專(zhuān)利名稱(chēng)：殺蟲(chóng)晶體蛋白BT-Cry1Ab/1Ac快速檢測(cè)試條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白，特別是BT-Cry1Ab/1Ac的檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)條，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Bt(Bacillus thuringiensis)即蘇蕓金芽孢桿菌的簡(jiǎn)稱(chēng)，Bt殺蟲(chóng)劑是利用Bt殺蟲(chóng)菌，經(jīng)培養(yǎng)生產(chǎn)的一種微生物制劑。這種殺蟲(chóng)菌，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生芽孢并形成一種蛋白質(zhì)毒素，在顯微鏡下觀察，通常是不規(guī)則的結(jié)晶，叫做伴孢晶體。當(dāng)害蟲(chóng)蠶食了伴孢晶體或芽孢之后，在害蟲(chóng)的腸內(nèi)堿性環(huán)境中，伴孢晶體溶解，然后被蛋白酶酶解，釋放出對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等幼蟲(chóng)有較強(qiáng)毒殺作用的毒性分子片段，于消化道上皮細(xì)胞表面特異受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞膜上形成微小孔道，致使胞內(nèi)離子外流，胞外水分進(jìn)入細(xì)胞，最終細(xì)胞腫脹裂解，昆蟲(chóng)停止進(jìn)食而死亡。Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的選擇殺蟲(chóng)特性是由昆蟲(chóng)消化道上皮細(xì)胞表面的特異性受體決定的。根據(jù)晶體蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)以及敏感昆蟲(chóng)的范圍可以將目前分離得到的晶體蛋白分為5類(lèi)13個(gè)亞類(lèi)。以cry(crystal protein)命名。其中cry I的亞類(lèi)最多。各類(lèi)之間氨基酸序列同源性為20％-30％，亞類(lèi)間同源性為50％以上(cryIV除外)。cry I是研究的最多的一類(lèi)Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白，目前常見(jiàn)的轉(zhuǎn)Bt基因是cry IA(b)、(c)，cry9c。BT晶體蛋白具有高特異的殺蟲(chóng)活性，是近年來(lái)應(yīng)用最為廣泛的生物殺蟲(chóng)劑。BT晶體蛋白基因也成為轉(zhuǎn)基因研究中重要的外源基因。
轉(zhuǎn)Bt植物的檢測(cè)方法主要有三種(1)生物試法；(2)DNA檢測(cè)；(3)蛋白的免疫檢測(cè)。在這三種方法中，生物測(cè)試法用昆蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要統(tǒng)一蟲(chóng)源、蟲(chóng)齡，統(tǒng)一取樣部位，統(tǒng)一飼養(yǎng)條件，試驗(yàn)占用空間大，所需時(shí)間長(zhǎng)，不能對(duì)大量樣本進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果變異大，且難以進(jìn)行橫向和縱向的比較，現(xiàn)在很少采用；DNA檢測(cè)只是檢測(cè)基因，并不代表蛋白水平，對(duì)于抗性的高低并無(wú)指導(dǎo)意義，而且方法復(fù)雜，步驟繁瑣，假陽(yáng)性高，不適合對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；免疫檢測(cè)方法采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物樣本中BT-Cry1Ab和BT-Cry1Ac的快速檢測(cè)，該方法方便、實(shí)用、快速、經(jīng)濟(jì)，是目前轉(zhuǎn)基因BT-Cry1Ab/1Ac蛋白檢測(cè)的發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白，特別是BT-Cry1Ab/1Ac的快速、特異、敏感、方便的定性或半定量分析檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)試條，一步檢測(cè)植物樣品中是否含BT-Cry1Ab或BT-Cry1Ac基因，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開(kāi)發(fā)，或是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是(1)氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小(徑在1-150nm)的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金，屬于多相不均一體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。顆粒顏色不同是由直徑大小不同引起的。(2)膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)(抗體)大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合，屬于物理吸附。(3)膠體金標(biāo)記抗體通過(guò)高度特異的抗原抗體反應(yīng)(雙抗體夾心法抗體—抗原—抗體)，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的特異檢測(cè)。(4)來(lái)自一種抗原決定簇的單抗或多抗包被于反應(yīng)膜上作為檢查帶，來(lái)自另一種抗原決定簇的單抗標(biāo)記上膠體金作為顯色劑，以抗原(轉(zhuǎn)基因BT-Cry1Ab1/Ac)為中間偶聯(lián)體，將分散狀態(tài)下太小肉眼無(wú)法觀察到的膠體金顆粒通過(guò)免疫反應(yīng)聚集在反應(yīng)膜上，使膠體金顏色被放大肉眼能夠觀察到。膠體金的這種顯色方式為物理顯色，無(wú)需底物參與反應(yīng)，方法簡(jiǎn)單直觀。
本發(fā)明技術(shù)方案的核心是高度完善的膜反應(yīng)體系，可提供實(shí)現(xiàn)液體樣本平行移動(dòng)及完成免疫親和層析的特異反應(yīng)所須的各種條件。(1)BT-Cry1Ab/1Ac金標(biāo)免疫檢測(cè)試劑盒系統(tǒng)使用高分子纖維膜作為固相載體。該膜具有很強(qiáng)的蛋白吸附功能，BT-Cry1Ab/1Ac抗體包被于膜并經(jīng)干燥處理后即作為固相，可與液相中的相應(yīng)抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物快速結(jié)合。(2)在濕潤(rùn)狀態(tài)下，液相中的抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物可因“燈芯引流現(xiàn)象”作快速定向泳動(dòng)并與固相膜上的特異抗體結(jié)合，形成特異的金標(biāo)記抗體—抗原—抗體紅色沉積線。
作為BT-Cry1Ab/1Ac金標(biāo)免疫檢測(cè)試劑盒系統(tǒng)主體的膜反應(yīng)體系由以下部分組成M1高蛋白親和性的高分子纖維素膜，經(jīng)預(yù)處理后制備為反應(yīng)膜用來(lái)作為系統(tǒng)反應(yīng)的載體和顯示反應(yīng)結(jié)果。
M2a，M2b M3樣本墊，選用有較強(qiáng)吸水能力的高分子纖維素膜，經(jīng)特殊處理后，為反應(yīng)系統(tǒng)提供適合的反應(yīng)條件，并幫助吸取樣本。
M4膠體金墊，吸附力較強(qiáng)的高分子纖維素膜，作為膠體金標(biāo)記抗體的固相載體。
M5吸水墊，吸收檢測(cè)后的樣本。
M6塑料基板，作為反應(yīng)體系的支撐物。
M7不同規(guī)格的雙面和單面膠帶，用于固定各反應(yīng)膜和吸水材料于M6上。
M8透明保護(hù)膠帶，固定和保護(hù)樣本墊和膠體金墊M9彩色標(biāo)志膠帶，作為該檢測(cè)試條的特征標(biāo)識(shí)。
本發(fā)明還包括將反應(yīng)膜M1分為質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)。在質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠IgG形成質(zhì)控對(duì)照線(C)，在檢測(cè)區(qū)包被BT-Cry 1Ab/1A單抗或多克隆抗體形成反應(yīng)檢測(cè)線(T)。 本發(fā)明的預(yù)期反應(yīng)狀況及結(jié)果·陰性(-)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。位于質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)。如樣本中不含特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白，或其濃度低于檢測(cè)靈敏度，膠體金抗體在層析過(guò)程中不會(huì)與固定在膜上檢測(cè)帶內(nèi)的抗體反應(yīng)，因而測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)不會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色檢測(cè)帶。無(wú)論BT-Cry1Ab/1Ac蛋白是否存在于植物樣品中，一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。陰性結(jié)果表明待檢樣品中不含BT-Cry1Ab/1Ac蛋白或其含量在其閾值以下。
·陽(yáng)性(+)質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)紫紅色條帶。如果待植物樣品中BT-Cry1Ab/1Ac蛋白濃度高于其檢測(cè)閾值時(shí)，抗原免疫金與檢測(cè)帶上的另一抗體結(jié)合，因此在測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)出現(xiàn)紫紅色檢測(cè)帶。陽(yáng)性結(jié)果表明特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白含量在閾值以上。
·無(wú)效質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。


圖1是膜反應(yīng)體系M1的制備圖2是BT-Cry1Ab/1Ae快速檢測(cè)試條的結(jié)構(gòu)示意3是BT-Cry1Ab/1Ac快速檢測(cè)試條的俯視結(jié)構(gòu)示意4是BT-Cry1Ab/1Ac快速檢測(cè)試條檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果示意圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到1.BT-Cry1Ab/Ae單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。1周后，將Cry 1Ab/Ac單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先處理過(guò)的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1～3×106。10天后收獲腹水，以上過(guò)程皆在無(wú)菌條件下完成。
2.BT-Cry1Ab/Ac單克隆抗體的純化1)以DEAE離子交換層析及Sephacryl S 300分子篩對(duì)單抗進(jìn)行純化；SDS-PAGE平板電泳檢測(cè)純化單抗的純度；ELISA法測(cè)定單抗活性；2)純化過(guò)程取小鼠單抗腹水→3000rpm離心15分鐘→上清液加50％硫酸銨沉淀，過(guò)夜→3000rpm離心20分鐘→沉淀溶于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)→S-300凝膠柱→DEAE Blue層析柱→0-800mM NaCl梯度洗脫→超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測(cè)定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95％以上；4)蛋白濃度測(cè)定 紫外分光光度計(jì)測(cè)定279nm處的O.D.值，按以下公式計(jì)算蛋白含量OD279/1.4＝mg/ml(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約1mg/ml；5)單抗活性測(cè)定選用Cry1Ac抗原包被ELISA板(1μg/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP復(fù)合物，測(cè)定各單抗效價(jià)(大于1∶5000)。
3.羊抗鼠IgG高效價(jià)免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑→免疫山羊→加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月→第二次加強(qiáng)后10天左右取血→離心取血清→硫酸銨沉淀→DEAE離子交換層析純化；
2)效價(jià)測(cè)定ELISA夾心法，抗體效價(jià)稀釋度應(yīng)大于1∶256；3)蛋白濃度測(cè)定紫外分光法測(cè)定OD279，計(jì)算蛋白濃度。
4.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0.01％HauCl4加熱至沸，加入一定量的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由蘭→紫→紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長(zhǎng)期保存，可加入0.02％NaN3。
2)將膠體金液500ml用0.1M NaOH調(diào)pH8.4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2ml，攪拌20分鐘。5500rpm離心30Min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4℃保存。
5.膜反應(yīng)體系M1的制備1)將Cry 1Ab/Ac抗體及純化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)K濃度為約0.2-2mg/ml。
2)純化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2.0mg/ml；3)硝酸纖維素膜大小10cm×27cm，每張膜可噴長(zhǎng)25cm的檢測(cè)及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個(gè)噴頭儲(chǔ)存瓶中；5)設(shè)置噴速為2μl/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗Cry AD6(2mg/ml)在NC膜上包被反應(yīng)檢測(cè)線(圖1a)，以1.0mg/ml兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對(duì)照線，對(duì)照線與檢測(cè)線的距離為4-4.5mm(圖1b)；6)完成包被后，置37℃干燥箱24小時(shí)，用BB封閉液封閉處理半小時(shí)，用WB洗液抽洗一次；7)37℃干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1.8cm×27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置室溫保存?zhèn)溆谩?br> 6.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，室溫保存。
1)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.8cm/條；
3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.2cm/條。
7.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲(chǔ)存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動(dòng)速度為50mm/s；4)噴制規(guī)格為0.5-1.5cm×25cm/條，每條噴2遍；5)于37℃烘干12小時(shí)，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。
8.反應(yīng)體組裝(如圖2，圖3)1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜M1(18mm)，離M6上緣約22mm；3)在M7上貼M5(22mm)，與M6上緣對(duì)齊并與M1上緣交1mm；4)在M7上貼M2a(12mm)，與M1下緣相接；5)在M2上貼M4(10mm)，壓住M1下緣0.5mm；6)在M7上貼M3(12mm)，上緣壓住M4約2/3；7)在M7上貼M2b(18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對(duì)齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住M1約1.5mm；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與M1上緣交1mm，另一端翻過(guò)M6上緣，貼于M6被面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動(dòng)切條機(jī)切成3.5mm規(guī)格。
9.檢測(cè)樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測(cè)前需經(jīng)研磨，并以SEB4樣本緩沖液抽提和稀釋。為獲得最佳檢測(cè)效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋?zhuān)谕瓿裳心ズ拖♂尯螅瑢颖净靹?，靜置，取上清液作為檢測(cè)樣品。

10.檢測(cè)及結(jié)果檢測(cè)將檢測(cè)條樣品端垂直向下，插入準(zhǔn)備好的樣品液中，(樣品端浸沒(méi)入樣品液的深度約為0.5cm)，吸水材料使待檢樣品緩慢上移，膜反應(yīng)體系被啟動(dòng)。無(wú)論BT-Cry1Ab/1Ac蛋白是否存在于植物樣品中，一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果判定1)如樣本中不含特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白，或其濃度低于檢測(cè)靈敏度，膠體金抗體在層析過(guò)程中不會(huì)被固定在膜上檢測(cè)帶內(nèi)的單抗免疫，因而測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)不會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色檢測(cè)帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶(如圖4a)。陰性結(jié)果表明待檢樣品中不含BT-Cry1Ab/1Ac蛋白或其含量在其閾值以下。
2)如果待植物樣品中BT-Cry1Ab/1Ac蛋白濃度高于其檢測(cè)閾值時(shí)，抗原免疫金與檢測(cè)帶上的另一單抗結(jié)合，在測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)將還出現(xiàn)另一紫紅色檢測(cè)帶，顯示陽(yáng)性(+)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測(cè)區(qū)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶(如圖4b)。陽(yáng)性結(jié)果表明特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白含量在閾值以上。注意測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都應(yīng)判定為陽(yáng)性結(jié)果。
3)如質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶(如圖4c)，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
本發(fā)明所述BT-Cry1Ab/1Ac檢測(cè)試條的優(yōu)點(diǎn)在于1)特異性強(qiáng)BT-Cry1Ab/1Ac的檢測(cè)試條以高特異性BT-Cry1Ab/1Ac抗體制備，與其他非目的蛋白的交叉反應(yīng)很低。
2)敏感性高BT-Cry1Ab/1Ac的檢測(cè)試條選用和力的BT-Cry1Ab/1Ac單抗標(biāo)記膠體金，膠體金與抗體間無(wú)共價(jià)鍵形成，因而對(duì)抗體的特異性和親和力影響很小，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.5ng/ml。
3)操作簡(jiǎn)便BT-Cry1Ab/1Ac的檢測(cè)試條的使用不需其他輔助設(shè)備。直接將試條查如待檢樣本，然后取出平放即可。
4)檢測(cè)結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)結(jié)果可在5分鐘內(nèi)肉眼直接判定。兩條棕紅色條帶為陽(yáng)性，一條棕紅色條帶為陰性。
權(quán)利要求
1.一種殺蟲(chóng)晶體蛋白(BT-Cry 1Ab和Cry 1Ac)的快速檢測(cè)試條，其特征在于檢測(cè)系統(tǒng)主體為膜反應(yīng)體系，可對(duì)轉(zhuǎn)基因植物(但不限于轉(zhuǎn)基因植物)中的轉(zhuǎn)基因殺蟲(chóng)晶體蛋白(BT-Cry 1Ab和Cry 1Ac)進(jìn)行快速定性或半定量測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Bt為Bacillus thuringiensis，即蘇蕓金芽孢桿菌的簡(jiǎn)稱(chēng)；Cry為晶體蛋白(crystal protein)的簡(jiǎn)稱(chēng)；Cry 1Ab和Cry 1Ac為蘇蕓金芽孢桿菌基因編碼的兩種常見(jiàn)的殺蟲(chóng)晶體蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系由以下部分組成M1高蛋白親和性的高分子纖維素膜，經(jīng)預(yù)處理后制備為反應(yīng)膜用來(lái)作為系統(tǒng)反應(yīng)的載體和顯示反應(yīng)結(jié)果；M2a，M2b為樣本墊的組成部分，選用有較強(qiáng)吸水能力的纖維性膜，經(jīng)特殊處理后，為反應(yīng)系統(tǒng)提供適合的反應(yīng)條件，并幫助吸取待檢測(cè)樣本；M3為樣本墊的另一組成部分，吸水玻璃纖維，加速吸取待檢測(cè)樣本；M4膠體金墊，選用吸附力較強(qiáng)的纖維性薄膜，吸附膠體金標(biāo)記抗體并作為其固相載體；M5吸水墊，吸收檢測(cè)后的樣本；M6塑料基板，作為反應(yīng)體系的支撐物；M7不同規(guī)格的雙面和單面膠帶，用于固定各反應(yīng)膜和吸水材料于M6上；M8透明保護(hù)膠帶，固定和保護(hù)樣本墊和膠體金墊；M9彩色標(biāo)志膠帶，作為該檢測(cè)試條的特征標(biāo)識(shí)；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高分子纖維素膜M1可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜等高分子膜。經(jīng)預(yù)處理后制備為反應(yīng)膜，反應(yīng)膜分為兩個(gè)區(qū)域樣品檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的樣本墊M2a、M2b、M3為玻璃纖維或其他吸水性強(qiáng)的纖維性薄膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膠體金標(biāo)記抗體載體膜M4可為玻璃纖維或其他纖維性薄膜，在載體膜上噴涂膠體金-抗體復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)體系的支撐板M6為塑料薄板，或其他疏水性薄板。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反應(yīng)膜，在質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體；在樣品檢測(cè)區(qū)包被特異功能性BT-Cry 1Ab/1Ac單克隆抗體或多克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的膠體金系氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，聚合成一定大小(直徑在1-150nm)的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱(chēng)膠體金，屬于多相不均一體系，顏色呈桔紅色到紫紅色，為反應(yīng)提供肉眼可檢測(cè)的信號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的膠體金標(biāo)記抗體為BT-Cry 1Ab/1Ac單克隆抗體。
全文摘要
殺蟲(chóng)晶體蛋白BT－Cry1Ab/1Ac快速檢測(cè)試條。本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用平行移動(dòng)免疫親和層析一步法，及單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)，快速檢測(cè)樣本中BT－Cry1Ab/1Ac蛋白的特異性檢測(cè)試條。為判定待檢測(cè)樣本是否含轉(zhuǎn)基因植物樣本(轉(zhuǎn)Bt－Cry蛋白基因)提供直接證據(jù)。檢測(cè)結(jié)果可為植物種子的質(zhì)量評(píng)定提供依據(jù)，同時(shí)適用于邊防、海關(guān)植物檢驗(yàn)、食品安全檢測(cè)等部門(mén)對(duì)可疑樣本現(xiàn)場(chǎng)、快速篩查。檢測(cè)試條包括高蛋白親和性的纖維素膜作為系統(tǒng)反應(yīng)的載體和顯示反應(yīng)結(jié)果，樣本墊吸取待檢測(cè)樣本并為反應(yīng)系統(tǒng)提供適合的反應(yīng)條件，膠體金墊為膠體金標(biāo)記抗體的固相載體，吸水墊吸收檢測(cè)后的樣本，塑料基板作為反應(yīng)體系的支撐板，不同規(guī)格的雙面和單面膠帶用于固定各反應(yīng)膜和吸水材料于支撐板上，透明保護(hù)膠帶用于固定和保護(hù)樣本墊和膠體金墊，彩色標(biāo)志膠帶作為該檢測(cè)試條的特征標(biāo)識(shí)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1525173SQ03117358
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者鄭建, 黃愛(ài)龍, 林敏 , 鄭 建 申請(qǐng)人:重慶金標(biāo)生物技術(shù)有限公司