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牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測(cè)序方法

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牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測(cè)序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆 和測(cè)序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶(Laccase)是一種糖蛋白,肽鏈一般由500個(gè)左右氨基酸組成,糖配基占整個(gè) 分子的10%~45%。糖組成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和阿拉伯糖等。由于分 子中糖基的差異,漆酶的分子量隨來(lái)源不同會(huì)有很大差異,甚至來(lái)源相同的漆酶分子量也 會(huì)不同。盡管漆酶的氨基酸序列同源性差異很大,一般不同來(lái)源的漆酶同源性低于50%,但 其催化位點(diǎn)序列還是非常保守的。通過(guò)對(duì)漆酶蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研宄,發(fā)現(xiàn)漆酶具有3個(gè) 銅離子結(jié)合位點(diǎn),共結(jié)合有4個(gè)銅離子,根據(jù)它們的氧化還原電勢(shì)、光學(xué)和磁學(xué)特征劃分為 三種類(lèi)型。
[0003] 第一類(lèi)銅離子(Cul)能與包括水在內(nèi)的溶劑作用,各種銅離子絡(luò)合劑能將其除去 導(dǎo)致酶的活性大大減少。第二類(lèi)銅離子(Cu2)是由兩分子的咪唑和一分子的水配位形成 松散的扭曲四面體幾何構(gòu)型,所以很容易除去,在有氧條件下則不易除去。第三類(lèi)銅離子 (Cu3a,Cu3b)與三個(gè)組氨酸分子和一個(gè)氫氧化物分子形成受阻四面體幾何構(gòu)型,在有氧分 子存在時(shí),這對(duì)銅離子由氫氧化物為橋結(jié)合在一起,Cu-Cu工價(jià)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的反鐵磁性,檢 測(cè)不到EPR光譜信號(hào)。這類(lèi)二價(jià)復(fù)合物在330nm處的吸收隨活性位點(diǎn)的還原而消失。
[0004] 漆酶能催化許多化合物的氧化反應(yīng),底物比較廣泛,包括許多對(duì)二酚結(jié)構(gòu)類(lèi)似的 化合物,如氨基苯酚,鄰、對(duì)苯二酚,多胺,木質(zhì)素和芳基二胺等。一些漆酶能高效的氧化抗 壞血酸,另外一些真菌漆酶還能催化木質(zhì)素和甲氧基酚酸的脫甲基反應(yīng)。漆酶的抑制劑大 多是銅離子螯合劑,有鹵化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等,離子強(qiáng)度的不同也會(huì)影響酶的活 力。不同來(lái)源的漆酶最適pH范圍也不同。
[0005] 漆酶的活性與真菌的出芽、色素生產(chǎn)、木質(zhì)素降解和病源發(fā)生相關(guān),同時(shí)漆酶還可 以保護(hù)真菌病原菌免受寄主植保素和鞣質(zhì)等化合物的影響,所以漆酶被認(rèn)為是重要的病原 菌毒力因子。例如根病原菌Heterobasidionannosum的侵染性和漆酶緊密相關(guān)。
[0006] 漆酶可存活于空氣中,發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水,因此本質(zhì)上是一種環(huán)保型 酵素,存在菇、菌及植物中,有關(guān)真菌漆酶的研宄與應(yīng)用已有大量報(bào)道。真菌漆酶因?yàn)榫哂?降解木質(zhì)素、酚類(lèi)物質(zhì)的作用,所以在紡織、造紙、食品、飼料、環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用 潛力。分泌漆酶的主要真菌有黃孢原毛平革菌、彩絨革蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇、香 菇等,這些真菌都屬于擔(dān)子菌門(mén)。
[0007] 漆酶在植物中主要起到合成木質(zhì)素的作用,而真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反, 主要起降解木質(zhì)素的作用,因此真菌漆酶對(duì)木質(zhì)素的降解作用使漆酶具有廣泛的潛在應(yīng)用 價(jià)值。牛樟芝是珍貴的藥用真菌,是牛樟樹(shù)上發(fā)現(xiàn)的唯一腐木菌,但是樟芝的寄生病源性 并不強(qiáng),牛樟樹(shù)很少死亡,所以,研宄牛樟芝的漆酶具有重要意義。本發(fā)明參考其它物種 Laccase基因序列,克隆測(cè)序獲得牛樟芝Laccase基因的cDNA序列,并對(duì)不同物種Laccase 基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較,旨在了解和驗(yàn)證Laccase基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為今后研宄Laccase基因與菌類(lèi)漆酶提供基礎(chǔ)資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種牛樟芝Laccase蛋白基因。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種牛樟芝Laccase蛋白基因, 該基因?yàn)橐环N漆酶的基因,具體來(lái)說(shuō),本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基 因,該基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0011] 同時(shí),本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因,其核苷酸序列編碼 具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的多肽。
[0012] 本發(fā)明的實(shí)施方式還提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方法,該方 法包含以下步驟:
[0013] (1)組織分離:取牛樟芝菌絲,以重蒸水沖洗去除培養(yǎng)基及雜質(zhì),然后將組織樣迅 速放入液氮中冷凍后于_70°C保存;
[0014] (2)總RNA的分離:從上述步驟(1)中凍存的組織樣中提取總RNA,通過(guò)分光光度 計(jì)測(cè)定RNA含量,并采用瓊脂糖電泳分析進(jìn)行總RNA的鑒定;
[0015] (3)全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和測(cè)序:以上述步驟⑵中獲得的總RNA為模板,設(shè)計(jì) 并合成SEQ ID NO: 3所示的正向引物和SEQ ID NO: 4所示的反向引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò) 增,以獲得牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列,對(duì)cDNA序列進(jìn)行克隆,得到重組質(zhì)粒;
[0016]SEQIDN0:3 :5'-ATGGCCAACCTTCGCCTTCTC-3';
[0017] SEQ ID N0:4 :TTTTTTTTTTTTTTT,即Oligo(dT) 15。
[0018] (4)測(cè)序:對(duì)上述步驟(3)中的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0019] 優(yōu)選地,本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方法 中,步驟(2)中從牛樟芝菌的組織樣中提取總RNA時(shí)使用Trizol試劑進(jìn)行提取。
[0020] 優(yōu)選地,本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè) 序方法中,步驟(3)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增的反轉(zhuǎn)錄體系組成為:緩沖液(2XBca 1stBuffer)10yl,25MmMgS044yl,核苷酸(dNTP)lyl,40U/yl酶抑制齊lj(Rnase Inhibitor) 0.5yl,22U/yl反轉(zhuǎn)錄酶(BcaBESTPolymerase)lyl,SEQIDNO: 3 所示的正 向引物0. 5yl,SEQIDN0:4所示的反向引物0. 5yl,RNA模板(RNASample)lyl,無(wú)酶水 (RnaseFreedH20) 1. 5y1,總體系為 20yl〇
[0021] 優(yōu)選地,本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方法 中,步驟⑶中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:65°C1分鐘,30°C5分鐘,15~ 30分鐘內(nèi)勻速升溫,65°C25分鐘,98°C5分鐘,5°C5分鐘。
[0022] 優(yōu)選地,本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方 法中,步驟(3)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:97°C變性5分鐘;然后以 95°C30秒,55°C30秒,72°C1分鐘為一個(gè)循環(huán),進(jìn)行30次循環(huán);最后72°C延伸10分鐘,在 4°C下保存。
[0023] 優(yōu)選地,本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測(cè)序方法 中,步驟(3)中對(duì)cDNA序列進(jìn)行克隆的步驟包括:對(duì)反轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增片段回收DNA,將回收 到的DNA片段同T載體連接,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng), 回收重組質(zhì)粒,對(duì)回收到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。
[0024] 本發(fā)明中的Laccase蛋白基因的cDNA序列是通過(guò)以牛樟芝菌絲組織中總RNA為 模板,參考粗毛革孔菌、杏鮑菇、木耳、毛頭鬼傘等物種的Laccase蛋白基因的同源序列設(shè) 計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列 見(jiàn)SEQIDNO. 1。將牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子 翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn)SEQIDNO. 2。
[0025] 在SEQIDNO. 1中,RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1600bp,電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1,其中33-35 位為起始密碼子ATG,1569-1571位為終止密碼子TGA,33-1571位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(⑶S)。 在SEQIDNO. 1中,牛樟芝Laccase蛋白基因編碼512個(gè)氨基酸。牛樟芝和白粗毛革孔菌、 杏鮑葫、木耳等真菌用ClustalX中對(duì)齊的Laccase蛋白基因編碼氨基酸序列同源性比較 結(jié)果見(jiàn)附圖2。對(duì)包括SEQIDNO. 2在內(nèi)的12個(gè)物種的12條Laccase蛋白基因的⑶S序 列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):牛樟芝Laccase蛋白同杏鮑菇的進(jìn)化距離最近,間接證明 了所得到的序列為牛樟芝的Laccase蛋白基因。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是;實(shí)施例1中的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖,其中,泳道1、2、3為per產(chǎn)物,泳道4 為Marker:A-HindIII;泳道 5 :DL2000 ;
[0027] 圖2是;實(shí)施例2中的氨基酸同源比對(duì)圖;
[0028] 圖3是;實(shí)施例2中構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí) 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解,在本發(fā)明各實(shí)施方式中, 為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是,即使沒(méi)有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改,也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0030] 實(shí)施例1牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列的克隆
[0031] 1?組織分離(Isolation)
[0032] 從上海勤生緣生物科技有限公司崇明區(qū)陳家鎮(zhèn)裕民路20號(hào)牛樟芝培養(yǎng)基地處采 得處于生長(zhǎng)期的牛樟芝菌絲,用ddH20沖洗去除培養(yǎng)基等雜質(zhì),將組織樣迅速放入液氮中冷 凍后于_70°C保存,拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
[0033] 2?總RNA的分離(TotalRNAisolation)
[0034] (1)提取RNA的準(zhǔn)備工作
[0035] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡過(guò)夜,用自來(lái)水反復(fù)沖洗,再用蒸餾水沖洗2遍, 180°C烘烤4小時(shí)。
[0036] 勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘,再用0. 1 %的DEPC水沖洗.由于 未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響,可用0. 5%的SDS處理。
[0037] Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過(guò)夜,高壓滅菌使DEPC失活。
[0038] 雙蒸水和溶液用DEPC處理,即每100ml水或溶液加0.lmlDEPC液,室溫放置過(guò) 夜,高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
[0039] (2)組織總RNA提取
[0040]取 100mg在液氮中凍存的組織樣放入有l(wèi)mlTrizol(trizalreagent,invitrogen BRL,USA)的勻漿器管中勻漿。4°C12000g離心10分鐘。吸取上清液,15-30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2-3分鐘。4°C12000g離心 15分鐘。吸取上清液,加0. 8ml異丙醇,混合均勻。15-30°C溫育10分鐘,4°C12000g離心 10分鐘,離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清,加lml75%乙醇洗滌RNA,4°C7500g 離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNasefree)中分裝,-70°C保存。
[0041] (3)組織總RNA的鑒定
[0042] 通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量,具體方法如 下:電泳槽用RNA清洗
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