本發(fā)明涉及一種基于硅納米微球與核酸適配體的雙熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種同時實現(xiàn)兩種靶標(biāo)分析物高靈敏度檢測的雙熒光探針的制備方法。

背景技術(shù)：

生物傳感技術(shù)作為分析化學(xué)學(xué)科中的新型分析技術(shù)，具有靈敏度高、專一性好、準(zhǔn)確度高、成本低廉、分析速度快以及易于自動化監(jiān)測等優(yōu)點，廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)，生物醫(yī)學(xué)，食品等領(lǐng)域。

納米硅材料(silicamaterialsformedicalapplication,openbiomedengj.2008;2:1–9.)具有高的比表面積和大的孔容，且表面易化學(xué)修飾，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值越來越受到人們的重視。

核酸適配體是由20~60個堿基所組成的、能夠特異性識別目標(biāo)分析物的rna或單鏈dna片段(aptamer-basedfluorescentbiosensors,currmedchem.2011;18:4175-4184.)，可在體外通過指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出來，具有可與特異的目標(biāo)分析物（如：凝血酶，溶菌酶，atp等）高效、專一結(jié)合等特點，并易于修飾和功能化。近年來被廣泛應(yīng)用于傳感探針的制備，實現(xiàn)生物樣品高靈敏度、高選擇性傳感與識別領(lǐng)域（dna-templatedaptamerprobeforidentificationoftargetproteins.analchem.2017;89(7):4071-4076.）。提高探針對復(fù)雜樣品中多種目標(biāo)分析物的高靈敏度識別與檢測，可以顯著降低檢測成本，提高檢測效率，對于環(huán)境污染監(jiān)測、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對復(fù)雜樣品中多種目標(biāo)分析物同時檢測所存在的困難，本發(fā)明旨在提供一種基于硅納米微球與核酸適配體的雙熒光探針，可同時檢測兩種靶標(biāo)分析物，該探針的特異選擇性好、檢測靈敏度高、檢出限低。本發(fā)明還提供了該雙熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種基于硅納米微球和核酸適配體的雙熒光探針的制備方法，在該雙熒光探針的制備過程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸適配體鏈的5’端分別修飾不同的熒光基團(tuán)cdteqds（λem=545nm）及染料cy5（λem=660nm），然后在硅納米微球表面修飾與兩種核酸適配體的堿基序列互補的兩種dna單鏈，再將修飾有熒光基團(tuán)的核酸適配體溶液與硅納米微球溶液混合，由于堿基互補配對，即形成基于硅納米微球及核酸適配體的雙熒光探針。

上述制備方法，具體包括以下步驟：

①硅納米微球的制備：將20~50μl的四乙氧基硅烷溶于10~20ml的乙醇中，在2000~3000rpm轉(zhuǎn)速的攪拌下，依次加入水10~20ml、乙醇5~10ml、氫氧化胺0.2~0.4ml的混合溶液，混合物室溫攪拌2小時，所得納米微球溶液用乙醇和水離心超聲洗滌；所得沉淀中加入溶有10~30μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10ml，混合物室溫繼續(xù)反應(yīng)4小時，所得硅納米微球用乙醇離心洗滌后40℃烘干24h；

②將兩種不同靶標(biāo)分析物的核酸適配體互補dna單鏈修飾在硅納米微球表面：將上述洗滌后的硅納米微球溶于硼酸緩沖液和nacl的混合液中，得到濃度為30-50mg/ml的硅納米微球溶液；

先加入3’端修飾有羧基的凝血酶的核酸適配體互補的dna單鏈（50~150nm，10~50μl），混合溶液中加入n-羥基丁二酰亞胺（nhs）溶液（0.5~1.0mg/ml，20~100μl），反應(yīng)30-50min后，高速離心，取上層清液測定紫外吸光度值，根據(jù)互補dna單鏈的原始吸光度值及離心后上清液的吸光度值，可計算出與凝血酶的核酸適配體互補的dna鏈接枝量；再向上述硅納米微球溶液中加入3’端修飾有羧基的溶菌酶適配體互補dna單鏈（50~150nm，10~50μl），混合溶液中加入nhs溶液（0.5~1.0mg/ml，20~100μl），反應(yīng)30-50min后，高速離心15min，取上層清液測定紫外吸光度值，可計算出與溶菌酶的核酸適配體互補的dna鏈接枝量；最后將該修飾有凝血酶及溶菌酶的核酸適配體互補dna單鏈的硅納米微球，用硼酸緩沖液和二次水洗滌后，重新溶于二次水中待用；其中，硼酸緩沖液的ph=8.5；離心速度為8000~10000rpm；

③基于核酸適配體的雙熒光探針的制備：固定有兩種核酸適配體互補dna單鏈的硅納米微球溶解于雜化緩沖液中，得到的溶液中硅納米微球濃度為100~200mg/ml，先加入5’端修飾cy5的凝血酶適配體（20~100nm），在室溫下振蕩反應(yīng)0.5~2小時后，再加入5’端修飾cdteqds的溶菌酶適配體（20~100nm），在室溫下振蕩反應(yīng)0.5~2小時，離心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅納米微球球與核酸適配體的雙熒光探針；

上述制備方法，所述步驟①硅納米微球的制備中，四乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、無水乙醇及水的體積比為1~2.5：0.5~1.5：500~1000：1000~2000，氫氧化胺和水的體積比為1~2：50~100，混合物先在室溫下反應(yīng)10-15h，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后，再在室溫下反應(yīng)1-2h，所得硅納米微球的粒徑為40nm-150nm。

上述制備方法，所述步驟②中，將凝血酶及溶菌酶的核酸適配體互補dna單鏈修飾在硅納米微球表面，硼酸緩沖液和nacl的體積比為0.5~1：1，加入的凝血酶適配體互補dna單鏈（50~100nm）與溶菌酶適配體互補dna單鏈（50~100nm）的體積比為1：1，混合后室溫放置時間為10-15h。

上述制備方法，所述步驟③中，凝血酶與溶菌酶的核酸適配體分別與硅納米微球上的互補dna單鏈互補配對時，將硅納米微球溶解在雜化緩沖液中，所述雜化緩沖液由nacl和檸檬酸鈉組成，該雜化緩沖液中nacl（750mm）、檸檬酸鈉（75mm）體積比為1~20：10~50，雜化緩沖液的ph為8.0-8.5，修飾有熒光基團(tuán)的凝血酶及溶菌酶的核酸適配體的體積比為1：1，在室溫下震蕩反應(yīng)1h-4h。

本發(fā)明提供了一種上述制備方法制備出的基于硅納米微球和核酸適配體的雙熒光探針。

本發(fā)明提供了上述基于硅納米微球和核酸適配體的雙熒光探針在同時測定實際樣品中兩種靶標(biāo)分析物（如凝血酶及溶菌酶）的濃度中的應(yīng)用，其中靶標(biāo)分析物種類包含但不局限于凝血酶及溶菌酶。

所述的應(yīng)用，在實現(xiàn)混合樣品中凝血酶、溶菌酶兩者各自的濃度測定時，先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50~100mg/ml），再加入凝血酶、溶菌酶或兩者共存的待測樣品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=545nm及λem=660nm處的熒光強(qiáng)度，并代入已建立的凝血酶及溶菌酶的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)熒光強(qiáng)度與凝血酶、溶菌酶的濃度成正比的關(guān)系，計算得到混合樣品中凝血酶或溶菌酶的濃度，其中所用緩沖液為300mmnacl、20mmtris-hcl、0.1%tween20、ph8.3的混合溶液，該熒光探針檢測凝血酶及溶菌酶的線性范圍分別為0.02~30nm及0.05~40nm。

本發(fā)明的有益效果：

1）該雙熒光傳感探針的制備過程簡單、條件溫和，檢測速度快、靈敏度高、檢出限低。

2）本發(fā)明所制備的雙熒光探針可實現(xiàn)復(fù)雜樣品中兩種或多種靶標(biāo)分析物的同時識別及檢測，大大提高了分析效率，降低了檢測成本。

3）通過在硅納米微球表面修飾其它不同種類靶標(biāo)分析物的核酸適配體，制備所得的雙熒光探針可實現(xiàn)復(fù)雜樣品中其它多種靶標(biāo)分析物的同時檢測。

附圖說明

圖1是實施例1中制備的表面修飾有凝血酶及溶菌酶核酸適配體的硅納米微球的高分辨掃描電鏡圖。

圖2是實施例1中制備的熒光探針檢測實際樣品中凝血酶含量的熒光光譜圖。

圖3是實施例3中制備的將標(biāo)記有cdteqds及cy5染料的核酸適配體修飾于硅納米微球表面后，制備的雙熒光探針的熒光光譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不局限于以下實施例。

實施例1：一種基于硅納米微球及核酸適配體的雙熒光傳感探針的制備方法和應(yīng)用

具體制備過程包括如下步驟：

①硅納米微球的制備：將30μl四乙氧基硅烷(teos)溶于15ml的乙醇中，在2000rpm攪拌下，逐滴加入由水10ml、乙醇5ml、氫氧化胺0.2ml所組成的混合溶液，混合物室溫攪拌數(shù)小時，所得納米微球溶液用乙醇和水離心超聲洗滌。所得沉淀中加入溶有20μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的乙醇溶液10ml，混合物室溫反應(yīng)4h，冷卻到室溫后，所得硅納米微球用乙醇和乙腈離心洗滌后40℃烘干24h；

②將兩種不同靶標(biāo)分析物的核酸適配體互補dna單鏈修飾在硅納米微球表面：上述洗滌后的硅納米微球，溶于硼酸緩沖液（50.0mm硼酸，3.0mm硼砂，ph=8.5）和nacl（2m）的混合液中，得到濃度為50mg/ml的硅納米微球溶液。先加入20μl的3’端修飾有羧基的凝血酶核酸適配體互補的dna單鏈（50nm），混合溶液中加入40μl的n-羥基丁二酰亞胺（nhs）溶液（0.5mg/ml），反應(yīng)30-50min后，高速離心，取上層清液測定紫外吸光度值，根據(jù)互補dna單鏈的原始吸光度值及離心后上清液的吸光度值，可計算出與凝血酶的核酸適配體互補的dna鏈接枝量；再向上述硅納米微球溶液中加入20μl的3’端修飾有羧基的溶菌酶適配體互補dna單鏈（50nm），混合溶液中加入40μlnhs溶液（0.5mg/ml），反應(yīng)30-50min后，高速（10000rpm）離心15min，取上層清液測定紫外吸光度值，可計算出與溶菌酶的核酸適配體互補的dna鏈接枝量；最后將該修飾有凝血酶及溶菌酶的核酸適配體互補dna單鏈的硅納米微球，用硼酸緩沖液（ph=8.5）和二次水洗滌后，重新溶于二次水中待用；

③基于核酸適配體的雙熒光探針的制備：固定有兩種核酸適配體互補dna單鏈的硅納米微球溶解于雜化緩沖液中，得到的溶液中硅納米微球濃度為100mg/ml，先加入20μl的5’端修飾cy5的凝血酶適配體50nm，在室溫下振蕩反應(yīng)小時后，再加入20μl的5’端修飾cdteqds的溶菌酶適配體50nm，在室溫下振蕩反應(yīng)0.5~2小時，離心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅納米微球與核酸適配體的雙熒光探針；

④凝血酶含量測定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50mg/ml），再分別加入10nm的凝血酶溶液0ml，0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml，20ml，50ml，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=660nm處的熒光強(qiáng)度，繪制凝血酶濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線待用，其中所用緩沖液為300mmnacl，20mmtris-hcl，0.1%tween20的混合溶液，ph8.3；

⑤實際樣品中的凝血酶含量檢測：在實際樣品中凝血酶濃度測定時，先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50mg/ml），再加入含有凝血酶的待測實際樣品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=660nm處的熒光強(qiáng)度，并代入上述步驟④已建立的凝血酶含量測定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中，根據(jù)熒光強(qiáng)度與凝血酶濃度成正比的關(guān)系，計算得到混合樣品中凝血酶的濃度，其中所用緩沖液為300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液,ph8.3。

實施例2：一種基于硅納米微球及核酸適配體的雙熒光傳感探針的制備方法和應(yīng)用

實驗條件和操作步驟與實施例1部分相同，改變的條件如下：

④溶菌酶含量測定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50mg/ml），再分別加入10nm的溶菌酶溶液0ml，0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml，20ml，50ml，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=545nm處的熒光強(qiáng)度，繪制溶菌酶濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線待用，其中所用緩沖液為300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3；

⑤實際樣品中的溶菌酶含量檢測：在實際樣品中溶菌酶濃度測定時，先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50mg/ml），再加入含有溶菌酶的待測實際樣品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=540nm處的熒光強(qiáng)度，并代入已建立的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)熒光強(qiáng)度與溶菌酶濃度成正比的關(guān)系，計算得到混合樣品中溶菌酶的濃度，其中所用緩沖液為300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3。

實施例3：一種基于硅納米微球及核酸適配體的雙熒光傳感探針的制備方法和應(yīng)用

實驗條件和操作步驟與實施例1部分相同，改變的條件如下：

⑤實際樣品中的凝血酶和溶菌酶含量同時檢測：在實際樣品中凝血酶和溶菌酶的濃度測定時，先將該雙熒光探針溶于緩沖液中（50mg/ml），再加入含有凝血酶和溶菌酶的待測實際樣品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，離心收集上清液，并測定λem=545nm及λem=660nm處的熒光強(qiáng)度，并代入實施例1和實施例2中分別已建立的凝血酶和溶菌酶測定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)凝血酶和溶菌酶的熒光強(qiáng)度與濃度成正比的關(guān)系，計算得到混合樣品中凝血酶及溶菌酶的濃度，其中所用緩沖液為300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3。

附圖1所示為實施例1中經(jīng)過步驟①、②制備所得的表面修飾有兩種不同靶標(biāo)分析物的核酸適配體的硅納米微球的sem圖，從sem圖中可看到該硅納米微球的粒徑約為200nm左右，但是并不能直觀看到硅納米微球表面修飾的核酸適配體鏈。

附圖2所示為實施例1中制備所得的表面修飾有溶菌酶及凝血酶的核酸適配體的雙熒光探針應(yīng)用于凝血酶含量測定的熒光光譜圖。從圖中可以看出，隨著凝血酶濃度的增加，離心后上清液的熒光強(qiáng)度值增大，這是由于隨著凝血酶的濃度增多，標(biāo)記著cy5的凝血酶適配體會不斷地從熒光探針表面解離下來，離心后測得的上清液熒光強(qiáng)度值會逐級增強(qiáng)。（熒光分光光度計：horiba，日本，fluoromax-4；激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm，激發(fā)波長設(shè)定在400nm，在450-750nm范圍內(nèi)記錄熒光發(fā)射光譜的實驗數(shù)據(jù)，光電培增管的電壓為950v）。

附圖3所示為實施例3中制備所得的表面修飾有兩種不同靶標(biāo)分析物的核酸適配體的雙熒光探針的熒光光譜圖。