加到微流體裝置并使其 流入反應室，并如所述以流體屏障將室分隔開。應用之前，可將樣品與標記物合并，例如標 記抗體(例如具有熒光標簽)或類似標記物。分隔后，可通過篩選標記物的存在情況來研 究各個室是否存在生物學組分。篩選測定、免疫測定、蛋白質(zhì)鑒定測定等的實例記載于例如 美國專利 No. 6，632，655。測序、多態(tài)性的鑒定。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的微流體裝置可用于核酸測序，特 別是產(chǎn)生測序文庫。給待測序DNA (靶核酸)提供聚合酶和引物以及其它必需試劑，然后每 次暴露于一種類型的DNA堿基(A、C、T或G)以快速測定堿基摻入。下文描述了多種用于確 定核苷酸序列的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的微流體裝置可用于對核酸測 序。本發(fā)明的裝置任選地包含實施生物學或化學測定的試劑(其可以是陣列的一部分或者 流入與陣列相接觸，例如在試劑列中)。用于測序的反應混合物可包含一些或所有核苷酸、 聚合酶、dNTP、ddNTP、dNTP類似物、熒光dNTP、或熒光dNTP、無機磷酸鹽、ATP、熱穩(wěn)定聚合 酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、磷酸酶、嵌入式染料、標記探針、還原劑、Mg++、分子擁擠劑(例 如PEG)、緩沖液、鹽、DTT、BSA、去污劑或表面活性劑、抑制或提高電滲流動的化學物質(zhì)(例 如聚丙烯酰胺)等。下文描述了分析靶核酸的其它方法。靶核酸是包含一個或多個目的序列的核酸?？蓹z測樣品或反應混合物中靶核酸的 存在情況，根據(jù)試驗設計，也可對其進行定量。靶核酸可獲得自生物樣品(“樣品”)?！岸鄳B(tài)性”是群體中存在兩種或更多種形式的靶核酸。多態(tài)性位點可以在核酸序 列中已知的位置，或者可使用本文所述方法確定存在于靶核酸中?；蛘?，多態(tài)性可以描述為 序列變異或序列變體；如果在DNA中，為“DNA序列變異”；如果在RNA中，則為“RNA序列變 異”。單核苷酸多態(tài)性(或SNP)是由單個堿基變化組成的多態(tài)性。組織樣品可通過例如刮取、針吸活組織檢查或針刺(核芯)活組織檢查、用以對組 織取樣的切取活組織檢查、或者切除活組織檢查來獲得，可能需要整個去除目的組織。或 者，使用本領域已知的方法，可使用含有遺傳物質(zhì)的其它身體樣品，例如毛發(fā)、血、血漿、血 清、痰、尿、大便、精液、羊水、絨毛膜絨毛或其它胎兒或胚胎組織。DNA和RNA可通過本領域已知的任何方法分別或共同分離自生物樣品。方法 的選擇可取決于待測定的核酸(DNA或RNA)、用于測定的方法等。從生物樣品中分離 DNA和RNA的方法是本領域已知的，例如Sambrook J.等〃 Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)以及 Ausubel, FM 等"Current Protocols in MolecularBiology “ ， John Wiley & Sons， Inc. (1994), Botwel1, DDL. Anal. Biochem. (1987) 162 463-465)；美國專利 5，130，423 ；美國專利 5，945，515 ；美國專利 5，989，431 ；美 國專利5，128，247。在一些情況下，例如單細胞的分析，可不需要在分析前純化DNA或RNA?？赏ㄟ^本領域已知多種方法中的任意方法擴增樣品中靶核酸的特定序列，所述 方法例如降落PCR(touchdown PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、聚合酶鏈式反應 (PCR)、反向PCR、轉(zhuǎn)錄介導擴增(TMA)、巢式PCR、連接酶鏈式反應(LCR)、基于核酸序列的擴 增(NASBA)等。參見，例如 Compton J. 1991. Nature. 350 :91_92 ；Malek等，1994. MethodsMolBiol 28 :253_60；Innis等(eds.)PCR Protocols :A Guide to Methodsand Applications, 60-66 頁，San Diego, CA, Academic Press, Inc. , 1990 ；Roux K. , 1994. Biotechniques 16 812-4 ；HeckerK 禾口 Roux，L. ，1996 ；Biotechniques 20 478-85 ；Ochman 等，1988. Genetics 120 621-3 ；美國專利No. 5，299，491。這些參數(shù)、方法和試劑的選擇以及針對具體反應條件 對其進行優(yōu)化的方法在本領域技術人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明微流體裝置的高密度反應室陣列還允許在單個裝置上分析多個靶核酸或 者多個樣品或其兩者。例如，約1000000個反應的陣列可分為40個獨立的部分，每個部分由 約25000個數(shù)字化PCR室構(gòu)成。包含與獨立亞陣列相接的獨立注入口使得能夠?qū)嵤┒鄻悠?分析。在另一個實例中，可將預加載策略用于陣列所限定范圍內(nèi)的空間多重性獨立測定。微 閥可用于分隔陣列的部分，不同的引物和探針組可按照所述死端加載到所述部分中。隨后， 可用空氣沖刷流動通道，以除去過量的測定混合物，孵育預加載的裝置(例如在約70-80°C 下)以使得預加載測定混合物中的試劑脫水，在預定部分中留下干燥的引物和探針。在此 脫水步驟之后，如上所述將包含一種或多種靶核酸及其它PCR必需的試劑(但不包含已經(jīng) 預加載的引物和探針)注入到微流體裝置的一種或多種亞陣列中，使脫水的試劑再水化。 隨后，沖刷流動通道，以分隔反應室，使反應進行熱循環(huán)。在擴增反應期間或之后可監(jiān)測擴 增產(chǎn)物。在另一個實例中，可在單個反應中檢測和定量兩種或更多種擴增產(chǎn)物。這可以通 過將用光譜不同的熒光團標記的多種序列特異性熒光探針摻入反應混合物中來實現(xiàn)。這種 形式的多重性增加了可在單個樣品中測定的靶核酸數(shù)，通過允許以參照核酸對結(jié)果進行歸 一化而在一種或多種靶核酸的定量分析中具有重要作用。檢測靶核酸或者其擴增產(chǎn)物也是有用的。多種策略可用于本文所述的微流體裝置 和方法中；對合適系統(tǒng)的選擇取決于反應的具體情況、檢測系統(tǒng)和試劑與反應條件產(chǎn)物的 兼容性、反應數(shù)的規(guī)模(例如反應室的數(shù)目、密度)以及是在測定過程中還是在終點監(jiān)測靶 核酸或其擴增產(chǎn)物。待檢測的信號類型可包括選自下列的類型熒光團、生色團、化學發(fā)光、 比色反應、放射性、來自酶促反應的底物等。用于檢測信號的示例性方法包括激光共聚焦顯微術、共振能轉(zhuǎn)移(resonance energy transfer, RET)、焚光共才辰能轉(zhuǎn)移(f luorescentresonance energy transfer, FRET)、生物發(fā)光共振能轉(zhuǎn)移(bioluminescent resonance energy transfer, BRET)、閃爍 檢測、熒光相關光譜術、光散射、光吸收(UV或可見光)、反射率等?？赏ㄟ^例如雙鏈核酸特異性染料的攝入或者通過所擴增核酸部分與探針的雜交 來確定靶核酸或其擴增產(chǎn)物的存在情況。只在結(jié)合雙鏈核酸時發(fā)熒光的DNA染色染料可用于檢測擴增產(chǎn)物。這些染料 的實例包括 SYBR Green I、II，SYBR Gold, Y0(噁唑黃)、TO(噻唑橙)、PicoGreen(PG) (可得自 Molecular Probes, Invitrogen)、溴化乙錠、碘化丙錠、Hoechst 33258, Hoechst 33342，DAPI等。關于DNA染色染料的其它討論可見于例如Glazer等，1997. Curr Opin Biotechnol8 :94_102 ；以及 Glazer, AN 和 Rye, HS. 1992. Nature 359 :859_61，Higuchi 等， BioTechnology 10 :413_417?！胺肿有艠恕笔菃捂湽押塑账?，其除非與靶核酸雜交，否則會以發(fā)夾構(gòu)型存在。所述 寡核苷酸的第一端連接有熒光染料，第二端連接有猝滅分子。在發(fā)夾構(gòu)型中，熒光被臨近的猝滅分子猝滅，觀察不到熒光。一旦寡核苷酸“信標”與靶核酸雜交，所述熒光染料與猝滅 分子充分分離，可檢測到熒光。通過監(jiān)測染料的發(fā)光變化，可以間接監(jiān)測擴增產(chǎn)物。足以指 導本領域技術人員的其它細節(jié)可見于例如PCT公布WO 95/13399，Tyagi S等人1998. Nat Biotechnol 1 49-53 ；Tyagi S 禾口 Kramer FR. 1996 NatBiotechnol 3 303-8 ；以及 Marras SA 等，1999. Genet Anal 5-6:151-6。熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)是供體熒光團和受體熒光團對之間的距離依賴性相互作 用，對其進行選擇以使得供體發(fā)射光譜覆蓋受體的激發(fā)光譜。當熒光團足夠接近時，第一確 定波長對供體熒光團的激發(fā)從供體轉(zhuǎn)移到受體，可檢測到第二確定波長的熒光。對于核酸 雜交的檢測，用供體/受體對的一個成員標記特異性探針，用所述供體/受體對的另一個成 員標記核苷酸。在游離于溶液中時(例如在核酸聚合反應或者雜交發(fā)生之前)，所述供體/ 受體對距離足夠遠以防止能量轉(zhuǎn)移。隨著聚合反應的進行，帶標記的核苷酸將被摻入分子 中，與帶標記的引物充分接近，使得可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，檢測到熒光?？捎糜跈z測靶核酸中多 態(tài)性的方法實例描述于例如美國專利No. 6，500, 650，美國專利No. 5，945，283美國專利公 開 2004/0005613 和 WO 97/22719?？墒褂脤崟r定量PCR通過測定擴增期間和/或之后形成的擴增產(chǎn)物的量來確定樣 品中靶核酸序列的量。市售TaqMan 測定(AppliedBiosystems)基于Taq聚合酶的5'核 酸酶活性，其取代并切割與靶DNA結(jié)合的寡核苷酸探針，產(chǎn)生熒光信號。必須有兩種在多態(tài) 性位點上有差異的探針，其中一種探針與“正常”序列互補，另一種與目的突變互補。這些 探針具有連接到5'端的不同熒光染料以及連接到3'端的猝滅劑，在探針完整時，猝滅劑 通過熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)與熒光相互作用以使探針的熒光猝滅。在PCR退火步驟過程 中，雜交探針與靶DNA雜交。在延伸步驟中，Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割5'熒光染 料，導致報告染料的熒光增加。錯配探針被取代而不發(fā)生斷裂。通過測定兩種不同染料的 信號強度來確定樣品中突變的存在。參見美國專利No. 5，210，015,5, 487，972。侵入性切割方法利用了稱為Invader 探針的寡核苷酸以及與具有單核苷酸 重疊的與靶DNA退火的序列特異性探針。當所述序列特異性探針與多態(tài)性堿基互補時， 侵入寡核苷酸的3'端重疊形成被Flap核酸內(nèi)切酶識別并切割的結(jié)構(gòu)，釋放等位基因 特異性探針的5'臂。足以指導本領域技術人員的其它細節(jié)由例如下列所提供，Neri B.等 2000. Advances inNucleic Acid and Protein Analysis 3826 :117_125，美國專利 No. 6，964，848。也可使用包括使用Scorpion探針系統(tǒng)的測定。這些探針和系統(tǒng)描述于例如 Nucleic Acids Research 200028 :3752_3761 和 PCT 公開 W099/66071。引物延伸反應(即微測序，核苷酸特異性延伸或者簡單PCR擴增)也可用于序列 鑒別反應，以鑒定靶核酸中的多態(tài)性。例如，在微測序反應中，引物與其靶核酸(通常為 DNA)中在緊鄰SNP的上游退火，延伸與多態(tài)性位點互補的單個核苷酸。在所述核苷酸不互 補時，不發(fā)生延伸。寡核苷酸連接測定(Oligonucleotideligation assay，0LA)需要每個 SNP 的兩種序列特異性探針和一種共用連接探針。所述共用連接探針在序列特異性探針鄰 近處雜交，在合適的序列特異性探針完全匹配時，所述連接酶將序列特異性探針與共用 探針連接。在沒有完全匹配時，連接酶不能將序列特異性與共用探針相連接?？衫?br> 19通過酶免疫測定來檢測所述探針的退火(Villahermosa ML. J Hum Virol (2001)4(5) 238-48 ；RomppanenEL. Scand J Clin Lab Invest(2001)61(2) 123-9 ；Iannone MA.等 Cytometry(2000)39(2) 131-40)。連接-滾環(huán)擴增(Ligation-RollingCircle Amplification, L-RCA)也已成功用 于對單核苷酸多態(tài)性進行基因分型，如Qi X.等Nucleic Acids Res (2001) 29 (22) =E 116 所述。Sanger 測序(Sanger 等，1977 PNAS 74 :5463_5467)利用 DNA 聚合酶合成多種 長度的序列依賴性片段。所述片段的長度由雙脫氧核苷酸堿基特異性終止子的隨機摻入 決定。然后，可在凝膠中分離這些片段、顯影并確定序列。已經(jīng)完成了許多改進以精制 上述方法以及使測序方法自動化。類似地，RNA測序方法也是已知的，參見例如Zimmern D.和 KaesbergP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 (9) :4257_4261)以及 Mills DR.和 Kramer FR. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 (5) :2232_2235)。用于 RNA 測序的直接化 學方法也是已知的(Peattie DA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 (4) 1760-1764)。其 它方法包括 Donis-Keller 等(1977，Nucl. Acids Res. 4 :2527_2538)，Simoncsits A.等 (Nature (1977) 269(5631) 833-836), Axelrod VD.等(Nucl. Acids Res. (1978)5(10) 3549-3563)，以及 Kramer FR.和 Mills DR. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 (11) 5334-5338)的方法。也可通過用激光激活被切割核苷酸的天然熒光來讀取核酸序列，同時單核苷酸包 含在熒光增強基質(zhì)中(美國專利5，674，743)。在微測序反應中，DNA聚合酶將與鄰近SNP 的靶DNA退火的引物延伸與多態(tài)性位點互補的一個核苷酸。該方法基于DNA聚合酶核苷酸 摻入的高準確度。分析引物延伸產(chǎn)物有不同的技術。例如，根據(jù)為檢測產(chǎn)物所選擇的方法， 在微測序反應中使用帶標記或未標記的核苷酸，與dNTP組合的ddNTP或者僅使用ddNTP。模板引導法。在一個實施例中，模板引導的染料終止子摻入和熒光極化檢測 (template-directed dye-incorporation with fluorescentpolarization, TDI-FP)方法 描述于 Freeman BD 等(J Mol Diagnostics (2002) 4 (4) :209_215)，用以大規(guī)模篩選；5 ‘核 酸酶測定可用于對單核苷酸多態(tài)性進行基因分型(Aydin A.等Biotechniques (2001) (4) 920-2，924，926-8.)；如WO 0181631所述聚合酶校正法可用于確定SNP的身份；通過酶擴 增電子傳導對單堿基對DNA突變的檢測描述于Patolsky F等NatBiotech. (2001) 19 (3) 253-257。序列特異性PCR法也已成功用于單核苷酸多態(tài)性的基因分型(Hawkins JR.等Hum Mutat (2002) 19(5) :543_553)?；蛘?，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Stranded Conformational Polymorphism, SSCP)測定或切割酶片段長度多態(tài)性(Cleavase Fragment Length Polymorphism, CFLP)測定可用于檢測如本發(fā)明所述的多態(tài)性。微流體裝置的應用所述包含皮升或飛升反應室陣列的微流體裝置可用于生物測定和診斷。例如，使 用成千上萬至數(shù)百萬個反應的核酸數(shù)字化定量提供了以下獨特能力(1)以高統(tǒng)計學能力 區(qū)分非常小的等位基因失衡，(2)在單個分子上在長基因組距離中對靶序列進行共定位，以 及(3)在高度同源性遺傳背景下檢測稀有事件。數(shù)字化PCR測定的動態(tài)范圍可描述為濃度相對于預計陽性反應數(shù)隨著模濃度線性增加的濃度范圍。不受理論的限制，分子在整個陣列上的分布是隨機的，使得觀察到線性 響應，直至每個室的平均占據(jù)達到1，導致飽和。因此，數(shù)字化陣列的動態(tài)范圍隨著室的總 數(shù)相應地變化。皮升體積區(qū)室化提供了可用于在高序列同源性大背景下檢測稀有序列的濃 度的有效增強。為了說明這一點，考慮進行在野生型背景下1個拷貝Λ百萬的相對濃度下 (1千萬野生型背景下10個拷貝的SNP)檢測10個拷貝單核苷酸多態(tài)性(SNP)的情況。在 此條件下，即便是微小量的野生型序列非特異性擴增也可能導致假陽性，使得任何PCR方 法難以或者不可能進行檢測。但是，將該樣品分配到1000000個室，得到平均每個反應室10 個拷貝的野生型序列。這些反應室中的大多數(shù)將不含有靶序列，而剛好10個反應室(大概 率)會含有SNP的單拷貝。在此條件下，背景可以降低1百萬倍，對SNP的檢測可由僅能區(qū) 分十個分子中一個的測定來實現(xiàn)。圖4顯示檢測1百萬個高序列同源性分子背景下單個分 子所需的特異性和非特異性反應所需相對效率的體積依賴性。例如，使用30個循環(huán)的PCR 反應以及所需信噪比10 (通過特異性與非特異性擴增的比值來定義)，1 μ L反應器中所需 相對反應效率為約6Χ。比較而言，如果該樣品被分成100000個體積為IOpL的反應器，則 所需的反應效力比將為1.4。通過將反應體積減少到數(shù)皮升并將樣品中的核酸分散到平均每個反應少于一個， 提供了高有效濃度。這還具有減少非特異性擴增和競爭反應的優(yōu)點，否則其會提高背景。數(shù)字化PCR提供了使用光學多重PCR測定基因重排頻率的能力，所述基因重排導 致在同一 DNA分子上存在兩個靶序列。因為將分子裝載到多個分隔區(qū)中，所以它們本身隨 機且獨立地分布。如果樣品含有帶兩個靶序列的稀有分子亞群，則反應室內(nèi)擴增的共定位 會高于偶然的預計，表明存在該物質(zhì)。此分析的統(tǒng)計學能力提高了室的總數(shù)，使得對于非常 大的陣列來說，可以檢測具有兩個靶序列的少量物質(zhì)，而與其確切的定位無關。這種能力應 使得能夠檢測多種稀有基因重排，包括基因融合、轉(zhuǎn)座、選擇性剪接以及倒位。例如，此方 法可用于使用單個雙色多重測定來檢測充分表征的BCR/ABL融合致癌基因的變體。22qll 上的BCR與9q34上的ABL的融合是公知的染色體畸變，其在95 %的慢性粒細胞性白血病 (CML)病例、約25%的成年人急性淋巴母細胞性白血病(ALL)病例中以及約2_5%的兒童 ALL病例中存在(Burmeister等人，2000. LeukemiaH 1850)。RT-qPCR對共有融合轉(zhuǎn)錄本的 檢測通常用作診斷和預后的金標準。但是，由于過長的擴增子需要橋連內(nèi)部外顯子，大量可 能的斷裂點給設計檢測所有轉(zhuǎn)錄本的引物帶來了困難，排除了使用單一引物組。在大多數(shù) 的融合中，外顯子El (BCR)和All(ABL)位于融合位點的側(cè)翼?？墒褂枚嘀販y定來檢測摻有 含BCR/ABL融合物之細胞(例如慢性髓性白血病原代細胞或者具有類似融合物的細胞系) 的克隆cDNA的連續(xù)稀釋物的基因組DNA樣品中共定位的頻率，以確定引起統(tǒng)計學上顯著的 共定位富集的融合物最小級分，在所述測定中使用FRET探針并使用兩個引物組獨立地檢 測外顯子El和All以兩種不同的顏色報告(FAM和Cal Orange)。本領域技術人員會了解，序列內(nèi)多態(tài)性位置的數(shù)字編號是相對于特定序列的。另 外，根據(jù)序列編號的方法以及所選的序列，相同的位置可分配不同的數(shù)字編號。此外，序列 變異例(如插入或缺失)可改變突變位點處及其周圍的特定核苷酸的相對位置并因此改變 數(shù)字編號。表1:序列實驗方法芯片制造使用標準多層軟式光刻技術制造微流體聚二甲硅氧烷(PDMS)裝置。通 過利用20000dpi透明度掩模(CAD/Art Services)使用標準光刻技術產(chǎn)生抗光蝕劑的圖 案。產(chǎn)生色度掩模，以產(chǎn)生MegaPixel模(University of Alberta Nanofab)。使用軟式 光刻技術制備負模，將SU8-2025用于控制層，產(chǎn)生25微米厚的通道，而使用SU8-100來產(chǎn) 生立方體反應室。10微米高的通道與反應室相連，由SU8-5制造。旋轉(zhuǎn)SPR-220以實現(xiàn)10 微米的厚度，用于產(chǎn)生流動線部分，其與閥相交(Unger Μ. A.等，2000. Science 288:113)。簡言之，將彈性體層(5 1 GE RTV)旋涂至模上(250rpmXl分鐘)，部分硬化。 將蒸汽屏障(IPA清潔的透明度)置于反應室區(qū)域上，用7毫米彈性體層(5 1 GE RTV) 覆蓋，脫氣，在80°C下烘烤90分鐘以使彈性體硬化，冷卻1小時。將硬化的反應室層從模 上剝離，將其與彈性體控制層(20 1 GE RTV，之前旋涂于支持物基質(zhì)上，500rpmX30秒 +1875rpmX90秒，然后在80°C下烘烤45分鐘)對齊。將兩個層在80°C下烘烤1小時使其 結(jié)合，冷卻并從載體基質(zhì)上剝離。在裝置上打孔，將裝置裝于基底層上(20 1 GE RTV，按 照所述旋涂)。將最終的裝配物在80°C下烘烤過夜，以使彈性體硬化。所述裝置由以硅片粘合的兩層PDMS構(gòu)成，其具有抬高的幾何形狀。通過首先以 820RPM旋轉(zhuǎn)PDMS層(5 1 RTV A B)得到流動層。然后，將用于水蒸氣控制的聚乙烯透 明載玻片置于相關構(gòu)造之上，將約40g的PDMS傾倒在整個硅片上，隨后將其烘烤1小時。對 于控制層，用PDMSdO 1 RTV A B)涂覆硅片，以1800rpm旋轉(zhuǎn)，隨后烘烤45分鐘。然 后，將控制層和流動層對齊并共同烘烤。芯片操作首先將待分析樣品與反應所需的所有試劑(引物、探針、dNTP、聚合酶、 MgCl2)混合，然后將其注入具有大規(guī)模平版印刷所限定室陣列特征的微流體通道結(jié)構(gòu)。首先用PCR反應混合物加壓填充PCR反應室。然后，用油對主流動通道加壓。所述室的幾何形狀確保了高表面張力，需要施加高壓(約10PSI)以使得流體進 入。所述幾何形狀輔助了其后的區(qū)室化，因為在所述室充滿水流體之后，流動線的加壓導致 僅有連接通道中的溶液被油排出，而室本身中則不發(fā)生排出。PCR測定和分析除非另作說明，負責使用本發(fā)明微流體裝置實施的所有PCR反 應以ABI TAQ FAST master混合物按照制造商的說明進行，F(xiàn)AM的探針濃度為500nM，Cal Orange為250nM。向反應混合物中添加表面活性劑(0. 吐溫-20)。每種引物的濃度為 750nM。熱循環(huán)方案包括20秒熱啟動，95度1秒和60度30秒的40個循環(huán)。使用BioMark 系 統(tǒng)(Fluidigm)進行熱循環(huán)和成像。獲得終點測量，并使用Matlab分析圖像。模板(靶DNA) 包含根據(jù) SEQ ID NO :1 的人 BCL2 基因的一部分，由 IDT(Integrated DNA Technologies) 對其進行合成并進行PAGE純化。此模板之前已通過實時PCR證明了 100%的PCR效率。所 用引物為GCCACCTGTGGTCCACCT(SEQ ID NO :2)和TGGACATCTCGGCGAAGTCG(SEQ ID NO 3)以 及探針 FAM-CGACGACTTCTCCCGCCGCT-BHQ(SEQ ID NO :4)，均由 IDT 合成。為了監(jiān)測裝置間的變異，以不同顏色的測定使用對照，如下所述。由IDT合成 來自人ABLll基因的模板(SEQ ID NO :5)并進行PAGE純化。由IDT合成下列引物 ATTTGGAGGGCACAAAAGTG(SEQ ID NO 6)和 GGGGGAGGCGTTACTGTG(SEQ ID NO :7)。 由 Biosearch Technologies 合成下列 CalOrange 探針ACAGGTCTGACCAGGTGACC (SEQ ID N0: 8)。21三體差異用來自Roche Diagnostics的下列引物和探針靶向第21號染色體上 AIRE 基因區(qū)域ATCGAGCAGGAGCTGGAG(SEQ ID NO 9), TGCCGGTCATAGCTCTTCTT (SEQ ID N0: 10)和 LNA 探針 1 (GCTCCAGG) (SEQ ID NO :11)。用下列引物和探針靶向第9號染色體上的ABL基因ATTTGGAGGGCACAAAAGTG(SEQ ID NO 12)，AGGGGTTTTGGAGTCAGGTT (SEQ ID NO 13)(由 IDT 合成)和來自 Biosearch Technologies 的 CalOrange-ACAGGTCTGACCAGGTGACC-BHQl (SEQ ID N0:14)。向基因組 DNA 中摻入 6%的獲得自 Child and Family Research Institute，Vancouver，BC 的純?nèi)w 21 DNA。將用于數(shù)字化PCR反應的最終DNA樣品設置為獲得約20%的填充因數(shù)。本應用使用 具有90000個室的裝置。JAK2 測定從來自雜合患者的擴增子產(chǎn)生Jak2野生型和突變體質(zhì)粒。簡言之，使用下列引物 擴增453bp靶標Jak2fwd TCCTCAGAACGTTGATGGCAG (SEQ ID N0:21)，和Jak2rev ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT (SEQ ID NO :22)。擴增條件為 50°C退火溫度， 3. 5mM MgCl2濃度，由IOOng的基因組DNA起始。將PCR產(chǎn)物在7%聚丙烯酰胺凝膠上電泳， 以驗證正確大小的片段。使用Τ0Ρ0 TA亞克隆試劑盒(Invitrogen)按照制造商的說明進 行亞克隆。簡言之，將1微升的PCR產(chǎn)物與1微升緩沖液和1微升線性化活化載體以及3 微升dH20合并，在室溫下孵育5分鐘，然后置于冰上。將4微升的克隆反應物與一等分試 樣的試劑盒所提供的感受態(tài)細胞混合，在冰上孵育5分鐘。將50微升的轉(zhuǎn)染反應物置于LB 氨芐西林平板上，在37°C下培養(yǎng)過夜。將10個單菌落挑至LB amp培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，然后 分離DNA。
使用Qiagen Midi質(zhì)粒純化試劑盒分離質(zhì)粒DNA。在基于Taqman的等位基因辨別 測定(Applied Biosystems)中逐個檢測來自10個單菌落的DNA。進一步分離出Jak2野生 型(質(zhì)粒A)和Jak2突變體(質(zhì)粒B)各一個進行后續(xù)研究。所述質(zhì)粒用作恒定野生型背景(wt或WT)和量逐漸增加的突變體(mt或MT)的模 板(1 1的Wt mt至1 1000)。反應中使用750nM終濃度的引物和探針，其具有以下 序列正向引物AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT (SEQ ID NO 17)反向引物AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT (SEQ ID NO 18)探針(MGB)WT TCTCCACAGACACATAC(VIC) (SEQ ID NO 19)MT TCCACAGAAACATAC(FAM) (SEQ ID NO 20)野生型濃度為約0. 5個質(zhì)粒/室。本應用使用具有90000個室和五個入口管線的 裝置。應用40個循環(huán)的PCR，使用Matlab程序?qū)﹃栃允业臄?shù)目進行計數(shù)。實施例1 大規(guī)模微流體乳液陣列中靶核酸的擴增使用包含選定的蒸汽屏障覆蓋的裝置來證明PCR實驗中蒸發(fā)的作用。將室密度為 1個室/1600 μ m2的具有圖2d所示室?guī)缀涡螤畹奈⒘黧w裝置設計成具有5個分離的室陣列， 從而在同一芯片上測試不同的樣品。將PCR溶液引入所述裝置中，并按照圖3中所示進行 區(qū)室化。使用GAPDH的標準TaqMan測定和TaqMan (Applied Biosystems)來監(jiān)測反應的進 展，模板DNA濃度為約10個拷貝/反應室。使反應進行40個循環(huán)，在圖5中顯示終點圖。圖5的顯微照片顯示一個實驗的結(jié)果。由蒸汽屏障覆蓋的含有陽性對照的反應室 (陽性對照區(qū)A和D)成功擴增了靶核酸，而位于蒸汽屏障覆蓋區(qū)域之外的陽性對照反應室 (陽性對照區(qū)E的部分)未成功擴增。通過將蒸汽屏障并入微流體裝置中，我們證明了在高達90000個體積約30皮升的 反應室陣列中進行可靠的單分子擴增。實施例2靶DNA的單拷貝擴增通過將初始DNA (靶核酸)稀釋使得每個反應室僅含有一個DNA分子或沒有，可以 定量鑒定樣品中所存在DNA的初始量。因為每個具有光信號的室顯示在PCR擴增之前存在 靶核酸，所有只有含有靶核酸拷貝的反應室會提供檢測熒光信號以供檢測。如所述，通過將流體線與含稀釋DNA的PCR溶液的加壓儲器相連而對微流體芯片 進行加載。在填充了所有室之后，在主流動線中壓入Fluor inert 油，從而排出除室以外所 有地方的流體，所述芯片準備好進行熱循環(huán)。隨著PCR反應的進行，在每個循環(huán)時拍攝芯片 的圖像。因此，可以見到DNA產(chǎn)物隨每個循環(huán)增加(通過熒光信號)。這示于圖6。所述反 應室的每側(cè)為30微米。隨著循環(huán)數(shù)的增加，來自陰性對照反應室的信號保持在背景水平， 而來自陽性對照的信號呈指數(shù)增加。我們已經(jīng)證明，通過在具有百萬個反應室的芯片上進行數(shù)字化PCR，由于大大增加 了動態(tài)范圍而可以非常精確地對DNA分子進行計數(shù)。特別地，此類分析對于與已知對照相 比對稀有基因表達產(chǎn)物進行計數(shù)來說是至關重要的。由于可以使用幾種不同的探針，可以
25定量鑒定幾種基因的表達譜。實施例3:小等位基因失衡的區(qū)分非侵入性檢測胎兒21三體使用數(shù)字化PCR計數(shù)，利用本文所述的微流體陣列檢測染色體數(shù)的少量失衡。為 了確定樣品中C21增加1. 5%，對于5 σ的確定性約需要9000000個PCR反應nc21-nci5 = m ε = k σ = k V nC21 ε =1.5%nC21 = N室p(l+ε ) nC21 = m(2+ ε )
k =s -> 895,570^ 室M是基因組等同物的數(shù)目(1組基因組=每個染色體各兩個)。采樣噪聲σ是21 號染色體數(shù)的平方根。如所討論的，如果使用常規(guī)PCR技術，這個反應數(shù)非常大，實際上是 不可能的。使用包含IO6個反應室的微流體陣列將該數(shù)目的反應壓縮到有可能實現(xiàn)的規(guī)模。使用對已知分別以單拷貝存在于21號和9號染色體上的AIRE基因和ABL基因的 數(shù)字化檢測來確定21號(C21)和9號(C9)染色體的拷貝數(shù)。在相對于正?；蚪M樣品中 獲得的計數(shù)進行歸一化后，對90000個數(shù)字化室的摻有6%的21三體DNA的樣品的測定顯 示預計的3% AIRE基因的富集(圖7)。這些測定代表了目前為止所報道的任何PCR技術 的最高區(qū)分能力，可以直接的方式將其擴展至檢測以下的差異。令人感興趣的是，對正 ?；蚪MDNA中AIRE和ABL的測定顯示與陽性反應室絕對數(shù)目相一致的差異。實施例4在高同源性背景下檢測稀有序列JAK2測定作為其原理的證實，分析了含有Jak2基因中SNP突變(V617F)的質(zhì)粒樣品。V617F 突變對于幾種脊髓增生性疾病(例如真性紅細胞增多、特發(fā)性血小板增多、特發(fā)性骨髓纖 維化)以及幾種白血病具有特異性。使用SNP區(qū)域特異性的探針以及共用引物檢測含有野 生型Jak2基因或V617F變體的質(zhì)粒。FAM中的探針用于檢測SNP，而VIC中的探針用于檢測 V617F突變體。檢測在恒定野生型背景下含有不同量突變體的樣品，所述測定能夠檢出低至 1 1000的突變體與野生型的比值，與此相比，文獻報道的最低值為5 100(BoSdquet等 人，2006. Hum Pathol 37:1458)。這些結(jié)果在圖8A、B中顯示。皮升體積區(qū)室化使可用于在高序列同源性大背景下檢測稀有序列的濃度得到有 效增強。在1個拷貝/1千相對濃度的野生型背景下(1000個野生型背景中1個拷貝的SNP) 檢測數(shù)個拷貝單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測不易于用非數(shù)字化技術進行檢測。在這種情況 下，即便極少量的野生型序列非特異性擴增也會導致假陽性，使得任何PCR方法進行的檢 測極度地困難或者不可能完成。但是，將該樣品分配到100000個室，導致每個反應室平均 為100個拷貝的野生型序列。這些反應室中的大多數(shù)不含有靶核酸，而100個反應室(大 概率)含有包含SNP的單拷貝靶核酸。在這種情況下，背景可以降低4個數(shù)量級，對SNP的 檢測可由僅能夠區(qū)分十個分子中一個的測定來實現(xiàn)。實施例5微流體陣列用于產(chǎn)生測序文庫的應用可使用自動化測序儀或系統(tǒng)產(chǎn)生測序文庫，所述測序儀或系統(tǒng)依賴于通過延伸進行測序或通過連接進行測序。這些測序技術中的關鍵步驟是在測序之前定位擴增單個分 子。在此步驟中，可將待測序DNA模板的單個分子與其鄰近分子分隔開，使用聚合酶鏈式反 應或滾環(huán)擴增對其進行擴增。例如，根據(jù)本發(fā)明的微流體裝置可裝載微米級的珠，其濃度選 擇成得到每個室中有數(shù)個珠。包含約10000000個反應室的裝置可以約0. 1至約0. 5的濃 度裝載含有靶核酸的PCR反應混合物中的珠混懸液。提供平均約5個珠/室的足量的珠。 基于泊松統(tǒng)計，這種裝載會得到含有樣品的約1000000個室，它們中約95%含有單個模板， 它們幾乎全部含有至少一個珠(平均為5個)。擴增后，將珠從所述室中除去。從室除去珠 的方法實例包括清洗步驟或者將微流體裝置從支持物(例如玻璃)上剝離的步驟。可回收 所述珠用以測序。這會得到約5000000個珠的文庫，其中約95%連接有單一序列，代表約 1000000個分子的總樣品大小。這些文庫的大小還可通過制造具有更多室的裝置或者通過 使用多個裝置而進一步提高。所有引用均通過參考并入本文。已通過舉例方式描述了一個或多個目前優(yōu)選的實施方案。對本領域技術人員來說 很明顯的是，可在不脫離權(quán)利要求所定義的本發(fā)明范圍的情況下，進行多種改變和修改。
權(quán)利要求
微流體裝置，其包含與在彈性體基底中形成的流動通道流體連通的多個反應室；和共面施加至所述多個反應室并由彈性體層與所述反應室分隔開的蒸汽屏障。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其還包含沿流動通道設置的多個閥，所述多個閥中的每一 個包含與流動通道相交的一個或多個控制通道。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述閥設置在所述流動通道的第一端和第二端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述反應室為皮升或飛升體積。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述反應室是盲端反應室。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的裝置，其中所述反應室含有一種或多種預先放置的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述反應室以5000或更多個室/cm2的密度存在。
8.對微流體裝置中的流體進行區(qū)室化的方法，其包括 向與流動通道流體連通的多個反應室中充入第一流體；用第二流體沖洗所述流動通道，并排出所述流動通道中的第一流體而不排出反應室中 的第一流體，所述第二流體與所述第一流體不混溶；其中所述多個反應室中每一個中的所述第一流體通過所述流動通道中的第二流體與 每個其它反應室中的第一流體分隔開。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品還包含一種或多種用于PCR的試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述反應室為皮升或飛升體積。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第一流體是水溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第二流體是非水流體。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第一流體包含PCR反應混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第一流體包含樣品。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述反應室是盲端反應室。
16.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述反應室含有一種或多種預先放置的試劑。
17.對靶核酸進行數(shù)字化定量的方法，所述方法包括向與微流體陣列的流動通道流體連通的多個反應室中充入包含靶核酸的第一流體； 用第二流體沖洗所述流動通道，并排出所述流動通道中的第一流體而不排出反應室中 的第一流體，所述第二流體與所述第一流體不混溶；其中多個反應室中每一個中的所述第一流體通過所述流動通道中的第二流體與每個 其它反應室中的第一流體分隔開；以及 孵育所述微流體陣列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述反應室為皮升或飛升體積。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述第一流體是水溶液。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述第二流體是非水流體。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述第一流體包含PCR反應混合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述第一流體包含樣品。
23.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述反應室是盲端反應室。
24.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述反應室含有一種或多種預先放置的試劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述靶核酸在第一流體中的濃度適于在所述多個反應室中平均為每個反應室提供少于約一個靶核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述靶核酸在第一流體中的濃度適于在所述多個反 應室中平均為每個反應室提供少于約0. 5個靶核酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述孵育步驟包括熱循環(huán)。
28.微流體裝置，其包含與在彈性體基底中形成的流動通道連通的多個反應室；以及 防止兩個或更多個反應室之間流體連通的流體屏障。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其還包含共面施加于所述多個反應室并通過彈性體層與 所述反應室分隔開的蒸汽屏障。
全文摘要
微流體裝置，其包含與在彈性體基底中形成的流動通道流體連通的多個反應室、防止從多個反應室蒸發(fā)的蒸汽屏障以及用于分隔所述多個反應室中每一個的連續(xù)相流體。
文檔編號B01L7/00GK101910415SQ200880124204
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日
發(fā)明者卡爾·拉爾斯·根吉斯·漢森, 卡羅琳娜·特羅皮尼 申請人:不列顛哥倫比亞大學