該申請要求2014年4月11日提交的美國申請?zhí)?1/978,333的優(yōu)先權(quán)和益處，其以其全部通過引用被并入本文。發(fā)明背景近年來鑒定致病生物——包括病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和原生動(dòng)物——的需要已變得更加急迫。與疾病聯(lián)系的病原體的鑒定相關(guān)的復(fù)雜性是使人畏縮的，并且檢測這些因子的能力對醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和農(nóng)科科學(xué)具有極度重要性。感染性疾病的臨床處理中的重要因素在于形成感染的病原體的鑒定的確立。在大多數(shù)情況下，感染微生物的鑒定對于針對適當(dāng)治療和照料做出決定是重要的。從這一點(diǎn)上，主治醫(yī)師必然依賴臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室來提供需要的基本信息以開始合理的治療計(jì)劃。臨床情況中關(guān)于檢測病原體的挑戰(zhàn)包括直接從臨床樣本或樣品進(jìn)行測定的需要、檢測需要的時(shí)間、可能不能培養(yǎng)傳染因子、關(guān)于罕見或未知傳染因子檢測的困難、和與在呈現(xiàn)相似癥狀的傳染因子中鑒定傳染因子相關(guān)的困難。在另一個(gè)實(shí)例中，由于食物鏈中連續(xù)的病原體暴露，保持食品安全中的相當(dāng)大的挑戰(zhàn)(Scallanet.al.，“FoodborneillnessacquiredintheUnitedStates-majorpathogens.”EmergInfectDis.2011；17(1)：7-15)。在美國每年報(bào)道有4800萬例食物傳染疾病。導(dǎo)致大約128,000人住院和3,000人死亡。經(jīng)濟(jì)和健康護(hù)理沖擊顯著，估計(jì)有$1520億。食品安全測試對于鑒定和去除已被病原體暴露污染的食品來源已變得重要。食品安全測試的市場2011年是$33億，并計(jì)劃到2017繼續(xù)經(jīng)歷令人注目的增長。動(dòng)物和植物中與疾病聯(lián)系的大量病原體是廣泛的，目前的篩選測定不能在單個(gè)測定中針對大量病原體進(jìn)行快速和同時(shí)篩選。由于新形成的編目擴(kuò)大了人微生物群系(microbiome)中的種類計(jì)數(shù)和表征它們的分布，所以需要宏基因組(metagenomic)工具來有效地鑒定與疾病強(qiáng)烈相關(guān)的因子。評價(jià)微生物群系的能力將是必需的以了解病原體之間的相互作用、和病原體與共生的生物的相互作用、宿主遺傳學(xué)、和環(huán)境因素。在2008年，全世界超過200萬癌癥病例(所有腫瘤的20％)與十種傳染因子之一相關(guān)：七種病毒(乳頭瘤病毒、乙型或丙型肝炎、EB病毒、人皰疹病毒8、和T細(xì)胞白血病病毒1型)、一種細(xì)菌(幽門螺桿菌(Helicobacterpylori))和兩種蠕蟲(血吸蟲和肝吸蟲)，其作為病原體是癌癥的主要貢獻(xiàn)者(deMarteletal.LancetOncol2012；13(6)：607-615)?？紤]到包括正常的人微生物群系的數(shù)千種類，(Relman.Nature2012；486(7402)：194-195)，可能微生物群體實(shí)質(zhì)地影響正常生理學(xué)以及疾病的原因和應(yīng)答(Laassetal.AutoimmunRev2014)，疾病包括癌癥。這些效應(yīng)是已知具有居住的微生物群系的組織如胃腸道(Laassetal.AutoimmunRev2014；MajorandSpiller.CurrOpinEndocrinolDiabetesObes2014；21(1)：15-21；Schwarzbergetal.PLoSOne2014；9(1)：e86708；ScharschmidtandFischbach.DrugDiscovTodayDisMech2013；10(3-4))、皮膚(ScharschmidtandFischbach.DrugDiscovTodayDisMech2013；10(3-4))和氣道(Martinezetal.AnnAmThoracSoc2013；10Suppl：S170-179；Segaletal.AnnAmThoracSoc2014；11(1)：108-116；Szeetal.HAnnAmThoracSoc2014；11Suppl1：S77)中和免疫和炎癥應(yīng)答(Gjymishkaetal.Irnmunotherapy2013；5(12)：1357-1366；KamadaandNunez.Gastroenterology2014；Kobozievetal.FreeRadicBiolMed2013；68C：122-133；Ooietal.PLoSOne2014；9(1)：e86366)中大量研究的主題。微生物群系概況分析也正在揭露微生物的較不明顯的作用和它們在料想不到的位置的存在；與癌癥有關(guān)的實(shí)例包括腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)(Iidaetal.Science2013；342(6161)：967-970)和乳腺癌組織中細(xì)菌群體的生態(tài)失調(diào)(Xnanetal.PLoSOne2014；9(1)：e83744)?，F(xiàn)有的檢測與疾病相關(guān)的病原體的策略需要樣品獲自被感染的對象，且許多技術(shù)用于鑒定病原體(參見，例如，圖1A和1B)。這些技術(shù)通常包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、針對可疑病原體的特定蛋白的特異性抗體、實(shí)驗(yàn)室中病原體的體外培養(yǎng)、和PCR擴(kuò)增策略。使用通用的16S核糖體RNA引物的PCR擴(kuò)增，之后是擴(kuò)增子測序，是最廣泛使用的微生物群系研究的策略和提供有效的發(fā)現(xiàn)工具(Coxetal.HumMolGenet2013；22(R1)：R88-94)，但是只針對具有逃過種群PCR的擴(kuò)增子的細(xì)菌種類，而不針對病毒或真核微生物。16SrRNA測序也可用于篩選大量樣品，但是不可在菌株之間區(qū)分或報(bào)告基因組變異體或致病性因子的存在。來自樣品的總DNA的深度測序可鑒定細(xì)菌、病毒和其它微生物群系成員(The人MicrobiomeProjectConsortium.Nature2012；486(7402)：207-214；Coxetal.HumMolGenet2013；22(R1)：R88-94；Maetal.JVirol2014)，但是效率嚴(yán)重受損。甚至以迄今未實(shí)現(xiàn)的每個(gè)基因組$1000的目標(biāo)，總DNA測序也是篩選成百上千的測試和對照樣品以檢測病原體與疾病關(guān)聯(lián)的昂貴方法。取決于抽樣的樣本，數(shù)據(jù)可壓倒性地來自宿主人序列，產(chǎn)生不必要的大的定位病原體標(biāo)記的搜索空間和導(dǎo)致被丟棄的多數(shù)序列閱讀。DNA微陣列已用于宏基因組學(xué)。LawrenceBerkeleyLab/AffymetrixPhyloChip是基于核糖體RNA序列(Brodieetal.ApplEnvironMicrobiol2006；72(9)：6288-6298)。學(xué)術(shù)上發(fā)展的Virochip具有針對1500種病毒的探針(Chenetal.JVisExp2011(50))和已成功檢測了病理學(xué)樣品中的病毒。Virochip平臺受限于病毒和分析反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于PCR擴(kuò)增的RNA(Chenetal.JVisExp2011(50))。GlomicsGeoChip4.0集中于人微生物群系中細(xì)菌進(jìn)行的RNA表達(dá)(Tuetal.MolEcolResour2014)，且涵蓋噬菌體，但是沒有其它病毒或任何真核微生物。PathGenDx已首創(chuàng)了PathChipKit，其描寫了針對所有已知病毒和寬的細(xì)菌選擇(Wongetal.GenomeBiol2007；8(5)：R93)，但是沒有真核病原體的Affymetrix微陣列的特征。這些和其它基于陣列的工具顯示對寬的微生物容量——包括超過細(xì)菌的物種——的快速和經(jīng)濟(jì)地篩選大量樣品的方法的需求(Normanetal..Gastroenterology2014)。因?yàn)楫?dāng)前的檢測和鑒定致病和病原體的方法不充足，所以迫切需要快速和同時(shí)檢測和鑒定多個(gè)病原體——包括所有當(dāng)前已知的病原體——的組合物和方法。這樣的組合物和方法也用于病原體相關(guān)疾病——包括感染性疾病和癌癥——的診斷和用于獲得由多個(gè)病原體引起的共感染產(chǎn)生的疾病狀態(tài)的了解。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這些需要。發(fā)明概述如本文所述，本發(fā)明描寫了用于包括來自多種來源和/或生物(例如，宏基因組、微生物群系)的遺傳物質(zhì)的樣品中一種或多種生物標(biāo)志檢測的組合物和方法的特征。特別地，申請人已發(fā)展了產(chǎn)生用于來自多個(gè)致病生物和因子(例如病毒)的遺傳物質(zhì)的檢測的多組核苷酸的方法，以及制備用于分析的包括總核酸提取物(例如，DNA和RNA)的樣品的方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明描寫用于同時(shí)檢測和鑒定存在于樣品中的包括病毒，細(xì)菌，真菌，原生動(dòng)物和蠕蟲的多個(gè)類型病原體的核苷酸陣列和方法的特征。另外，基于迄今未知的病原體中保守的核酸序列的區(qū)域的存在，本發(fā)明的陣列和方法可用于檢測存在于樣品中的迄今未知的病原體。在一個(gè)實(shí)施方式中，病原體的核酸來自獲自疑似或已知受病原體.感染的個(gè)體的樣品。傳染因子的檢測可用于指導(dǎo)患者護(hù)理和治療選擇(例如，抗微生物、抗病毒、抗真菌、抗細(xì)菌、或抗寄生蟲治療)。本文公開的陣列和方法可用于通過比較樣品中病原體的核酸序列與相關(guān)組的病原體中共有的序列區(qū)域的特性針對已知和迄今未知的病原體的存在來快速篩選樣品。結(jié)合下面提供的實(shí)例，本發(fā)明限定的組合物和物品被分離或另外被制造。根據(jù)詳細(xì)描述和根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢將是明顯的。定義除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解的意思。以下參考文獻(xiàn)提供給技術(shù)人員用于該發(fā)明的許多術(shù)語的一般定義：Singletonetal.，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2nded.1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.，1988)；TheGlossaryofGenetics，5thEd.，R.Riegeretal.(eds.)，SpringerVerlag(1991)；andHale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。如本文所用，以下術(shù)語具有下面歸于它們的意思，除非另外說明。如本文所用，冠詞“一(a)”和“一(an)”于指一個(gè)或超過一個(gè)(即，至少一個(gè)冠詞的語法對象。通過實(shí)例，“一元件”指一個(gè)元件或超過一個(gè)元件。如本文所用當(dāng)提到可測量的值如數(shù)量、持續(xù)時(shí)間等時(shí)，術(shù)語“約”意味著包括指定值的±20％的變化或在指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％內(nèi)，因?yàn)檫@樣的變化對進(jìn)行公開的方法是適當(dāng)?shù)?。除非另外根?jù)上下文是清楚的，本文提供的所有數(shù)值都由術(shù)語約修飾。如本文所用的“生物標(biāo)志”或“標(biāo)志”通常指核酸分子、臨床指示物、蛋白質(zhì)、或與極性相關(guān)的其它分析物。在某些實(shí)施方式中，核酸生物標(biāo)志指示樣品中病原性生物——包括但不限于病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和原生動(dòng)物——的存在。在多種實(shí)施方式中，相對于參照，標(biāo)志區(qū)別地存在于獲自患有或?yàn)l臨發(fā)展疾病(例如，傳染病)的對象的生物樣品中。如果存在于樣品中的生物標(biāo)志的平均水平或中間水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別于參照中存在的水平，那么標(biāo)志區(qū)別地存在。參考水平可以是，例如，存在于獲自清潔或未污染的來源的環(huán)境樣品中的水平。參考水平可以是，例如，存在于樣品獲自健康對照對象中的水平或獲自更早的時(shí)間點(diǎn)，即，治療之前的對象的水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的通常檢驗(yàn)包括t-檢驗(yàn)、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。生物標(biāo)志，單獨(dú)或組合，提供對象屬于感興趣的表型狀態(tài)的相對可能性的測量。對象樣品中本發(fā)明的標(biāo)志的差別存在可用于表征對象為患有或?yàn)l臨發(fā)展疾病(例如，傳染病)，用于確定對象的預(yù)后，用于評價(jià)治療效果，或用于選擇治療方案?！皠敝溉魏魏怂岱肿印⑿》肿踊衔?、抗體或多肽或其片段。“變化”指增加或減少。變化可以超過與1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％一樣少或超過40％、50％、60％，或甚至超過與70％、75％、80％、90％或100％一樣多?！迳飿悠贰逯溉魏蝸碜陨锏慕M織、細(xì)胞、液體或其它材料?！宀东@試劑″指特異地結(jié)合核酸分子或多肽以選擇或分離核酸分子或多肽的試劑。如本文所用，術(shù)語“測定(determining)”、“評定”、“測定(assaying)”、“測量”和“檢測”指定量和定性測定，并且像這樣，術(shù)語“測定(determining)”在本文與“測定(assaying)”、“測量”等可互換地使用。意欲定量測定時(shí)，使用短語“測定分析物和類似物的量”。意欲定性和/或定量測定時(shí)，使用短語“測定分析物的水平”或“檢測”分析物?！蹇蓹z測的部分″指這樣的組合物，其當(dāng)與感興趣的分子連接時(shí)引起后者通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段可檢測。例如，有用的標(biāo)記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠粒、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如，如ELISA中所通常使用的)、生物素、地高辛配基或半抗原。″片段″指核酸分子的部分。該部分含有，優(yōu)選，參考核酸分子或多肽的全長的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。″雜交″指氫鍵合，其可以是互補(bǔ)的核酸堿基(nucleobase)之間的Watson-Crick、Hoogsteen或反向的Hoogsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過氫鍵的形成而配對的互補(bǔ)的核酸堿基。術(shù)語″分離的″、″純化的″或″生物學(xué)純的″指如以其天然狀態(tài)所發(fā)現(xiàn)的以不同的程度從正常地伴隨其的組分釋放出來的材料?！宸蛛x″表示從最初的來源或環(huán)境分離的程度?！寮兓灞硎据^分離更高的分離的程度?！寮兓摹寤颉迳飳W(xué)純的″蛋白質(zhì)完全沒有其它材料以至于任何雜質(zhì)都沒有實(shí)質(zhì)上影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)或引起不利后果。即，如果當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上沒有微孔材料、病毒材料或培養(yǎng)基，當(dāng)以化學(xué)方法合成時(shí)基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品，則本發(fā)明的核酸或肽被純化。純度和同質(zhì)性通常使用分析化學(xué)技術(shù)，例如，聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。術(shù)語″純化的″可表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一條帶。對于可經(jīng)歷修飾，例如，磷酸化或糖基化的蛋白質(zhì)，不同的修飾可產(chǎn)生不同的分離的蛋白質(zhì)，其可被單獨(dú)純化?！鍏⒖肌逯副容^的標(biāo)準(zhǔn)。如對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，適當(dāng)?shù)膮⒖际瞧渲幸粋€(gè)成分被改變以測定該成分的作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，可比較存在于樣品中的靶核酸分子的水平與存在于清潔或無污染的樣品中的靶核酸分子的水平。例如，可比較存在于樣品中的靶核酸分子的水平與存在于相應(yīng)的健康細(xì)胞或組織中或存在于患病細(xì)胞或組織(例如，來自具有疾病、病癥或狀況的對象的細(xì)胞或組織)中的靶核酸分子的水平?！鍢?biāo)志概況″指兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)志(例如，聚核苷酸)的信號、水平、表達(dá)或表達(dá)水平的表征。如本文所用，術(shù)語″核酸″指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或修飾的核苷酸，和以單鏈或雙鏈形式的其聚合物。該術(shù)語包括含有已知核苷酸類似物或修改的主鏈殘基或連接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的。用于本發(fā)明的方法的核酸分子包括特異地結(jié)合靶核酸(例如，核酸生物標(biāo)志)的任何核酸分子。這樣的核酸分子不必與內(nèi)源性核酸序列100％相同，但是將通常顯示實(shí)質(zhì)的同一性。具有與內(nèi)源性序列″實(shí)質(zhì)的同一性″的聚核苷酸通常能與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交?！咫s交″指在多種嚴(yán)格條件下在互補(bǔ)的聚核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之間配對以形成雙鏈分子。(參見，例如，Wahl，G.M.andS.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152：399；Kimmel，A.R.(1987)MethodsEnzymol.152：507)。例如，嚴(yán)格的鹽濃度將通常小于約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，優(yōu)選小于約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，和更優(yōu)選小于約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格雜交可在缺少有機(jī)溶劑，例如，甲酰胺的情況下獲得，而高嚴(yán)格雜交可在存在至少約35％甲酰胺，和更優(yōu)選至少約50％甲酰胺的情況下獲得。嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約30℃、更優(yōu)選至少約37℃和最優(yōu)選至少約42℃的溫度。變化的附加參數(shù)，如雜交時(shí)間、去垢劑——例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)——的濃度、和載體DNA的包含或排除對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。嚴(yán)格的多種水平通過組合這些多種如所需要的條件而實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，雜交將在30℃在750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉和1％SDS中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在37℃在500mMNaCl、50mM檸檬酸三鈉、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml變性的鮭精DNA(ssDNA)中發(fā)生。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在42℃在250mMNaCl、25mM檸檬酸三鈉、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/mlssDNA中發(fā)生。關(guān)于這些條件的有用的變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。為了最多應(yīng)用，跟隨雜交的清洗步驟也將在嚴(yán)格方面變化。清洗嚴(yán)格條件可由鹽濃度和由溫度限定。如上，清洗嚴(yán)格可通過減少鹽濃度或通過增加溫度而增加。例如，清洗步驟的嚴(yán)格的鹽濃度將優(yōu)選小于約30mMNaCl和3mM檸檬酸三鈉，和最優(yōu)選小于約15mMNaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。清洗步驟的嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約25℃，更優(yōu)選至少約42℃，和甚至更優(yōu)選至少約68℃的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，清洗步驟將在25℃在30mMNaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，清洗步驟將在42℃在15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，清洗步驟將在68℃在15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中發(fā)生。這些條件的另外變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。雜交技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾做周知的，并在，例如，Benton和Davis(Science196：180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA72：3961，1975)；Ausubeletal.(CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyInterscience，NewYork，2001)；Berger和Kimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques，1987，AcademicPress，NewYork)；和Sambrooketal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork中描述?！寤旧舷嗤逯革@示與參考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列的任一個(gè))或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列的任一個(gè))至少50％同一性的多肽或核酸分子。優(yōu)選，這樣的序列與用于比較的序列在氨基酸水平或核酸至少60％，更優(yōu)選80％或85％，和更優(yōu)選90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更多相同。序列同一性通常使用序列分析軟件(例如，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，1710UniversityAvenue，Madison，Wis.53705的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包、BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)來測量。這樣的軟件通過指定與多種置換、缺失、和/或其它修飾的同源性程度而使相同或相似序列相配。保守置換通常包括以下基團(tuán)內(nèi)的置換：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在測定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程序，e-3和e-100之間的概率得分指示密切相關(guān)的程序。如本文所用，術(shù)語“樣品”包括生物樣品如來自生物的任何組織、細(xì)胞、液體或其它材料?！疤禺惖亟Y(jié)合”指識別和結(jié)合分子(例如，核酸生物標(biāo)志)的化合物(例如，核酸探針或引物)，但是其基本上不識別和結(jié)合樣品，例如，生物樣品中的分子?！鍖ο蟆逯覆溉閯?dòng)物，包括，但不限于，人或非人哺乳動(dòng)物，如牛、馬、犬、羊或貓。術(shù)語“對象”可指動(dòng)物，其是治療、觀察、或?qū)嶒?yàn)的對象(例如，患者)?！灏泻怂岱肿印逯笇⒈环治龅木酆塑账?。這樣的聚核苷酸可以是靶序列的正義或反義鏈。術(shù)語″靶核酸分子″也指原始靶序列的擴(kuò)增子。在多種實(shí)施方式中，靶核酸分子是一種或多種核酸生物標(biāo)志如本文所用，術(shù)語″治療(treat)″、治療(treating)″、″治療(treatment)″和類似表達(dá)指減輕或改善與其相關(guān)的病癥和/或癥狀。將理解，雖然不排除，但是治療病癥或狀況不需要與其相關(guān)的病癥、狀況或癥狀完全消除。本文提供的范圍被理解為該范圍內(nèi)所有值的速記。例如，1至50的范圍被理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50組成的組的任何數(shù)、數(shù)的組合或子范圍。本文提供的任何化合物、組合物、或方法可與一個(gè)或多個(gè)本文提供的其它組合物和方法中的任一個(gè)組合。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方式，且不意欲受限制。除非特別說明或根據(jù)上下文是明顯的，如本文所用，術(shù)語“或”被理解為包括在內(nèi)的。術(shù)語“包括”在本文用于指短語“包括但不限于”并與短語“包括但不限于”可互換地使用。如本文所用，術(shù)語“包括(comprises)”、“包括(compriseing)”、“包含(containing)”、“具有”和類似表達(dá)可具有美國專利法中歸于它們的意思，并且可指“包括(includes)”“包括(including)”和類似表達(dá)；“基本上由……組成”或“基本上組成“同樣具有美國專利法中歸于它們的意思，并且該術(shù)語是開放式的，允許超過所列舉項(xiàng)的存在，只要所列舉項(xiàng)的基本或新的特性沒有被超過所列舉項(xiàng)的存在而改變，但是排除現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施方式。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢根據(jù)以下其想要的實(shí)施方式的描述和根據(jù)權(quán)利要求將是明顯的。附圖簡述圖1，包括圖1A和圖1B，描述幾個(gè)當(dāng)前的用于測試微生物(例如，病原微生物)存在的選項(xiàng)。圖1A描述當(dāng)前的測試選項(xiàng)中涉及的特點(diǎn)。特別地，當(dāng)前的測試選項(xiàng)需要培養(yǎng)，用于隨后通過抗體珠捕獲、DNA-珠捕獲、聚合酶鏈反應(yīng)、免疫測定、DNA探針擴(kuò)增，菌落計(jì)數(shù)、和限制酶切消化繪圖的分析。當(dāng)前的測試選項(xiàng)也限于每個(gè)測試一個(gè)分析的靶向生物。圖1B是比較當(dāng)前的測試選項(xiàng)的具體特點(diǎn)的表。圖2，包括圖2A和圖2B，描述PathoChip的設(shè)計(jì)。圖2A描述用于PathoChip探針選擇的宏基因組的使用。所有病毒和選擇的人病原微生物的序列登錄(accession)從NCBIDNA序列數(shù)據(jù)庫檢索并連接以形成宏基因組。只要有可能，對登錄(a，c)獨(dú)特的靶序列區(qū)域用于選擇多個(gè)60nt探針(數(shù)字1、2、4-6)用于微陣列合成，并且在至少兩個(gè)病毒登錄(b)中共享相似序列的靶區(qū)域的探針也被識別。原核和真核病原體的探針可繪制到基因間、基因或核糖體RNA序列、或靶類型的混合物，取決于序列數(shù)據(jù)的可用性。圖2B是設(shè)計(jì)PathoChip的過程的示意圖。平行和反復(fù)的設(shè)計(jì)程序用于組裝覆蓋獨(dú)特和保守的靶區(qū)域的PathoChip探針收集，補(bǔ)充有針對已知癌癥相關(guān)微生物疊瓦(tiling)的高分辨率探針。圖3，包括圖3A和3B，描述使用PathoChip的樣品篩選工作流。圖3A描述不需要培養(yǎng)步驟來制備用于具有PathoChip的樣品。圖3B描述用于含有DNA和RNA的樣品制備的核酸提取方法。1不知道什么細(xì)菌/病毒材料可在二甲苯去石蠟化期間喪失，2來自該旋轉(zhuǎn)的片狀沉淀物應(yīng)含有大的基因組DNA、保持完整的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。旋轉(zhuǎn)可能不足以把完整的病毒顆粒弄成球狀，3這里病毒DNA僅來自未弄成球狀(unpelleted)的完整顆粒。從溶解的宿主細(xì)胞釋放的病毒DNA應(yīng)處于小球狀。病毒RNA來自完整顆?；蛉芙獾乃拗骷?xì)胞，480或90℃逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)。5小的等分部分，保持從任何未弄成球狀的完整顆粒或細(xì)胞回收核酸的機(jī)會。圖4列出了使用多個(gè)靶向序列，PathoChipv3中探針組能夠檢測的食物傳播的病原體，包括76種生物。圖5，包括圖5A至圖5I，描述用于檢測靶種類的探針的鑒定。圖5A是描述探針(例如，用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌)的選擇和拋棄的圖表。圖5B是描述用于檢測嗜肺軍團(tuán)病桿菌的探針選擇的圖表。圖5C是描述用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的探針選擇的圖表。圖5D是描述用于檢測大腸桿菌的探針選擇的圖表。圖5E是描述用于檢測霍亂弧菌的探針選擇的圖表。圖5F是描述用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針選擇的圖表。圖5G是描述用于檢測腸道沙門氏菌的探針選擇的圖表。圖5H是描述用于檢測弗氏志賀菌的探針選擇的圖表。圖5I是描述用于檢測單核細(xì)胞增生利斯特菌的探針選擇的圖表。使用含有每個(gè)靶1000、100、10或1個(gè)細(xì)胞的稀釋的原種的等分部分用于DNA+RNA提取、擴(kuò)增、和雜交到PathoChipv3，分析針對每個(gè)靶的所有探針以鑒定具有高靈敏度的探針亞組。對于每個(gè)靶向的生物，選擇顯示適當(dāng)?shù)臋z測響應(yīng)的探針。以該方式選擇的探針的亞組在隨后的研究中用作測定組。圖6，包括圖6A至圖6H，顯示總計(jì)選擇的探針以報(bào)告單個(gè)檢測信號。圖6A是描述來自檢測腸道沙門氏菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6B是描述來自檢測單核細(xì)胞增生利斯特菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6C是描述來自檢測弗氏志賀菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6D是描述來自檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6E是描述來自檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6F是描述來自檢測霍亂弧菌的選擇的探針的信號的總計(jì)的圖表。圖6G是描述用于檢測大腸桿菌O157：H7的探針選擇的圖表。圖6H是描述用于檢測嗜肺軍團(tuán)病桿菌的探針選擇的圖表。圖7，包括圖7A至圖7H，顯示針對當(dāng)與人和萵苣細(xì)胞混合時(shí)的多種細(xì)菌特異的選擇的探針組的檢測信號。圖7A是描述計(jì)算為針對每個(gè)測試樣品(實(shí)線)和對照樣品背景(虛線)的選擇的探針的檢測信號總計(jì)的圖表(例如，用于檢測與人和萵苣細(xì)胞混合的產(chǎn)氣莢膜梭菌)。圖7B是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目大腸桿菌O157：H7細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7C是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目嗜肺軍團(tuán)病桿菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7D是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目單核細(xì)胞增生利斯特菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7E是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目腸道沙門氏菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7F是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目弗氏志賀菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7G是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目霍亂弧菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖7H是描述測定含有與人和萵苣細(xì)胞混合的不同數(shù)目小腸結(jié)腸炎耶爾森菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。大量宿主細(xì)胞背景中少數(shù)病原體細(xì)胞可被檢測，但是具有與純病原體培養(yǎng)物相比較少的絕對信號(參見圖6)。測試信號和僅有宿主的對照信號之間的差異指示檢測能力。定量病原體量的能力需要較僅檢測存在或缺乏的能力更多的細(xì)胞。圖8，包括圖8A至圖8H，顯示針對當(dāng)與牛奶混合時(shí)的多種細(xì)菌特異的選擇的探針組的檢測信號。圖8A是描述計(jì)算為針對每個(gè)測試樣品(實(shí)線)和對照樣品背景(虛線)的選擇的探針的檢測信號總計(jì)的圖表(例如，用于檢測牛奶中的產(chǎn)氣莢膜梭菌)。圖8B是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目鼠弓形體細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8C是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目霍亂弧菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8D是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目小腸結(jié)腸炎耶爾森菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8E是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目大腸桿菌O157：H7細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8F是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目嗜肺軍團(tuán)病桿菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8G是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目腸道沙門氏菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖8H是描述測定含有牛奶中不同數(shù)目弗氏志賀菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9，包括圖9A至圖9H，顯示針對當(dāng)與番茄混合時(shí)的多種細(xì)菌特異的選擇的探針組的檢測信號。圖9A是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9B是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的鼠弓形體細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9C是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的霍亂弧菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9D是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9E是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的大腸桿菌O157：H7細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9F是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的嗜肺軍團(tuán)病桿菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9G是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的弗氏志賀菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖9H是描述測定含有不同數(shù)目與番茄混合的腸道沙門氏菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖10，包括圖10A至圖10D，顯示針對當(dāng)與蛤混合時(shí)的多種細(xì)菌特異的選擇的探針組的檢測信號。圖10A是描述測定含有不同數(shù)目與蛤混合的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖10B是描述測定含有不同數(shù)目與蛤混合的鼠弓形體細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖10C是描述測定含有不同數(shù)目與蛤混合的霍亂弧菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖10D是描述測定含有不同數(shù)目與蛤混合的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌細(xì)胞的樣品的選擇的探針組的檢測信號的圖表。圖11是描述對患者樣品的PathoChip的60,000個(gè)探針的附加分析的圖表。附加分析鑒定與對照相比與患者樣品中根毛霉菌屬的真菌相關(guān)的強(qiáng)信號。將登錄信號定義為每個(gè)登錄所有探針的每個(gè)登錄-平均紅色(r)的所有探針的平均綠色(g)。圖12，包括圖12A和12B，是顯示登錄分析選擇的登錄的所有探針的雜交信號的熱圖數(shù)據(jù)。圖12A是使用PathoChip從患者和對照樣品的分析產(chǎn)生的熱圖。圖12B顯示消除未被檢測的或也存在于對照中的探針之后的熱圖。剩余的探針指示真菌雜交信號。圖13是顯示微小根毛霉菌株NRRL28626和miehel根毛霉菌具有來自屏幕的最顯著的信號的圖表?；颊邩悠分械那?個(gè)病原體——提供高登錄信號——是真菌，包括微小根毛霉菌株NRRL28626、miehel根毛霉菌、微小根毛霉、和喉紅酵母屬(Rhodotorulalaryngis)。發(fā)明詳述如本文所述，本發(fā)明描寫了用于包括來自多種來源和/或生物(例如，宏基因組、微生物群系)的遺傳物質(zhì)的樣品中一種或多種生物標(biāo)志檢測的組合物和方法的特征。特別地，申請人已發(fā)展了產(chǎn)生用于來自多個(gè)致病生物和因子(例如病毒)的遺傳物質(zhì)的檢測的多組核苷酸的方法，以及制備用于分析的包括總核酸提取物(例如，DNA和RNA)的樣品的方法。如本文所述，含有針對所有公開的病毒序列和數(shù)百個(gè)致病細(xì)菌、真菌、和蠕蟲的探針的PathoChip平臺的發(fā)展提供以經(jīng)濟(jì)模式的寬的病原體覆蓋度。PathoChip平臺通過提供由產(chǎn)品保存期限引起的更快的結(jié)果——其對制造商和配售商重要——而區(qū)別于當(dāng)前的技術(shù)。一方面，PathoChip平臺可用于對患者診斷進(jìn)行臨床分析，因此具有影響患者治療和護(hù)理的潛力。在可能的情況下，針對靶基因組的獨(dú)立區(qū)域的多個(gè)探針用于提高檢測的機(jī)會。雖然PathoChip內(nèi)容發(fā)展自已知靶的序列，但是發(fā)現(xiàn)新菌株或生物的一些能力通過包含針對病毒家族之內(nèi)和之間是保守的序列的探針來提供；具有與保守序列同源性的先前未知的病毒可產(chǎn)生在該探針的相應(yīng)的雜交信號，如果不是針對完整的探針組。支持工作流被描述用以描繪生物學(xué)和環(huán)境樣品，和包括DNA和RNA的同時(shí)檢測以擴(kuò)大可用于雜交的靶的范圍。PathoChip平臺在非食品應(yīng)用，以及食品樣品中主要細(xì)菌病原體的檢測中具有展示的成功。靶核酸分子本發(fā)明的方法和組合物用于將被分析的測試樣品或材料中靶核酸分子的鑒定。靶序列從包括靶核酸分子的任何樣品——包括但不限于環(huán)境、非生物和生物樣品——擴(kuò)增。這樣的樣品可包括真菌、孢子、病毒、或細(xì)胞(例如，原核生物、真核生物)。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的的組合物和方法檢測一種或多種致病生物——包括病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和/或原生動(dòng)物。示例性的測試樣品包括體液(例如血液、血清、血漿、羊膜液、痰、尿、腦脊液、淋巴、淚液、糞便、或胃液)、組織提取物、培養(yǎng)基(例如，細(xì)胞如病原體細(xì)胞已在其中生長的液體)、環(huán)境樣品、農(nóng)產(chǎn)品或其它食品、和它們的提取物、DNA鑒定標(biāo)簽。如果需要，將樣品在檢測之前使用通常用于從生物樣品分離核酸分子的任何標(biāo)準(zhǔn)方法純化。在一個(gè)實(shí)施方式中，將病原體的靶核酸通過引物/模板寡核苷酸來擴(kuò)增以檢測樣品中病原體的存在。示例性的病原體包括真菌、細(xì)菌、病毒和酵母。這樣的病原體可通過鑒定測試樣品中編碼病原體核酸序列的核酸分子來檢測。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品是生物樣品，如組織樣品。一種或多種聚核苷酸生物標(biāo)志(例如，以檢測或鑒定病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和/或原生動(dòng)物)的水平在不同類型的生物樣品中測量。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣品是包括組織或器官的細(xì)胞的組織樣品，例如，來自活組織檢查。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣品是生物液體樣品。生物液體樣品包括腦脊液血液、血清、血漿、尿、和唾液、或用于本發(fā)明的方法的任何其它的生物液體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品是環(huán)境樣品，如土壤、沉積物水、或空氣。環(huán)境樣品可獲自工業(yè)來源如農(nóng)場、廢物流、或水源。為了環(huán)境應(yīng)用，測試樣品可包括水、空氣過濾器的液體提取物、土壤樣品、建筑材料(例如，干式墻、天花板瓦、建筑紙板、織物、墻紙和地板覆蓋物)、環(huán)境拭子、或任何其它樣品。靶核酸分子包括雙鏈和單鏈核酸分子(例如，DNA、RNA和本領(lǐng)域已知的能夠與本文描述的核酸分子雜交的其它核酸堿基聚合物)。適合于用本發(fā)明的可檢測的寡核苷酸探針或可檢測的引物/模板寡核苷酸檢測的RNA分子包括，但不限于，包括靶序列的雙鏈和單鏈RNA分子(例如，信使RNA、病毒RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)移RNA、小RNA和小RNA前體、和siRNAs或本文描述的或本領(lǐng)域已知的其它RNAs)。適合于用本發(fā)明的可檢測的寡核苷酸探針或引物/模板寡核苷酸檢測的DNA分子包括，但不限于，雙鏈DNA(例如，基因組DNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA、病毒DNA、和合成的雙鏈DNA)。單鏈DNA靶核酸分子包括，例如，病毒DNA、cDNA、和合成的單鏈DNA、或本領(lǐng)域已知的其它類型的DNA。一般而言，用于檢測的靶序列的長度在約30和約300個(gè)核苷酸之間(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300個(gè)核苷酸)。在具體實(shí)施方式中靶序列的長度是約60個(gè)核苷酸。用于檢測的靶序列還可具有與探針序列至少約70、80、90、95、96、97、98、99、或甚至100％的同源性。探針序列可以較靶序列更長或更短例如，60-核苷酸探針可與至少約44個(gè)核苷酸的靶序列雜交。在具體實(shí)施方式中，生物標(biāo)志是區(qū)別地存在于樣品(例如，生物、非生物或環(huán)境樣品)中的生物分子(例如，核酸分子)。例如，生物標(biāo)志取自如與另一個(gè)表型狀態(tài)(例如，不具有疾病)相比的一個(gè)表型狀態(tài)(例如，具有疾病)的對象。如果不同組中生物標(biāo)志的平均或中間表達(dá)水平被計(jì)算為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，則生物標(biāo)志區(qū)別地存在于不同的表型狀態(tài)之間。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的通常檢驗(yàn)包括t-檢驗(yàn)、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。生物標(biāo)志，單獨(dú)或組合，提供對象屬于一個(gè)表型狀態(tài)或另一個(gè)的相對危險(xiǎn)度的測量。因此，它們用作表征疾病的標(biāo)志。探針選擇本發(fā)明提供選擇的用于檢測多個(gè)靶核酸分子(例如，對應(yīng)于多個(gè)生物(bioorganisms))的探針組。在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供宏基因組、其構(gòu)建、和其在本發(fā)明的方法中的使用。如本文所用“宏基因組”指來自超過一個(gè)生物的遺傳物質(zhì)，例如，在環(huán)境樣品中。宏基因組用于選擇探針組和/或驗(yàn)證探針組。在一些實(shí)施方式中，宏基因組包括約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、1500、2000個(gè)或更多生物的序列或基因組。在一個(gè)實(shí)例中，將數(shù)千生物的核酸序列連接以產(chǎn)生包括58個(gè)染色體的宏基因組。不連續(xù)的宏基因組探針選擇A.將個(gè)體基因組、基因和部分序列下載到登錄的局部數(shù)據(jù)庫中B.使用生物信息學(xué)工具掩蔽低復(fù)雜性序列。在一個(gè)實(shí)例中，低復(fù)雜性序列使用mdust(http：//doc.bioperl.org/bioperl-run/lib/Bio/Tools/Run/Mdust.html)掩蔽，之后是病毒登錄中獨(dú)特區(qū)域的BLASTN2.0MP-WashU31鑒定。C.針對所有其它登錄的每個(gè)登錄的BLASTN序列比較D.鑒定每個(gè)登錄中的特異靶區(qū)域1.250-300bp區(qū)域2.至多50個(gè)具有與任何其它登錄或與人基因組70％或更大序列同源性的連續(xù)的核苷酸E.補(bǔ)充特異靶1.用零或一個(gè)靶區(qū)域鑒定任何登錄2.放寬嚴(yán)格參數(shù)到至多30個(gè)具有與任何其它登錄50％或更大序列同源性的連續(xù)核苷酸，但是至多50個(gè)具有與人基因組70％或更大序列同源性的連續(xù)核苷酸3.從1.E.1對登錄亞組再次進(jìn)行靶區(qū)域鑒定。F.鑒定保守的靶區(qū)域1.具有與至少一個(gè)其它登錄70％或更大同源性的70-300bp區(qū)域2.除去具有50或更多個(gè)具有與人基因組70％或更大序列同源性的連續(xù)核苷酸的保守的靶G.選擇探針1.對特異和保守的靶區(qū)域進(jìn)行Agilent陣列CGH探針選擇算法2.通過Agilent設(shè)計(jì)得分排列探針3.從每個(gè)登錄中1-5個(gè)特異的靶區(qū)域選擇1-3個(gè)排名最高的探針4.從每個(gè)保守的靶區(qū)域選擇1-3個(gè)排名最高的探針連鎖的宏基因組探針選擇A.將個(gè)體基因組、基因和部分序列下載到登錄的局部數(shù)據(jù)庫中B.將所有的登錄編輯進(jìn)單個(gè)連鎖的宏基因組以使基因組生物信息學(xué)工具的使用容易1.在每個(gè)登錄之間放置100個(gè)非特異的核苷酸(″N″)作為間隔區(qū)2.將登錄和間隔區(qū)加入6百萬-1千萬個(gè)堿基的染色體中C.針對宏基因組中的特異性進(jìn)行Agilent陣列CGH探針選擇算法D.對針對人、小鼠和/或其它哺乳動(dòng)物基因組的特異性過濾探針E.選擇特異的探針1.通過Agilent設(shè)計(jì)得分排列探針2.從每個(gè)登錄選擇10-20個(gè)排名最高的探針3.探針之間需要至少100bp分離F.選擇保守的探針1.如在1.F.中鑒定保守的區(qū)域2.從每個(gè)保守區(qū)域選擇5-10個(gè)排名最高的探針3.探針之間需要至少100bp分離G.經(jīng)驗(yàn)的探針選擇1.制造含有所有特異和保守的探針的微陣列2.使微陣列與標(biāo)記的人DNA雜交3.從每個(gè)登錄選擇5-10個(gè)具有最低交叉雜交信號的特異的探針4.從每個(gè)保守區(qū)域選擇3-5個(gè)具有最低交叉雜交信號的保守的探針樣品制備本發(fā)明還提供分析存在于樣品中的多個(gè)類型核酸——包括DNA和RNA——的方法。在各種實(shí)施方式中，樣品制備包括提取核酸分子(例如，DNA和RNA)的混合物。在其它實(shí)施方式中，樣品制備包括提取來自多個(gè)生物、細(xì)胞類型、傳染因子、或其任何組合的核酸混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品制備包括下面的工作流。A.使基因組DNA成為片段B.通過隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA轉(zhuǎn)換成第一鏈cDNAC.通過化學(xué)或酶結(jié)合用生物素或熒光染料標(biāo)記基因組DNAD.通過化學(xué)或酶結(jié)合用生物素或熒光染料標(biāo)記cDNAE.在相同的化學(xué)或酶反應(yīng)中標(biāo)記基因組DNA和cDNA的混合物F.混合C+D和與探針的微陣列共雜交G.使E與探針的微陣列雜交H.擴(kuò)增靶向的基因組DNA1.使用全部基因組擴(kuò)增(GEGenomiPhi，SigmaWGA，NuGENOvationDNA)來非特異地?cái)U(kuò)增基因組DNA2.使用如針對4.C或4.E.所輸入的擴(kuò)增產(chǎn)物I.擴(kuò)增靶向總RNA1.使用全部轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(SigmaWTA，Ambioninvitrotranscription，NuGENOvationRNA)來非特異地?cái)U(kuò)增總RNA2.使用如針對4.D.或4.E.所輸入的擴(kuò)增產(chǎn)物使樣品與微陣列(例如，PathoChip)雜交，和將微陣列以多種嚴(yán)格性清洗。掃描微陣列用于熒光檢測。應(yīng)用背景校正和陣列間標(biāo)準(zhǔn)化算法。應(yīng)用檢測閾。針對統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析結(jié)果。核酸擴(kuò)增將靶核酸序列在檢測之前任選地?cái)U(kuò)增。術(shù)語“擴(kuò)增”定義從單個(gè)或較低拷貝數(shù)的核酸序列分子制備多拷貝核酸的過程。核酸序列的擴(kuò)增在體外通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物化學(xué)過程進(jìn)行。在鑒定之前或與鑒定同時(shí)，病毒樣品可通過許多種機(jī)制擴(kuò)增，機(jī)制中的一些可利用PCR。例如，用于長距離PCR的引物可被設(shè)計(jì)以擴(kuò)增序列的區(qū)域。對于RNA病毒，第一逆轉(zhuǎn)錄酶步驟可用于從單鏈RNA產(chǎn)生雙鏈DNA。參見，例如，PCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification(Ed.H.A.Erlich，F(xiàn)reemanPress，NY，N.Y.，1992)；PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(Eds.Innis，etal.，AcademicPress，SanDiego，Calif.，1990)；Mattilaetal.，NucleicAcidsRes.19，4967(1991)；Eckertetal.，PCRMethodsandApplications1，17(1991)；PCR(Eds.McPhersonetal.，IRLPress，Oxford)；和美國專利號4,683,202、4,683,195、4,800,1594,965,188和5,333,675。樣品可在陣列上擴(kuò)增。參見，例如，美國專利號6,300,070和美國系列號09/513,300。其它合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(例如，WuandWallace，Genomics4，560(1989)，Landegrenetal.，Science241，1077(1988)和Barringeretal.Gene89：117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwohetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，1173(1989)和WO88/10315)、自主序列復(fù)制(Guatellietal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995)、靶聚核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增(美國專利號6,410,276)、共有序列引物PCR(CP-PCR)(美國專利號4,437,975)、任意引物PCR(AP-PCR)(美國專利號5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)(參見，美國專利號5,409,818、5,554,517、和6,063,603)?？墒褂玫钠渌鼣U(kuò)增方法在，美國專利號5,242,794，5,494,810，4,988,617中和在美國系列號09/854,317中描述。樣品制備的另外方法和減少核樣品復(fù)雜性的技術(shù)在Dongetal.，GenomeResearch11，1418(2001)中，在美國專利號6,361,947、6,391,592和美國系列號09/916,135、09/920,491(美國專利申請公開20030096235)、09/910,292(美國專利申請公開20030082543)、和10/013,598中描述。生物標(biāo)志的檢測該發(fā)明的生物標(biāo)志可通過任何合適的方法來檢測。本文描述的方法可單獨(dú)或組合使用，用于更準(zhǔn)確的生物標(biāo)志檢測。在本領(lǐng)域中已發(fā)展了進(jìn)行聚核苷酸雜交測定的方法。雜交測定程序和條件將依賴應(yīng)用而變化，并根據(jù)已知的一般的結(jié)合方法來選擇，包括以下所提到的：SambrookandRussell，MolecularCloning：ALaboratoryManual(3rdEd.ColdSpringHarbor，N.Y，2001)；BergerandKimmelMethodsinEnzymology，Vol.152，GuidetoMolecularCloningTechniques(AcademicPress，Inc.，SanDiego，Calif.，1987)；YoungandDavism，P.N.A.S，80：1194(1983)。進(jìn)行重復(fù)和可控的雜交反應(yīng)的方法和裝置已在美國專利號5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中描述。用于解釋來自陣列的雜交結(jié)果的數(shù)據(jù)分析算法(E-預(yù)測)可公開地獲得(參見Urisman，2005，GenomeBiol6：R78)。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交的核酸通過檢測一種或多種附著于樣品核酸或摻入樣品核酸內(nèi)的標(biāo)記來檢測。標(biāo)記可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法中的任何一個(gè)來附著或摻入。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記在樣品核酸制備中的擴(kuò)增步驟期間同時(shí)摻入。因此，例如，具有標(biāo)記的引物或標(biāo)記的核苷酸的PCR將提供標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述，使用標(biāo)記的核苷酸(例如熒光素-標(biāo)記的UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增將標(biāo)記摻入轉(zhuǎn)錄的核酸中。在另一個(gè)實(shí)施方式中將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分成碎片和通過末端脫氧轉(zhuǎn)移酶和標(biāo)記的dNTPs標(biāo)記?？蛇x地，標(biāo)記可直接加到最初的核酸樣品(例如，mRNA、polyAmRNA、eDNA等)或在擴(kuò)增完成之后加到擴(kuò)增產(chǎn)物。將標(biāo)記附著于核酸的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并包括，例如，切口平移或末端標(biāo)記(例如用標(biāo)記的RNA)——其通過激酶激活核酸和將樣品核酸與標(biāo)記(例如，熒光基團(tuán))連接的核酸連接體的隨后附著(連接)。在另一個(gè)實(shí)施方式中使用末端脫氧轉(zhuǎn)移酶將標(biāo)記加到片段末端。適合用于本發(fā)明的可檢測的標(biāo)記包括通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法可檢測的任何組合物。本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括，但不限于：用于用標(biāo)記的鏈霉抗生物素結(jié)合物染色的生物素；抗生物素抗體、磁珠(例如，DynabeadsTM.)；熒光染料(例如，熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)；放射性標(biāo)記(例如，3H、125I、35S、4C或32p)；發(fā)磷光的標(biāo)記；酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和ELISA中通常使用的其它酶)；和色度法標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。教導(dǎo)這樣的標(biāo)記的使用的專利包括美國專利號3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。檢測這樣的標(biāo)記的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。因此，例如，放射性標(biāo)記可使用照相膠片或閃爍計(jì)數(shù)器來檢測；熒光標(biāo)志可使用光檢測器來檢測以檢測發(fā)出的光。酶標(biāo)記通常通過將底物提供給酶和檢測通過底物上酶的作用而產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測，和測熱標(biāo)記通過僅使有色標(biāo)記看得見來檢測。用于信號檢測和強(qiáng)度數(shù)據(jù)處理的方法和裝置在以下中公開，例如，美國專利號5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758；5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639；6,218,803；和6,225,625美國系列號10/389,194、60/493,495和PCT申請PCT/US99/06097(公布為WO99/47964)。通過生物芯片的檢測在本發(fā)明的方面中，樣品通過生物芯片(也稱作微陣列)來分析。本發(fā)明的核酸分子用作生物芯片中可雜交的陣列元件。生物芯片通常包括固體基底和具有通常平的表面，捕獲試劑(也稱作吸附或親和試劑)附著到該表面。經(jīng)常地，生物芯片表面包括多個(gè)可尋址的位置，其每個(gè)都有捕獲試劑結(jié)合在那里。以有序的方式組織陣列元件以便每個(gè)元件存在于基底上的指定位置。有用的基底材料包括由紙、尼龍或其它材料組成的膜、過濾器、芯片、載玻片、和其它固體載體。陣列元件的有序排列允許雜交模式和強(qiáng)度被解釋為特定基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。制備核酸微陣列的方法對技術(shù)人員是已知的和在以下中描述，例如，美國專利號5,837,832，Lockhart，etal.(Nat.Biotech.14：1675-1680，1996)、和Schena，etal.(Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619，1996)，其在本文通過引用被并入。美國專利號5,800,992和6,040,138描述制備可用于檢測含有特定核苷酸序列的核酸存在的核酸探針陣列的方法。用最小數(shù)目的合成步驟形成核酸、肽和其它聚合物序列的高密度陣列的方法是已知的。核酸陣列可通過許多種方法在固體基底上合成，這些方法包括，但不限于，光定向化學(xué)偶聯(lián)和機(jī)械定向偶聯(lián)。對于關(guān)于重新測序陣列的另外描述和方法參見美國專利申請系列號10/658,879、60/417,190、09/381,480、60/409,396和美國專利號5,861,242、6,027,880、5,837,832、6,723,503。通過核酸生物芯片的檢測在本發(fā)明的方面，樣品通過核酸生物芯片(也稱作核酸微陣列)來分析。為了產(chǎn)生核酸生物芯片，使用化學(xué)偶聯(lián)操作和噴墨應(yīng)用裝置可將寡核苷酸可合成或結(jié)合到基底表面，如PCT申請W095/251116(Baldeschweileretal.)中所描述的?？蛇x地，使用真空系統(tǒng)、熱、UV、機(jī)械或化學(xué)鍵合操作，網(wǎng)格陣列可用于排列和連接cDNA片段或寡核苷酸至基底表面。用于本發(fā)明的示例性的核酸分子包括特異地結(jié)合核酸生物標(biāo)志至一種或多種致病生物的聚核苷酸、和其片段。來自生物樣品的核酸分子(例如RNA或DNA)可用于產(chǎn)生雜交探針，如本文描述的。生物樣品通常來自患者，例如，作為體液(如血液、血清、血漿、唾液、尿、腹水、囊腫液等)；勻漿的組織樣品(例如，通過活組織檢查獲得的組織樣品)；或分離自患者樣品的細(xì)胞。為了一些應(yīng)用，可使用培養(yǎng)的細(xì)胞或其它組織制備物。mRNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法來分離，產(chǎn)生cDNA并用作模板以制備適合雜交的互補(bǔ)的RNA。這樣的方法在本領(lǐng)域眾所周知。在存在熒光核苷酸的情況下擴(kuò)增RNA，然后將標(biāo)記的探針與微陣列溫育以允許探針序列與結(jié)合到生物芯片的互補(bǔ)的寡核苷酸雜交。調(diào)節(jié)溫育條件以便雜交發(fā)生，具有精確的互補(bǔ)的匹配或具有多種較少的互補(bǔ)性程度——取決于利用的嚴(yán)格度。例如，嚴(yán)格的鹽濃度將通常小于約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，小于約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，或小于約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格雜交可在缺少有機(jī)溶劑，例如，甲酰胺的情況下獲得，而高嚴(yán)格雜交可在存在至少約35％甲酰胺，和最優(yōu)選至少約50％甲酰胺的情況下火的。嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約30C、至少約37C、或至少約42C的溫度。不同的另外的參數(shù)，如雜交時(shí)間、去垢劑例如十二烷硫酸鈉(SDS)的濃度、和載體DNA的包含或排除對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。如需要，嚴(yán)格的多種水平通過組合這些不同的條件而實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在30C在750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉、和1％SDS中發(fā)生。在實(shí)施方式中，雜交將在37C在500mMNaCl、50mM檸檬酸三鈉、1％SDS、35％甲酰胺、和100μg/ml變性的鮭精DNA(ssDNA)中發(fā)生。在其它實(shí)施方式中，雜交將在42C在250mMNaCl、25mM檸檬酸三鈉、1％SDS，50％甲酰胺、和200μg/mlssDNA中發(fā)生。這些條件的有用變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。非雜交的探針的去除可，例如，通過清洗而實(shí)現(xiàn)。跟隨雜交的清洗步驟在嚴(yán)格方面還可變化。清洗嚴(yán)格條件可通過鹽濃度和通過溫度來限定。如上，清洗嚴(yán)格可通過降低鹽濃度或通過增加溫度而增加。例如，用于清洗步驟的嚴(yán)格的鹽濃度將優(yōu)選是小于約30mMNaCl和3mM檸檬酸三鈉，和最優(yōu)選小于約15mMNaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。用于清洗步驟的嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約25C、至少約42C、或至少約68C的溫度。在實(shí)施方式中，清洗步驟將在25C在30mMNaCl、3mM檸檬酸三鈉、和0.1％SDS中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，清洗步驟將在42C在15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉、和0.1％SDS中發(fā)生。在其它實(shí)施方式中，清洗步驟將在68C在15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉、和0.1％SDS中發(fā)生。這些條件的另外變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。用于測量針對所有不同的核酸序列的雜交的存在、缺乏和量的檢測系統(tǒng)在本領(lǐng)域眾所周知。例如，同時(shí)的檢測在Helleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：2150-2155，1997中描述。在實(shí)施方式中，掃描儀用于測定和熒光的水平和模式。診斷測定本發(fā)明提供許多診斷測定，其用于鑒定或表征疾病或病癥(例如，傳染病)、或發(fā)展這樣的狀況的傾向。在一個(gè)實(shí)施方式中，疾病、病癥、或狀況通過定量一種或多種來自一種或多種致病生物——包括病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和原生動(dòng)物——的生物標(biāo)志的水平來表征。雖然下面提供的實(shí)例描述了檢測這些標(biāo)志的水平的方法，但是技術(shù)人員理解，本發(fā)明不限于這樣的方法。標(biāo)志水平通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法是可定量的，這樣的方法包括，但不限于實(shí)時(shí)PCR、Southern印跡、PCR、和/或質(zhì)譜法。本文描述的標(biāo)志的任何兩種或更多的水平定義疾病、病癥、狀況的標(biāo)志概況。將標(biāo)志的水平與參考比較。在一個(gè)實(shí)施方式中，參考是存在于獲自不具有疾病、病癥、或狀況的患者的對照樣品的標(biāo)志的水平。在另一個(gè)實(shí)施方式中，參考是在疾病、病癥、或狀況的治療之前、期間、或之后來自患者的生物樣品的標(biāo)志的基線水平。在再一個(gè)實(shí)施方式中，參考是標(biāo)準(zhǔn)化的曲線。本文描述的標(biāo)志(例如，病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲、和/或原生動(dòng)物生物標(biāo)志的組合)的任何一種或多種的水平單獨(dú)或與其它標(biāo)準(zhǔn)方法組合使用以表征疾病、病癥、或狀況。在硬件和/或軟件中的執(zhí)行本文描述的方法可在通用或特別程序設(shè)計(jì)的硬件或軟件上執(zhí)行。例如，該方法可通過計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)執(zhí)行。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供軟件和/或計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)物，其被配置以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的任何實(shí)施方式的算法和/或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何配置可進(jìn)行本發(fā)明中提供的算法和/或方法的軟件。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以是非短暫的和/或有形的。例如，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以是易失性存儲器(例如，隨機(jī)存取存儲器等)或非易失性存儲器(例如，只讀存儲器、硬盤、軟盤、磁帶、光盤、紙桌(papertable)、穿孔卡等)。計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令可以以合適的計(jì)算機(jī)語言或幾種語言的組合來書寫?；镜挠?jì)算生物學(xué)方法在，例如Setubal和Meidanisetal.，IntroductiontoComputationalBiologyMethods(PWSPublishingCompany，Boston，1997)；Salzberg，Searles，Kasif，(Ed.)，ComputationalMethodsinMolecularBiology，(Elsevier，Amsterdam，1998)；RashidiandBuehler，BioinformaticsBasics：ApplicationinBiologicalScienceandMedicine(CRCPress，London，2000)andOueletteandBzevanisBioinformatics：APracticalGuideforAnalysisofGeneandProteins(Wiley&Sons，Inc.，2nded.，2001)中描述。本發(fā)明還可利用多種計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)物和軟件用于許多種目的，如探針設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理、分析、和儀器操作。(參見，美國專利號5,593,839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170)。另外，本發(fā)明可具有優(yōu)選的實(shí)施方式，其包括在網(wǎng)絡(luò)如因特網(wǎng)上提供遺傳信息的方法，如美國系列號10/197,621、10/063,559(美國公開號20020183936)、10/065,856、10/065,868、10/328,818、10/328,872、10/423,403和60/482,389中所示。試劑盒本發(fā)明提供用于生物標(biāo)志檢測的試劑盒，所述生物標(biāo)志指示一種或多種能引起疾病、病癥、或狀況的生物制劑的存在。試劑盒可用于檢測多個(gè)能引起一種或多種疾病或病癥的生物制劑的存在。試劑盒可用于疾病、病癥、或狀況的診斷。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括針對核酸生物標(biāo)志的探針組或收集(例如，PathoChip)。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括一種或多種無菌容器，其含有針對核酸生物標(biāo)志的探針組、或微陣列芯片。這樣的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝、或本領(lǐng)域已知的其它合適的容器形式。這樣的容器可由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或適于容納藥物的其它材料。說明書將通常包括信息關(guān)于用于疾病或病癥的檢測或診斷的組合物的使用。在其它實(shí)施方式中，說明書包括以下中的至少一個(gè)：治療劑的描述；用于疾病、病癥、或其癥狀的治療或預(yù)防的劑量日程表和施用；警惕；警告；適應(yīng)證；相反的適應(yīng)證(counter-indications)；超劑量信息；不良反應(yīng)；動(dòng)物藥理學(xué)；臨床研究、和/或參考。說明書可直接印刷在容器(當(dāng)存在時(shí))上，或作為應(yīng)用到容器的標(biāo)簽，或作為容器中提供的或同容器一起提供的單獨(dú)的紙、小冊子、卡片或折疊式印刷品。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施利用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在技術(shù)人員的視界內(nèi)是好的。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分說明，如，“MolecularCloning：ALaboratoryManual”，secondedition(Sambrook，1989)；“OligonucleotideSynthesis”(Gait，1984)；“AnimalCellCulture”(Freshney，1987)；“MethodsinEnzymology”“HandbookofExperimentalImmunology”(Weir，1996)；“GeneTransferVectorsforMammalianCells”(MillerandCalos，1987)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel，1987)；“PCR：ThePolymeraseChainReaction”，(Mullis，1994)；“CurrentProtocolsinImmunology”(Coligan，1991)。這些技術(shù)適用于本發(fā)明的聚核苷酸和多肽的產(chǎn)生，并且，像這樣，可在產(chǎn)生和實(shí)施本發(fā)明中被考慮。用于具體實(shí)施方式的具體有用的技術(shù)將在下面的部分中討論。以下實(shí)施例被列出以提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員如何制備和使用本發(fā)明的測定、篩選、和治療方法的全部公開和描述，并且不意欲限制發(fā)明人視為他們的發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1.材料和方法微陣列設(shè)計(jì)針對所有的分類學(xué)＝病毒注釋，和針對來自通過文獻(xiàn)檢索和網(wǎng)資源(www.niaid.nih.gov：EmergingandRe-emergingInfectiousDiseases，CategoryA，B，andCPriorityPathogens)編輯的原核和真核的人病原體列表的登錄，查詢針對基因組、基因和核苷酸登錄的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)。產(chǎn)生的登錄組裝成非冗余的連鎖，登錄之間具有100N核苷酸分離器。將該宏基因組分成58條“染色體”，每個(gè)的長度大約5百萬-1千萬個(gè)核苷酸，并提交給AgilentTechnologies(SantaClaraCA，USA)作為定制設(shè)計(jì)項(xiàng)目。探針序列(50-60nt)使用Agilent陣列比較的基因組雜交(aCGH)設(shè)計(jì)算法來選擇，然后針對與人基因組序列交叉雜交的低可能性過濾。獨(dú)立地，使用mdust(http：//doc.bionerl.org/bioperl-run/lib/Bio/Tools/Run/Mdust.html)掩蔽宏基因組中低復(fù)雜性區(qū)域，之后是病毒登錄中獨(dú)特區(qū)域的BLASTN2.0MP-WashU31鑒定。獨(dú)特區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)是250-300bp和＜50個(gè)連續(xù)bp，具有與任何其它宏基因組登錄中的序列＞70％同源性。保守的病毒區(qū)域使用70-300bp和與至少一個(gè)其它病毒但不是人序列＞70％同源性的標(biāo)準(zhǔn)被相似地鑒定。如果針對來源登錄獲得少于10個(gè)探針，則將繪制到獨(dú)特或保守的病毒區(qū)域、或任何原核或真核病原體登錄的所有的Agilent設(shè)計(jì)的探針通過默認(rèn)加入到微陣列設(shè)計(jì)。否則，針對100bp的最小的探針之間的間距和大致覆蓋每個(gè)登錄的全長同時(shí)將探針數(shù)限制到每個(gè)登錄10-20的分布過濾探針。探針數(shù)沒有針對已知的致癌生物受限制，以可能具有所有可得到的Agilent設(shè)計(jì)的探針的程度產(chǎn)生覆蓋這些登錄的全體序列的飽和疊瓦組。將微陣列補(bǔ)充預(yù)先設(shè)計(jì)的針對來自人基因組的660個(gè)基因和602個(gè)基因間區(qū)域的aCGH探針，和針對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的探針。探針和登錄注釋中GeneExpressionOmnibus(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中可獲得。樣品制備從樣品提取總核酸。基因組DNA和/或來自隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄的總RNA的cDNA的全基因組擴(kuò)增(WGA)使用賣主推薦的方案和輸入量用IllustraGenomiPhiv2試劑盒(GEHealthcareBio-Sciences，PittsburghPA，USA)、OvationWGA系統(tǒng)(NuGEN，SanCarlosCA，USA)、和GenomePlex或TransPlex試劑盒(WGA2，WTA2，Sigma-Aldrich，St.LouisMO，USA)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，和2ug用于SureTagLabeling試劑盒(Agilent)進(jìn)行的Cy3染料標(biāo)記。Cy5染料標(biāo)記對2ug來自AgilentSureTag試劑盒的人參考DNA進(jìn)行，沒有在WGA(實(shí)驗(yàn)1，表1)之前或在WGA(所有其它實(shí)驗(yàn))之后，作為對照以報(bào)道探針與人(xhh)DNA的交叉雜交。標(biāo)記的DNA用SureTag試劑盒旋轉(zhuǎn)柱純化和計(jì)算比活性。微陣列產(chǎn)生和處理SurePrint載玻片微陣列(Agilent)用每個(gè)載玻片八個(gè)平行測定陣列上60,000個(gè)特征中合成的60ntDNA寡聚體制造。PathoChipv2a和v2b分別含有60,000個(gè)針對獨(dú)特靶區(qū)域或保守加飽和靶區(qū)域的探針。PathoChipv3含有37,704個(gè)針對獨(dú)特靶的探針和23,627個(gè)用于保守靶或使已知致癌劑飽和的探針。將標(biāo)記的樣品與微陣列雜交，如針對GenomicDNAAnalysis方案(7.2版本，G4410-90010)的AgilentOligonucleotideArray-BasedCGH中所描述的。將含有CGH封閉劑、HI-RPM雜交緩沖劑、和Cot-1DNA(只是先導(dǎo)測定)的總的混合物加入全部標(biāo)記的測試樣品和xhh對照樣品的混合物，變性，并與陣列在8-室墊圈載玻片下在65℃伴隨20rpm旋轉(zhuǎn)在AgilentHybridizationOven中雜交40小時(shí)。陣列使用清洗程序A處理，并在AgilentSureScanG4900DA微陣列掃描儀上掃描。微陣列數(shù)據(jù)分析掃描的微陣列圖象使用Agilent特征提取軟件分析以針對每個(gè)特征計(jì)算平均象素強(qiáng)度和減去局部背景。手動(dòng)檢查圖象以記錄受高背景、劃痕或其它技術(shù)誤差影響的任何陣列。特征強(qiáng)度分布和通道平衡沒有用于質(zhì)量控制，因?yàn)槠谕蠖鄶?shù)特征沒有信號，除了針對對照人探針。將針對Cy3和Cy5通道的特征強(qiáng)度輸入進(jìn)PartekGenomicsSuite(PartekInc.，St.LouisMO，USA)。針對共雜交的測試和xhh樣品計(jì)算人基因間對照探針的特征強(qiáng)度，并測定標(biāo)度因子，其將使Cy5xhh平均數(shù)等于Cy3平均數(shù)。然后將針對所有PathoChip探針的Cy5強(qiáng)度乘以標(biāo)度因子以使染料性能的差異標(biāo)準(zhǔn)化。針對每個(gè)探針分別計(jì)算Cy3/Cy5比和Cy3-Cy5減法以為雙通道或單通道分析管線提供輸入。將登錄平均數(shù)(AccAvg)定義為針對一個(gè)登錄跨所有探針的平均的Cy3或Cy5強(qiáng)度，并將登錄信號(AccSig)定義為AccAvg(Cy3)-AccAvg(Cy5)。如Partek中所執(zhí)行的Tiling-陣列(MAT)32的基于模型的分析用于針對每個(gè)樣品的探針信號(Cy3減Cy5)的滑動(dòng)窗分析。MAT參數(shù)是p值截止值0.99、窗口5000bp、陽性探針最小數(shù)5、和丟棄0％。候選區(qū)域由MAT得分30-300、300-3000、和＞3000分類。將所有樣品用作測試條件的平行測定，共雜交的xhhDNA平行測定作為對照條件，PartekANOVA工具用于進(jìn)行具有多個(gè)測試校正的配對t檢驗(yàn)。在登錄水平使用AccAvg(Cy3)對AccAvg(Cy5)和在單個(gè)探針?biāo)绞褂肅y3對Cy5強(qiáng)度值進(jìn)行比較。將顯著性閾值設(shè)在加速的假發(fā)現(xiàn)率＜0.05和倍數(shù)差異＞2。離群值分析也在登錄和探針?biāo)竭M(jìn)行通過計(jì)算AccSig或探針信號的標(biāo)準(zhǔn)差和針對高于總體平均值兩個(gè)或更多標(biāo)準(zhǔn)差的任何值過濾來進(jìn)行。實(shí)施例2.微陣列設(shè)計(jì)PathoChip設(shè)計(jì)目標(biāo)是使用多個(gè)針對每個(gè)物種的基因組中獨(dú)立靶位的探針，覆蓋所有公開的NCBI病毒基因組，和來自對人致病的選擇的微生物的序列(圖2A)。將產(chǎn)生的序列的收集裝配進(jìn)含有對超過4200個(gè)病毒、細(xì)菌和真核生物的5206個(gè)登錄針的44.89千萬bp的宏基因組。針對比較基因組雜交應(yīng)用建立的Agilent定制探針設(shè)計(jì)算法用于鑒定宏基因組中5百50萬個(gè)探針，其超過3百萬個(gè)被預(yù)測具有與人基因組序列交叉雜交的低風(fēng)險(xiǎn)。將繪制成獨(dú)特靶區(qū)域的這些探針的亞組在PathoChipv2a微陣列上合成，覆蓋至少兩個(gè)病毒之間序列保守區(qū)域的分離的組在PathoChipv2b陣列上合成(圖2B)。PathoChipv2b還包括遍及針對已知癌癥相關(guān)的生物的22個(gè)登錄長度鋪瓦的2085個(gè)探針。使用Agilent參考人DNA的先導(dǎo)測定顯示對于針對人序列的探針超過750個(gè)熒光單位的中間的探針強(qiáng)度，和PathoChipv2a上對于非人特異的探針的大約17個(gè)熒光單位和PathoChipv2b上對于非人保守的探針的120熒光單位(表1)。這些測定鑒定6360個(gè)熒光＞150的探針，其明顯地與人DNA雜交，并因此從針對PathoChipv3設(shè)計(jì)的考慮中去除(圖2B)。表1.針對人序列的探針實(shí)施例3.針對靶向的物種最佳表現(xiàn)探針的鑒定靶生物——包括嗜肺軍團(tuán)病桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸道沙門氏菌、弗氏志賀菌、和單核細(xì)胞增生利斯特菌——在純培養(yǎng)物中生長，并將每個(gè)靶生物2百萬個(gè)細(xì)胞混合進(jìn)一個(gè)原液。含有每個(gè)靶1000、100、10或1個(gè)細(xì)胞的稀釋的原液的等分部分用于DNA+RNA提取、擴(kuò)增、和與PathoChipv3雜交。分析針對每個(gè)靶的所有探針以鑒定具有針對嗜肺軍團(tuán)病桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸道沙門氏菌、弗氏志賀菌、和單核細(xì)胞增生利斯特菌高靈敏度的探針亞組(圖5A-5I)。合計(jì)選擇的探針以報(bào)道針對腸道沙門氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特菌、弗氏志賀菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、大腸桿菌O157：H7、和嗜肺軍團(tuán)病桿菌中每個(gè)的單個(gè)檢測信號(圖6A-6H)。這些結(jié)果表示PathoChip能以靈敏度檢測多種靶生物的存在。實(shí)施例4.在存在人和植物背景DNA+RNA的情況下的測試的測定使用靶生物與人和萵苣細(xì)胞的混合物測試PathoChipv3。將稀釋的細(xì)菌混合物的等分部分與100,000個(gè)人細(xì)胞和100mg萵苣混合。對照樣品只含有人和萵苣細(xì)胞。將全部樣品體積用于核酸提取。將從每個(gè)樣品收回的的所有的DNA和RNA擴(kuò)增、標(biāo)記和與PathoChipv3雜交。將檢測信號計(jì)算為針對每個(gè)測試樣品(實(shí)線)和對照樣品背景(虛線)的選擇的探針總和(圖7A)。針對與人和萵苣細(xì)胞混合的大腸桿菌O157：H7、嗜肺軍團(tuán)病桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特菌、腸道沙門氏菌、弗氏志賀菌、霍亂弧菌、和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌細(xì)胞中的每個(gè)獲得檢測信號(圖7B-7H。大量宿主細(xì)胞背景中的少量病原體細(xì)胞可被檢測，但是與純的病原體培養(yǎng)物相比具有較少的絕對信號(參見，圖6B-6H)。測試信號和只有宿主的對照信號之間的差異指示檢測能力。這些結(jié)果指示PathoChip能在存在背景RNA和DNA的情況下以高靈敏度檢測多種靶生物的存在。實(shí)施例5.在存在食物背景DNA+RNA情況下的測試的測定使用靶生物和多種食物的混合物測試PathoChipv3。靶生物，包括鼠弓形體、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌O157：H7、嗜肺軍團(tuán)病桿菌、腸道沙門氏菌、弗氏志賀菌。將稀釋的病原體混合物(每個(gè)物種1000或100個(gè)細(xì)胞)的等分部分與牛奶(圖8A-8H)、西紅柿(圖9A-9H)、或蛤(圖10A-10D)混合。對照樣品只含有食物。將全部樣品體積用于核酸提取。將全部樣品體積用于核酸提取。將從每個(gè)樣品收回的的所有的DNA和RNA擴(kuò)增、標(biāo)記和與PathoChipv3雜交。將檢測信號計(jì)算為針對每個(gè)測試樣品和對照樣品背景的選擇的探針總和。這些結(jié)果指示PathoChip能以高靈敏度檢測食物中多種靶生物的存在。實(shí)施例6.患者樣品中未知傳染因子的檢測和鑒定傳染病的臨床管理中的重要因素在于建立形成該傳染的原因的病原體的鑒定?？焖俸蜏?zhǔn)確的診斷告知治療選擇并對患者結(jié)局具有直接影響。PathoChip和與其一起使用的提取方案為檢測和分析來自任何類型樣品的病原體提供方法，因此克服限制當(dāng)前的病原體檢測程序的挑戰(zhàn)。使用PathoChip的患者樣品的分析能檢測醫(yī)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室不能鑒定的真菌劑。當(dāng)患者被收入院和呈現(xiàn)感染癥狀時(shí)他病的很厲害。來自患者的腦樣品通過查詢具有分離自獲得的樣品的總核酸的PathoChip來分析。PathoChip的60,000個(gè)探針的附加分析鑒定與根毛霉菌屬的真菌相關(guān)的強(qiáng)信號(圖11)。產(chǎn)生顯示登錄分析選擇的登錄的所有探針雜交信號的熱圖數(shù)據(jù)(圖12A)。忽視未被檢測到或也存在于對照的探針(圖13B)，留下許多指示真菌雜交信號的探針(圖12B)。實(shí)際上，提供高登錄信號的前2種病原體是微小根毛霉菌株NRRL28626和miehel根毛霉菌(圖13)。具有高登錄信號的其它病原體是微小根毛霉和喉紅酵母屬，雖然與前2種病原體相比登錄信號實(shí)質(zhì)上較低。由于微小根毛霉菌株NRRL28626和miehel根毛霉菌均具有來自篩選的顯著信號，所以這2種劑被鑒定為病原體。有意思地，該真菌的兩種不同種能使用PathoChip鑒定和區(qū)分，證明該技術(shù)的能力。因此，PathoChip顯示作為通過鑒定與該類型感染有關(guān)的2種相關(guān)真菌的臨床測定是有用的?；谠撛\斷，抗真菌治療計(jì)劃可針對患者選擇。雜交中傳染因子的鑒定保守估計(jì)在約36小時(shí)中實(shí)現(xiàn)以防止信號丟失。期望優(yōu)化的方案可將時(shí)間大量減少到24小時(shí)內(nèi)檢測并且不長于48小時(shí)。該示范清楚地顯示PathoChip鑒定患者樣品中未知?jiǎng)┑哪芰Γ湓谳^大的大都市醫(yī)院的臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中甚至是不可能的。其它實(shí)施方式從上述描述，顯然，對本文描述的發(fā)明可進(jìn)行改變和修改以使其接受多種使用和條件。這樣的實(shí)施方式也在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文變量的任何限定中的元件列表的敘述包括作為任何單個(gè)元件或列出的元件的組合(或亞組合)的該變量的限定。本文實(shí)施方式的敘述包括作為任何單個(gè)實(shí)施方式或與任何其它實(shí)施方式或其部分組合的實(shí)施方式。該說明書中提到的所有的專利、出版物、和登錄號以好像每個(gè)獨(dú)立的專利、出版物、和登錄號被具體和各自地指出以通過引用被并入的相同程度在本文通過引用被并入。當(dāng)前第1頁1 2 3