一種用于靶向人鼻咽癌細胞的核酸適配體序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬細胞生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種鼻咽癌細胞的核酸適配體的序列及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌（Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我國南方及東南亞國家或地區(qū)高發(fā) 的一種上皮源性惡性腫瘤，具有明顯的種族聚集性和地域性。鼻咽癌對放療和化療高度敏 感，但其療效與疾病的進展程度相關(guān)。不幸的是，大部分鼻咽癌患者就診時已是III或IV 期。此時，單獨放療的5年生存率僅為35-52%。聯(lián)合化療可以有效提高治療效果，但毒副 作用明顯增強。因此，發(fā)展早期診斷的方法對提高整體療效十分關(guān)鍵。常規(guī)的臨床檢測方法 如鼻內(nèi)鏡檢查、病理切片等，由于有一定的技術(shù)要求且費用較高，不適合用于大規(guī)模的篩選 普查。EB病毒與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)，被國際癌癥研宄署分類為I組致癌原。血清學檢測針對 EB病毒的抗體如病毒殼蛋白抗原免疫球蛋白A(VCA/IgA)，早期抗原免疫球蛋白A(EA/IgA) 和EB病毒核抗原免疫球蛋白A(EBNAl/IgA)等已被用作高危人群的血清學篩查，但其敏感 度和特異性均較低。因此，篩選鼻咽癌特異的分子探針，鑒定鼻咽癌特異的分子標志物對于 該疾病的早期診斷和治療具有重要意義。
[0003] 核酸適配體（aptamer)，也被稱為"化學抗體"，是指從人工合成的DNA/RNA文庫中 篩選得到的、能夠高親和性和高特異性地與蛋白質(zhì)等生物靶標結(jié)合的單鏈寡核苷酸。其靶 標可以是有機小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、細胞甚至組織。核酸適配體通過氫鍵、范德華力、 疏水作用等分子間作用力形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，如假結(jié)、發(fā)卡、G-四聚體等，從而特異地識 別靶物質(zhì)并影響其生物活性。與抗體相比，核酸適配體具有許多獨特的性質(zhì)，如：快速、可重 復(fù)合成；便于修飾以滿足診斷和治療的需要；穩(wěn)定性好，易于保存；毒性和免疫原性??；快 速的組織穿透性等等。這些優(yōu)點使得核酸適配體可作為一種新的分子探針應(yīng)用于臨床早期 診斷、分子醫(yī)學研宄，闡明疾?。ㄌ貏e是腫瘤）的分子基礎(chǔ)，并研宄疾病發(fā)生發(fā)展的分子機 理，以實現(xiàn)疾病的早期診斷和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種具有高特異性和高親和力的鼻咽癌核酸適配體。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供鼻咽癌特異性核酸適配體在與鼻咽癌相關(guān)方面的應(yīng) 用。
[0006] 所述鼻咽癌特異性核酸適配體的序列（命名為S3序列）如下：
[0007] 5?-atccagagtgacgcagcatctgagaatagtggtttgctgtatggtgggcgttgaaagagg ggtggacacggtggcttagt-3,；
[0008] 所述鼻咽癌特異性核酸適配體S3的應(yīng)用如下：
[0009] (1)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在制備鼻咽癌診斷試劑中的應(yīng)用。
[0010] (2)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在制備治療鼻咽癌藥物中的應(yīng)用。
[0011] (3)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在研宄鼻咽癌與正常組織的差異性中的應(yīng)用。
[0012] (4)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在制備鼻咽癌的腫瘤標志物中的應(yīng)用。
[0013](5)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在鼻咽癌組織切片成像中的應(yīng)用。
[0014](6)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在鼻咽癌腫瘤相關(guān)的活體成像中的應(yīng)用。
[0015] (7)、所述鼻咽癌核酸適配體S3在鼻咽癌靶向治療中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0017] 基于細胞的核酸適配體篩選方法保證了細胞表面所表達的生物大分子更加接近 于生物體內(nèi)的分子構(gòu)象。而且，所得的核酸適配體無毒性、分子量小、滲透性好、易于合成與 標記。上述優(yōu)點使得所述核酸適配體在生物醫(yī)學檢測、腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)以及靶向治療 方面將有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實例中利用Mfold軟件模擬序列S3核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)示意圖
[0019] 圖2為實施例1中流式細胞儀測定所得核酸適配體序列S3對鼻咽癌細胞5-8F的 偏移。在圖2中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞個數(shù)，實線為起始DNA隨機文庫，虛線為 序列S3.
[0020] 圖3為實施例2中流式細胞儀測定所得核酸適配體序列S3對鼻咽癌細胞5-8F的 解離常數(shù)，解離常數(shù)為Kd= 11.9329±1.3997。在圖3中，橫坐標為DNA濃度（nmol/L)，縱 坐標為平均熒光強度。
[0021] 圖4為實施例3中應(yīng)用熒光納米顆粒量子點及生物素標記的序列S3識別鼻咽癌 組織切片的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1流式分析法檢測序列S3與鼻咽癌細胞5-8F的結(jié)合能力
[0023] 將對數(shù)生長期的5-8F細胞用非酶消化液消化后打散，離心去上清，收集細胞用洗 滌緩沖液洗滌兩次。細胞與含有250nMDNA序列（FAM標記的序列S3及對照用FAM標記的 起始文庫）、10%胎牛血清的結(jié)合緩沖液冰上避光孵育〇. 5h。隨后離心并去除上清，收集的 細胞用洗滌緩沖液洗滌兩次，最后收集的細胞加入200y1的結(jié)合緩沖液，用于流式細胞儀 檢測。結(jié)果如圖2所示，與起始文庫相比，序列S3產(chǎn)生較大的峰移，說明序列S3能夠很好 地檢測鼻咽癌細胞5-8F。
[0024] 實施例2流式分析法檢測序列S3對鼻咽癌細胞5-8F的解離系數(shù)
[0025] 解離常數(shù)測定的操作與實施例1的操作基本一致，平行配置不同濃度的序列S3， 以流式細胞儀的熒光值為縱坐標，以序列S3的濃度為橫坐標，由Y=BmaxXXAKd+X)方程 模擬曲線，得到序列S3的解離常數(shù)。結(jié)果如圖3所示，序列S3與靶細胞5-8F的結(jié)合能力 很強，解離常數(shù)為11. 9329±1. 3997nM。
[0026] 實施例3檢測序列S3與鼻咽癌組織切片的結(jié)合
[0027]將石蠟包埋的鼻咽癌組織切片放置于60°C烤箱2h，切片浸于二甲苯中脫蠟兩次， 每次15min;隨后浸入無水乙醇兩次，每次5min;切片依次經(jīng)過梯度乙醇（95%、90%、80%、 70 %乙醇各一次，每次2min)，最后浸入PBS;微波修復(fù)法對切片進行抗原修復(fù)，待冷卻至 室溫，使用PBS洗兩次；隨后使用含有20%胎牛血清和鮭魚精DNA的結(jié)合緩沖液室溫封閉lh;去除封閉液，加入生物素標記的序列S3 (200nM)于4°C孵育lh;洗滌緩沖液洗3次，每 次5min;隨后加入鏈霉親和素修飾的量子點，室溫孵育0. 5h;經(jīng)洗滌后，封片，熒光顯微鏡 下觀察。結(jié)果如圖4所示，序列S3能夠特異性識別切片中的鼻咽癌細胞，但與正常的鼻咽 組織呈現(xiàn)較弱或無結(jié)合，從而在臨床上可用于鼻咽癌的檢測和診斷。
【主權(quán)項】
1. 一種可用于靶向人鼻咽癌細胞株5-8F的核酸適配體序列S3,其特征在于序列如下 所示： 5'-ATCCAGAGTGACGCAGCATCTGAGAATAGTGGTTTGCTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACG GTGGCTTAGT-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在制備鼻咽癌診斷試劑中 的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在制備治療鼻咽癌藥物中 的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在研宄鼻咽癌與正常組織 的差異性中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在制備鼻咽癌的腫瘤標志 物中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在鼻咽癌組織切片成像中 的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在鼻咽癌相關(guān)的活體成像 中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求1所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列S3在鼻咽癌的靶向治療中的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬細胞生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于靶向人鼻咽癌細胞的核酸適配體的序列及應(yīng)用。本發(fā)明篩選與人鼻咽癌細胞株5-8F特異性結(jié)合的核酸適配體，獲得具有特異結(jié)合5-8F的序列S3。所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體在0℃、0.157mol/L Na+、0.005mol/L Mg2+條件下具有獨特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述鼻咽癌細胞5-8F的核酸適配體序列在制備鼻咽癌診斷試劑、治療鼻咽癌藥物、鼻咽癌的腫瘤標志物等方面，以及在研究鼻咽癌與正常組織的差異性、鼻咽癌組織切片成像、鼻咽癌相關(guān)的活體成像、鼻咽癌的靶向治療等方面具有應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N15-14, A61K47-26, A61P35-00, C12N15-115, G01N33-569
【公開號】CN104711263
【申請?zhí)枴緾N201510010338
【發(fā)明人】任彩萍, 賈文婷, 劉衛(wèi)東, 陳玉祥, 王磊
【申請人】中南大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年1月9日