專利名稱：加載結晶裝置的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物聚合物的結晶，具體涉及膜蛋白，以及涉及用基質形成化合物加載結晶裝置的可自動化方法。
背景技術：
三維蛋白質結構具有非常高的商業(yè)價值，因為由此能合理(基于結構)設計和工程改造結合感興趣的蛋白質的新穎藥物分子。此外，由此能促進工程改造具有所需性質的新穎蛋白質。蛋白質和其他生物聚合物的三維結構通常通過對應晶體的X射線衍射確定。 為了通過X射線衍射結晶學對其進行觀測，必須得到生物聚合物的高質量晶體。不幸的是， 蛋白質晶體生長科學目前無法預測特定蛋白質結晶時的條件。因此，再結合許多其他問題， 必須搜尋高度量綱化的參數(shù)空間(大量可能的配方/組合)以找到最佳的結晶條件。盡可能多地進行實驗的簡單篩選經(jīng)常是最有效的方法。這是非常費力和消耗時間的。因此，制備高質量蛋白質晶體是通過X射線衍射結晶學闡釋蛋白質結構的瓶頸。所以，已經(jīng)作了許多努力來使該過程自動化進行，從而對許多不同的結晶條件進行篩選。膜蛋白是一大類與包裹所有活細胞的脂質雙層(膜)結合或者橫穿該脂質雙層的蛋白質。膜蛋白通常涉及物質和/或信號穿過細胞膜的受控移動。這樣，膜蛋白能在活細胞內部和外部之間進行快速交流。膜蛋白的例子包括離子通道，信號受體，激素受體，光受體和粘附蛋白。這些膜蛋白經(jīng)常是藥物開發(fā)的目標，是科學關注的中心，原因在于，它們涉及信號轉導過程。膜蛋白的一種定義特性是，其表面上同時存在疏水性和親水性區(qū)域。這樣使得膜蛋白能結合進入膜的脂質雙層(其構成膜的大部分)形成的疏水性區(qū)域中，同時在膜的任一側與水性材料形成穩(wěn)定界面。但是，這些特性使得難以通過用于可溶性(非膜約束)蛋白質的結晶方法，例如蒸汽擴散方法來結晶膜蛋白。膜蛋白容易變性，所以其結構在水性溶劑中變松散。因此，結晶膜蛋白是特別具有挑戰(zhàn)性的。但是，由于膜蛋白由所有已知基因組中約30%的基因組編碼，它們的結構引起了很大的興趣。在1996年，Landau和Rosenbusch描述了脂質立方相用于膜蛋白結晶的新穎應用。 根據(jù)這種方法，將洗滌劑增溶的膜蛋白與結晶基質形成化合物如油酸單甘油酯(或棕櫚酸單甘油酯)和水(或緩沖液)混合，然后進行多次離心。通過這種方法，得到粘稠的雙連續(xù)立方相，一種固化的脂質雙層，以三維方向延伸，能被水性通道透過。所以，基質形成化合物油酸單甘油酯能形成膜蛋白的結晶基質，因為其提供適用于膜蛋白的脂質雙層結構。膜蛋白能分配到脂質雙層中，能以三維方向在其中擴散，從而擴散到許多可能的空間折疊構造中，導致蛋白質在脂質中間相(例如所謂脂質立方相或海綿相)中進行晶體生長。對應的脂質立方相的一個例子如

圖1中所示。所以對應相是非常合適的膜蛋白結晶基質。此后，除了油酸單甘油酯以外還鑒定了其他的也能形成合適的膜蛋白結晶基質的基質形成化合物，用于結晶膜蛋白。膜蛋白和其他聚合物的結晶仍然是很有挑戰(zhàn)性的。對于膜蛋白結晶基質(例如中間相、海綿相和立方相)，其操作和形成是特別困難的。具體來說，進行實驗是非常耗費時間的。僅僅數(shù)次結晶實驗通常就需要一個實驗者耗費一天時間。由于要找到頭緒經(jīng)常需要測試大量的結晶條件，所以這種測試方法是人們所不希望的，因為其涉及過多的操作步驟。此外，還必然造成測試材料的浪費。由于開始的測試材料(例如基質形成脂質和蛋白質)是專用的，所以這種對材料的浪費經(jīng)常導致無法進行足夠數(shù)量的測試。在現(xiàn)有技術中，基本上有兩種方法來形成生物聚合物結晶基質，尤其是對膜蛋白而言。根據(jù)一種方法，在水溶液中混合膜蛋白和基質形成化合物(例如脂質，如油酸單甘油酯)，從而形成脂質立方相，其中在由基質形成化合物如油酸單甘油酯形成的結晶基質(立方相)中重建膜蛋白。然后將所述脂質立方相轉移到分配器中。然后將脂質立方相從分配器分配到結晶裝置的容器中，例如多孔板。然后向分配的脂質立方相中加入結晶所必需的其他組分，例如沉淀液等，從而引發(fā)結晶過程。這種方法見述于例如US 2002/0072703。但是，這種方法需要大量蛋白質以形成蛋白質和基質形成脂質化合物的“主混物”，從而在分配之前形成結晶基質(如立方相)，這些是常規(guī)情況下無法獲得的。這種方法的另一個缺點是，例如無法改變基質形成化合物的性質進而為感興趣的具體蛋白質找到最佳的基質形成化合物，因為蛋白質預先與基質形成化合物混合。因此，還需要制備蛋白質和脂質立方相的幾種“主混物”，這是消耗蛋白質的，否則就無法改變基質形成化合物。此外，必須由使用者手動地混合膜蛋白和脂質基質形成化合物。由于立方相是粘性的，所以難以對形成的對應立方相進行分配，因此該方法是耗費時間的，或者至少容易出錯。另一個問題在于，無法分別控制沉淀液對立方相和蛋白質的影響，因為立方相和蛋白質的混合物與沉淀液發(fā)生接觸。不同種類的沉淀劑引起立方相的不同變化。在使膜蛋白溶液接觸立方相之前進行分析可能是令人感興趣的。因此，目前首先將基質形成化合物與蛋白質組合的方法限制了對基質形成化合物、膜蛋白和沉淀液的理想組合進行篩選的能力。另一種方法采用基質形成化合物的手動制備，將非常少量的純的基質形成混合物稱量到結晶裝置的容器，例如多孔板中。然后向制備的基質形成化合物中加入蛋白質溶液， 以引發(fā)結晶基質的形成。在這方面，以確切的比例/濃度將基質形成化合物與膜蛋白混合是很重要的。因此，必須盡可能落實/限定結晶裝置的容器中包含的基質形成化合物的量。 但是這很困難，因為根據(jù)基質形成化合物的脂質性質，其通常為固體化合物。對于經(jīng)常以片狀條件存在的對應的固體化合物如油酸單甘油酯，要進行稱量是很困難的，也是非常耗費時間的過程，考慮到要在一次結晶實驗中理想地篩選可能幾百種或甚至幾千種不同條件就能理解這一點。因此，對于中等或高通量的結晶實驗，單獨稱量基質形成化合物的限定量是不合適的。此外，由于對理想和可重復的結晶實驗而言，必須提供立方相和膜蛋白的確切比例，所以稱量過程也是容易產(chǎn)生誤差的。為了鑒定理想的結晶條件并優(yōu)化結晶過程，仍然存在許多需要改進的方面，尤其是當只有少量蛋白質的時候。因此，本領域中非常需要可自動化進行的過程，從而能夠對結晶條件進行中等和高通量的篩選。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式，提供了一種加載結晶裝置的方法，該結晶裝置包括多個具有預定量的至少一種基質形成化合物的容器，所述基質形成化合物能形成膜蛋白結晶基質，所述方法包括以下步驟
a)將所述至少一種基質形成化合物的聚集狀態(tài)改變成流體狀態(tài)，從而允許對所述至少一種基質形成化合物進行分配，和b)將限定量的所述至少一種基質形成化合物分配到所述結晶裝置的至少一個容器中，其中所述分配的基質形成化合物在所述容器中固化。能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物(以下也稱為“基質形成化合物”)通常在室溫下為固體(見以上)。因此，現(xiàn)有技術將單獨量的固體化合物稱量到容器中。如以上概述的，這是耗費時間、容易產(chǎn)生誤差的，因此不適合自動化過程。本發(fā)明不同于該方法， 本發(fā)明使所述基質形成化合物的聚集狀態(tài)改變成流體狀態(tài)，從而允許將所述至少一種基質形成化合物分配到結晶裝置的容器中。例如，根據(jù)所用的分配器，只需改變聚集狀態(tài)，使得基質形成化合物以粘稠狀態(tài)(或液體)存在，從而形成可分配的聚集狀態(tài)，就足以進行本發(fā)明。因此，可以將限定量的所述至少一種基質形成化合物分配到結晶裝置的容器中。對應的過程也是可自動化進行的，因為流體形式的基質形成化合物能以確切的比例/量進行分配。迄今為止，現(xiàn)有技術中不存在任何方法能為生物聚合物、尤其是為膜蛋白結晶提供多個少量但確切量的基質形成化合物。分配之后，所述基質形成化合物在所述容器中固化。因此，通過根據(jù)本發(fā)明的加載方法獲得結晶裝置，其包括確切量的固體狀態(tài)的基質形成化合物，能提供給使用者作為可儲存的、即用型消費品。使用者只需要向容器中包含的基質形成化合物加入待結晶蛋白質即可，例如以蛋白質溶液的形式加入，包含待結晶的蛋白質/生物聚合物的結晶基質會自發(fā)形成(同樣有兩種可行的步驟過程，其中首先加入水或緩沖劑以形成結晶基質，然后加入蛋白質進行結晶，見下)。隨后，可加入沉淀液，以引發(fā)結晶過程。通過使用根據(jù)本發(fā)明方法加載的結晶裝置，消費者就不需要自行用可能會出問題的基質形成化合物/結晶基質來加載結晶裝置(見以上)。最終使用者只需要加入待結晶蛋白質和結晶所需的其他組分 /溶液，如下所述。無論如何，由于對應的組分容易進行分配(例如蛋白質和/或沉淀液)， 這也使得結晶實驗能以中等或高通量的形式進行。將結合結晶方法對此進一步詳細說明。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法允許用不同的基質形成化合物或者基質形成化合物的混合物對結晶裝置的容器進行加載，從而提供比現(xiàn)有技術的方法更大的靈活性，例如將基質形成化合物與蛋白質預混合，從而在分配過程之前形成立方相。此外，根據(jù)現(xiàn)有技術的方法，立方相的分配需手動進行，這是很困難的，對于使用者很不方便。根據(jù)本發(fā)明的用于加載結晶裝置的方法可以自動進行，從而適合于制備用于高通量篩選的預填充結晶裝置?？蓛Υ娴念A填充結晶裝置還可與分配其他組分(例如蛋白質和沉淀液)的機器人系統(tǒng)結合使用，以進行中等或高通量篩選。因此本發(fā)明提供了優(yōu)于常規(guī)加載方法的重要優(yōu)點，本發(fā)明提供了可儲存的即用型預填充結晶裝置，為使用者提供了最高的靈活性和便利性。根據(jù)本發(fā)明的方法不同于現(xiàn)有技術的方法，區(qū)別在于，結晶基質并非在分配步驟之前形成。具體來說，在分配步驟之前，并未將基質形成化合物與待結晶生物聚合物混合。 因此，可以對包含固化的限定量的基質形成化合物的結晶裝置進行儲存，從而提供給使用者即用型消費品。在一些方法中，對結晶基質進行分配并由此進行預填充，例如作為立方相或海綿相，這樣的結晶基質只能短時間儲存(可能不超過幾個月)，因為所述結晶基質是脆弱和容易被破壞的，例如由于脫水而被破壞。對于根據(jù)本發(fā)明的方法加載的結晶裝置，不會出現(xiàn)這些問題，因為固化的基質形成化合物更穩(wěn)固，因此在合適的儲存條件下能儲存甚至幾年。結晶裝置可以例如是蛋白質結晶板。對應的板通常以多孔形式提供，例如包括 3 X 2N個孔，N是自然數(shù)，如對、96，可以是384孔?，F(xiàn)有技術中已知一些結晶裝置設計，可以根據(jù)本發(fā)明進行使用。本發(fā)明的方法還可以作為機器人站的集成組件/步驟加以結合/進行，不僅對結晶裝置加載所述至少一種基質形成化合物，還加入例如蛋白質溶液和結晶過程所需的其他溶液/成分(例如沉淀液)。結晶裝置可以是例如蛋白質結晶板，允許通過直立式或懸吊式蒸汽擴散方法對生物聚合物、尤其是膜蛋白進行結晶。對于這個目的，根據(jù)一種實施方式，蛋白質結晶板可包括至少一個容器，該容器用于接受能形成膜蛋白結晶基質的至少一種基質形成化合物，蛋白質結晶板還包括至少一個儲器，該儲器與所述至少一個容器連通。所述連通可以是例如氣體連通，例如在蒸汽擴散方法中。但是采用半透性膜的微量滲析方法也是可行的。例如所述儲器可以填充有沉淀液，從而促進結晶過程，對應地允許篩選更多的結晶條件。還可以使幾個用于基質形成化合物的容器與至少一個儲器保持氣體連通(參見例如WO 00/14311)。 如果與所述至少一個儲器保持氣體連通的容器加載/預填充有不同的基質形成化合物或者基質形成化合物的混合物，則對應的實施方式是有利的，因為由此可增加篩選實驗的變化性。根據(jù)一種實施方式，在分配步驟之前或該步驟過程中，通過改變所述至少一種基質形成化合物的溫度使其達到允許分配該基質形成化合物的流體狀態(tài)，從而改變其聚集狀態(tài)。例如，大多數(shù)基質形成化合物是在室溫下為固體的脂質化合物。但是，通過加熱對應的基質形成化合物，其達到流體狀態(tài)，該化合物是例如液體或至少是粘稠的，允許將限定量分配到結晶裝置的容器中。為了進行分配必須對應維持的溫度取決于所用的基質形成化合物或者基質形成化合物的組合物，通過測試到達流體狀態(tài)時的溫度可以簡單地予以確定，從而允許將所述至少一種基質形成化合物或組合物分配到結晶裝置的容器中。對于脂質的基質形成化合物如油酸單甘油酯，溫度大于30°C、優(yōu)選大于40°C (例如約42°C )通常足以達到流體狀態(tài)，從而允許將所述化合物分配到結晶裝置的容器中。但是，也可使用更高的溫度。根據(jù)一種實施方式，分配約100-1000納升、或者小于500納升的基質形成化合物。但是，也可分配更大的體積，取決于預期的應用和結晶板的設計。優(yōu)選所述加載方法通過使用機器人系統(tǒng)自動進行，該機器人系統(tǒng)包括至少一個分配單元，用于分配所述至少一種基質形成化合物。在通過加熱基質形成化合物改變其聚集狀態(tài)的情況中，可以使用分配器的尖端或任何其他部件將基質形成化合物設定為允許分配限定量的所述材料的溫度。還可以例如通過外部加熱工藝(例如通過鼓吹熱空氣)使分配器內的基質形成化合物變溫熱，從而達到允許將所述至少一種基質形成化合物分配到結晶裝置的容器中所需的溫度。因此，根據(jù)一種實施方式，在分配單元(例如機器人系統(tǒng))中加熱所述至少一種基質形成化合物。本文使用術語“分配器”或“分配單元”表示允許分配限定量的流體、例如液體或粘稠物質的裝置。如果要分配小體積，則分配器應當適合于分配非常少量但是確切限定量的液體和/或粘稠物質，尤其是在微升或納升體積范圍中。優(yōu)選所述基質形成化合物具有至少一種以下特性。
如簡述中概括指出的，對應的基質形成化合物適合于例如在水化時形成膜蛋白結晶基質。為了能夠形成膜蛋白結晶基質，使基質形成化合物形成模擬生物膜的脂質雙層的結構是很重要的，從而允許將膜蛋白結合到所述模擬生物膜的脂質雙層的結構中。適合于該目的的化合物具體是脂質化合物，優(yōu)選是兩性分子化合物，尤其是脂肪酸的醇衍生物。對應的化合物通常包含飽和或不飽和的脂肪酸鏈作為脂質組分。鏈長可以為14-25個碳，更優(yōu)選為16-20或16-18個碳，這時非常接近天然脂質?，F(xiàn)有技術中已知的合適的結晶基質是例如中間相、立方相和/或海綿相。對應的相/結晶基質之間的邊界并非十分明確。例如，術語“中間相”經(jīng)常用作涵蓋立方相和海綿相的一般術語(具體參見例如Caffrey等，Journal of Structural Biology 142 (2003) 108-132, Cherezov 等，Biophysical Journal 第 83 卷 2002 年 12 月 3393-3407， Cherezov等，J. Mol. Biol. (2006) 357，1605-1618，所有這些文獻都通過參考全部結合于此)。如這些文獻中概述的，單獨的相之間的轉變(包括立方相和海綿相)是流暢的，對于特定的基質形成化合物可能是均勻變化的，例如取決于溫度、添加劑和/或水含量。例如通過使用較高比例的水和/或添加劑使立方相溶脹，導致立方相自身的有序結構變松散，同時保持雙連續(xù)特性，轉化成所謂海綿相(同樣參見圖1)。如果需要結晶較大的蛋白質，則對應的溶脹可能是有利的，因為結晶基質的晶格參數(shù)增大。如以上概述的，所述基質形成化合物可單獨使用，或者與其他也能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物組合使用。對應的混合物允許為不同蛋白質測試不同的結晶基質，允許針對待結晶生物聚合物對結晶條件進行優(yōu)化和精細調節(jié)。理解以下內容是很重要的，根據(jù)生物聚合物、尤其是膜蛋白的結構和尺寸，不同的基質形成化合物會導致不同的結晶結果。因此，用不同的基質形成化合物或者基質形成化合物的混合物加載容器從而改變和優(yōu)化這些參數(shù)也是有利的。這種靈活性是很重要的優(yōu)點。另外或附加地，將基質形成化合物與其他添加劑混合也是有利的，從而進一步改變/調適用于待結晶生物聚合物的結晶基質。對應的添加劑能支持晶體形成，因為所述添加劑使得待結晶生物聚合物能找到更好的條件/環(huán)境，優(yōu)選是出于添加對應的脂質添加劑的原因?；|形成化合物和添加劑的混合物形成添加劑組合物，仍然能夠形成膜蛋白結晶基質。對應的添加劑可以是能夠穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的脂質的長鏈醇或者天然或合成的組分。在加入組分用于形成結晶基質的時候，使用者可以向基質形成化合物中加入對應的添加劑(例如，加入蛋白質溶液或包含任選添加劑的溶液用于改變結晶基質)。所述基質形成化合物或所述添加劑組合物包含至少一種選自下組的化合物或由其組成a)脂肪酸，脂肪酸的醇衍生物，單甘油酯，甘油二酯，脂質及其衍生物，優(yōu)選酸基團被羥基或硫醇或醚或硫醚基團、或者ω-羥基烯或其醚或硫醇或硫醚類似物取代的相應化合物；單?；视停瑑?yōu)選是順式的單不飽和的單?；视?，更優(yōu)選是油酸單甘油酯(C18 c9)，棕櫚酸單甘油酯(C16 :c9)和單維寧(monovacermin) (C18 :c7)；中等鏈長的烷基糖苷；聚亞烷基二醇，聚乙二醇，二?；视土字瑔熙；视土字澳苄纬缮锞酆衔锝Y晶基質的它們的衍生物；和/或b)聚酮，糖脂，異戊烯醇脂，固醇脂，鞘脂，甘油磷脂和甘油脂和/或脂質衍生物， 尤其是磷脂酰膽堿(PC)，具體是1，2_ 二油基-Sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)，磷脂酰乙醇胺，具體是1，2- 二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，磷脂酰絲氨酸，具體是1，2- 二油基-sn-甘油-3-磷酸絲氨酸(D0PQ，心磷脂，溶血卵磷脂，2-油酸單甘油酯，油酰胺，膽固醇，細胞膜組分，和天然或合成的能穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的化合物。所以，可以結合本發(fā)明單獨地使用多種合適的基質形成化合物，或者作為混合物和/或與所列出的添加劑組合使用。本發(fā)明還提供了通過使用根據(jù)本發(fā)明的方法制造對應的預填充結晶裝置的方法。本發(fā)明還提供了一種結晶裝置，該結晶裝置包括多個容器，其中至少一些所述容器包含確定均相量的至少一種固體的基質形成化合物，該化合物能形成膜蛋白結晶基質。 這個方面中的“均相”表示基質形成化合物并非處于片狀狀態(tài)，而是在容器中形成均相的液滴/結構。例如，如果使用根據(jù)本發(fā)明的方法將所述至少一種基質形成化合物以流體的聚集狀態(tài)分配到所述容器中并且在所述容器中固化，則可以實現(xiàn)對應的均相結構。以上結合加載方法詳細討論了將聚集狀態(tài)改變成流體狀態(tài)從而允許分配所述至少一種基質形成化合物的優(yōu)點。所以參考以上揭示內容。優(yōu)選通過加熱基質形成化合物來改變聚集狀態(tài)。在將基質形成化合物分配到所述容器中的時候，當所述化合物至少冷卻到室溫的時候，該化合物在所述容器內再次固化。也可以通過冷卻或冷凍加載的結晶裝置來促進該過程。根據(jù)本發(fā)明內容制備的結晶裝置不同于其中部分固體基質形成化合物以固體狀態(tài)稱量到容器中的裝置，也不同于因為結晶基質的均相結構的原因包含水化結晶基質的裝置。例如，如果根據(jù)本發(fā)明以流體的狀態(tài)分配基質形成化合物并在容器內固化，則所述基質形成化合物在所述容器內均勻分布，可以長時間儲存。例如可以將結晶裝置密封，從而保護基質形成化合物以免水化，因此可供儲存，直到使結晶裝置水化和/或接觸蛋白質溶液和任選的其他用于結晶實驗的組分。一種有利的特性在于，只在結晶裝置的容器內預加載基質形成化合物和任選的能形成結晶基質的添加劑，因為固體的基質形成化合物能長時間儲存(見以上)。對于預混合或預形成的結晶基質例如立方相或海綿相而言，這是不可能實現(xiàn)的，所述預混合或預形成的結晶基質不具備固體結構，容易脫水，因此在儲存過程中容易被破壞?，F(xiàn)有技術的方法是對預形成的結晶基質 (例如立方相或海綿相)進行分配，因此不適合長期儲存，由于易受影響，更難以操作/儲存。此外，根據(jù)待結晶的生物聚合物，使用者對于改變基質形成化合物進行水化所用的液體也很有興趣，因此對于改變形成結晶基質所用的液體也很有興趣，從而進一步增大組合靈活性，并增加找到理想的結晶條件的機會。因此，根據(jù)本發(fā)明的結晶裝置與現(xiàn)有技術裝置相比具有重要的優(yōu)點，本發(fā)明的結晶裝置提供可儲存的即用型消費品，能高度靈活地用于高通量的篩選實驗。此外，如以上概述的，本發(fā)明的結晶裝置還能與機器人系統(tǒng)聯(lián)合，進行或建立整個結晶實驗，從用根據(jù)本發(fā)明的至少一種基質形成化合物加載結晶裝置，到添加蛋白質溶液和沉淀液，以及對為了進行結晶而準備的結晶裝置進行密封和儲存。因此，本發(fā)明的結晶裝置的一個有利特性在于，以流體狀態(tài)分配并在對應容器內固化的所述至少一種基質形成化合物并未在分配步驟之前與待結晶的生物聚合物預混合， 以及/或者該基質形成化合物并非作為結晶基質例如立方相或海綿相分配，因為對應的結晶基質的穩(wěn)定性小于尚未形成結晶基質的基質形成化合物或者任選地與上述添加劑混合的其混合物/組合物的穩(wěn)定性。然后在使用者添加必需組分如水和/或蛋白質溶液時，形成對應的結晶基質。根據(jù)一種實施方式，結晶裝置是一種蛋白質結晶板。優(yōu)選該板為多孔形式。以上詳細描述了合適的結晶裝置及其合適的實施方式；參考以上內容。根據(jù)一種實施方式，所述能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物具有至少一種以下特性a)能形成中間相；和/或b)能形成立方相；和/或c)能形成海綿相；和/或d)是脂質；和/或e)是兩性分子；和/或f)包含飽和或不飽和的脂肪酸鏈；和/或g)是脂肪酸的醇類衍生物。以上結合加載方法詳細討論了關于這些化合物、包含添加劑的合適混合物和組合物的其他細節(jié)，同樣適用于根據(jù)本發(fā)明的結晶裝置中包含的基質形成化合物或基質形成組合物。參考以上內容。根據(jù)另一種實施方式，所述能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物與另一種能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物組合使用，以及/或者與至少一種添加劑混合，從而形成添加劑組合物。以上詳細描述了關于對應的組合物的具體情況，同樣適合于根據(jù)本發(fā)明的結晶裝置。根據(jù)一種實施方式，所述基質形成化合物或所述添加劑組合物至少一種選自下組的化合物或由其組成a)脂肪酸，脂肪酸的醇衍生物，單甘油酯，甘油二酯，脂質及其衍生物，優(yōu)選酸基團被羥基或硫醇或醚或硫醚基團、或者ω-羥基烯或其醚或硫醇或硫醚類似物取代的相應化合物；單?；视停瑑?yōu)選是順式的單不飽和的單?；视?，更優(yōu)選是油酸單甘油酯(C18 c9)，棕櫚酸單甘油酯(C16 :c9)和單維寧(C18 :c7)；中等鏈長的烷基糖苷；聚亞烷基二醇， 聚乙二醇，二?；视土字?，單酰基甘油磷脂及能形成生物聚合物結晶基質的它們的衍生物；和/或b)聚酮，糖脂，異戊烯醇脂，固醇脂，鞘脂，甘油磷脂和甘油脂和/或脂質衍生物， 尤其是磷脂酰膽堿(PC)，具體是D0PC，磷脂酰乙醇胺，具體是DOPE，磷脂酰絲氨酸，具體是 D0PS，心磷脂，溶血卵磷脂，2-油酸單甘油酯，油酰胺，膽固醇，細胞膜組分，和天然或合成的能穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的化合物。本發(fā)明還涉及如上所述的結晶裝置或根據(jù)上述加載方法生產(chǎn)的結晶裝置在結晶生物聚合物，尤其是結晶膜蛋白的方法中的應用。以上詳細描述了能自動進行和測試不同篩選條件的靈活性的優(yōu)點。參考以上內容。本發(fā)明還涉及一種結晶生物聚合物的方法，其中使限定量的至少一種基質形成化合物與液體接觸以形成結晶基質，例如中間相、立方相或海綿相，所述基質形成化合物能為上述結晶裝置或根據(jù)上述方法制造/加載的結晶裝置的至少一個容器中包含的膜蛋白形成結晶基質。
如以上概述的，能與本發(fā)明聯(lián)合使用的基質形成化合物(具體是脂質的基質形成化合物(見以上))在與液體、尤其是水性液體接觸時，能自發(fā)形成類似于生物膜脂質雙層的結晶基質。所述結晶基質優(yōu)選選自中間相，立方相和海綿相，這是本領域中眾所周知的。以上描述了幾種不同的合適的結晶基質，也是本領域中已知的(參見例如MCaffrey， Journal of Structural Biology 142 (2003) 108-132 ;V. Cherezov“運動空間溶脹的脂質中間相中的膜蛋白結晶(Room to Move Crystallization Membrane Proteins in Swollen Lipidic Mesophases) ” J. Mol. Biol. (2006) 357，1605-1618)。我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，有其他途徑來從基質形成化合物形成結晶基質。例如，基質形成化合物與液體的比例對于形成的結晶基質的種類是決定性的。例如，若液體比例較高，則形成海綿相而非立方相。所以，不僅可以通過例如選擇不同的基質形成化合物或其混合物，還可以通過選擇不同的水化條件從而從基質形成化合物形成結晶基質，來改變結晶基質的性質。結晶基質形成過程通常耗時至少0.5-3小時。但是，這取決于所用的基質形成化合物和水化液的組成。根據(jù)一種實施方式，向結晶裝置的容器內包含的基質形成化合物/組合物添加通常包含洗滌劑的蛋白質溶液。如果蛋白質溶液是水性的，則結晶基質將在對蛋白質溶液和基質形成化合物一起進行培育的時候自發(fā)形成。這種過程的優(yōu)點在于，結晶基質如立方相或海綿相在蛋白質存在下形成。所以，待結晶的生物聚合物(通常是膜蛋白)直接重建，并結合到結晶基質結構中，所述結晶基質結構通常類似于生物膜的結構(見以上)。蛋白質溶液可包含如上所述的添加劑。根據(jù)另一種實施方式，使根據(jù)本發(fā)明的結晶裝置的容器中存在的基質形成化合物與水性液體接觸，該水性液體不含待結晶的生物聚合物。發(fā)現(xiàn)在加入可能包含添加劑如脂質添加劑的水性液體(例如水和/或緩沖液)之后，非常迅速地形成結晶基質，通常在小于 1小時或甚至0.5小時以內(也參見圖2)。然后使對應的預溶脹的結晶基質與蛋白質溶液接觸，從而形成摻入蛋白質的結晶基質。通過擴散接觸之后，生物聚合物整合成類似于生物膜的結晶結構。用于形成結晶基質的水性溶液中可包含的合適添加劑可選自下組聚酮，糖脂，異戊烯醇脂，固醇脂，鞘脂，甘油磷脂和甘油脂和/或脂質衍生物，尤其是磷脂酰膽堿(PC)，具體是D0PC，磷脂酰乙醇胺，具體是DOPE，磷脂酰絲氨酸，具體是D0PS，心磷脂，溶血卵磷脂， 2-油酸單甘油酯，油酰胺，膽固醇，細胞膜組分，和天然或合成的能穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的化合物。可以使結晶基質與沉淀液接觸，從而引發(fā)結晶過程。例如，在加入合適組成的沉淀劑之后，在結晶基質和/或蛋白質中發(fā)生變化，促進蛋白質-蛋白質接觸和穩(wěn)定成核，從而引發(fā)晶體形成。所以，在將蛋白質摻入結晶基質中的時候，優(yōu)選加入沉淀液。優(yōu)選所述結晶基質被沉淀液覆蓋，所述沉淀液可以是稀釋的。從而形成海綿相，該海綿相也作為結晶基質，也能促進摻入蛋白質的結晶。合適的沉淀液是現(xiàn)有技術中已知的，可以例如包含鹽、聚亞烷基二醇(具體是聚乙二醇)、有機化合物、醇及其組合作為沉淀劑。所用的結晶裝置可包括至少一個容器，用于接受能形成膜蛋白結晶基質的至少一種基質形成化合物，所述結晶裝置還包括至少一個儲器，該儲器與所述至少一個容器連通。 以上描述了對應的設計的具體情況，此處同樣適用。所述儲器中可填充有沉淀液，該沉淀液的沉淀劑濃度優(yōu)選大于用于覆蓋結晶基質的沉淀液的濃度(見以上)。根據(jù)另一種實施方式，儲器中的沉淀液被覆蓋物(例如膜)覆蓋以防止蒸發(fā)。合適的化合物是不溶于水且密度小于水的非揮發(fā)性化合物。合適的材料是例如具有低密度的油和化合物。從而非常溫和地促進結晶過程。本發(fā)明還提供了一種篩選系統(tǒng)，用于通過制備和使用根據(jù)本發(fā)明的結晶裝置來鑒定結晶參數(shù)，尤其是用于鑒定最佳的基質形成化合物、其混合物以及與添加劑的混合物?？梢岳眠@種篩選系統(tǒng)，系統(tǒng)性地測試生物聚合物、尤其是膜蛋白的結晶反應。由于基質形成化合物是預分配的，也能如上所述進行改變以測試不同的結晶基質，所以使用者只需要對所需的蛋白質和沉淀液進行分配，這兩種物質都是容易分配的。因此，該篩選系統(tǒng)可用于完全自動化的系統(tǒng)的，允許進行高通量試驗，對理想的結晶條件進行快速篩選。以下通過非限制性實施例的方式說明本發(fā)明。附圖/實施例圖la)是結晶基質的一個例子的示例模型，是由油酸單甘油酯、水和膜蛋白構成的雙連續(xù)立方相?；|由兩部分組成，是一種具有無限三維周期性最小表面的膜系統(tǒng)(顯示為圓形脂質雙層)，通過連續(xù)水性通道的系統(tǒng)相互貫通。膜蛋白在脂質雙層中重建(也參見圖lb)。海綿相具有與立方相類似的結構，但是由于海綿相的水/液體含量較高，其結構更為開放/松散。圖lb)是現(xiàn)有技術的立方相中的結晶過程的示意圖(Martin Caffrey，Journal of Structural Biology，142 Q003) 108-132，參見圖13)。結晶膜蛋白的一般過程是膜蛋白在水性介質中在洗滌劑中溶解的過程。洗滌劑形成膠束，也使蛋白質在水性介質中溶解。當水性介質中溶解的蛋白質與基質形成化合物(如脂質，例如油酸單甘油酯)接觸的時候，油酸單甘油酯的水化形成鄰接的L-α和立方相(關于相的描述也參見Cherezov等，J. Mol. Biol. (2006)357,1605-1618，圖1)。基質形成化合物形成膜樣結構，該膜樣結構重建并相應地結合待結晶的蛋白質。在結晶基質，例如所示的立方相的形成過程中，蛋白質得以重建并分配在結晶基質中。因此，蛋白質得以重建并結合在結晶基質的雙層中，此處是立方相。加入沉淀劑(如鹽)，通過移出水和電荷篩選效應引發(fā)結晶，誘導結晶過程。立方相中的雙層曲率隨著水含量降低而增大。圖Ic)顯示蛋白質(和脂質，在共結晶情況中)從立方相到薄層型結構的可逆結晶過程。對應的結晶經(jīng)常通過所謂海綿相進行，這時立方相的有序結構變松散，然后形成薄層型結構。一般來說，尚未完全理解/闡明蛋白質在對應的結晶基質(如立方相、中間相和海綿相)中的結晶過程。因此，圖Ic)只代表一種模型系統(tǒng)。圖2顯示一種基質形成化合物，也是油酸單甘油酯，其根據(jù)本發(fā)明以流體狀態(tài)分配。由圖可知，固化的油酸單甘油酯作為相當均一的塊體摻入結晶裝置的容器中。在與液體(此處是水)接觸之后，油酸單甘油酯快速溶脹，形成結晶基質。圖3顯示一種實用的應用流程，將根據(jù)本發(fā)明的預填充結晶裝置用于結晶實驗中。在左側，將蛋白質溶液直接加入基質形成化合物如油酸單甘油酯中，基質形成化合物在約2-3小時的培育步驟中發(fā)生溶脹，形成結晶基質(立方相)，其包含重建的蛋白質。在右側，顯示了一種不同的選擇，向基質形成化合物中加入不含待結晶的生物聚合物的液體，例如任選地與脂質或其他添加劑混合的水。基質形成化合物在約30分鐘的培育步驟中發(fā)生溶脹，形成結晶基質(立方相)，其中尚不包含待結晶的蛋白質。這段較短的時間通常足以使基質形成化合物溶脹形成結晶基質，此處是立方相。然后向預溶脹的結晶基質(如立方相)中加入蛋白質溶液。通過擴散使蛋白質被動地進入立方相中。
圖4顯示利用蒸汽擴散進行的膜蛋白結晶實驗的一種結構。立方相(在中間顯示) 覆蓋有IM的鹽溶液，其為稀釋的沉淀液。在與所述容器保持氣體連通的條件下，在結晶裝置中提供儲器，儲器中包含2M的鹽溶液，根據(jù)所顯示的實施方式，儲器中的鹽溶液代表未稀釋的沉淀液。通過蒸汽擴散進行結晶。IM的鹽溶液從立方相移出水，而儲器中2M的鹽溶液從IM的鹽溶液移出水。因此，非常溫和且緩慢地移出水，為蛋白質(細菌紫膜質-BR)結晶提供理想條件。根據(jù)一種實施方式，儲器中存在的液體被保護膜覆蓋，防止儲器內的沉淀液蒸發(fā)。
權利要求
1.一種用預定量的至少一種能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物加載包括多個容器的結晶裝置的方法，該方法包括以下步驟a)將所述至少一種基質形成化合物的聚集狀態(tài)改變成流體狀態(tài)，允許對所述至少一種基質形成化合物進行分配，和b)將確定量的所述至少一種基質形成化合物分配到所述結晶裝置的至少一個容器中， 其中所述分配的基質形成化合物在所述容器內固化。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過改變溫度，優(yōu)選通過加熱，改變所述至少一種基質形成化合物的聚集狀態(tài)。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述過程通過使用包括分配單元的機器人系統(tǒng)自動進行。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述基質形成化合物具有至少一種以下特性a)能形成中間相；和/或b)能形成立方相；和/或c)能形成海綿相；和/或d)是脂質化合物；和/或e)是兩性分子；和/或f)包含飽和或不飽和的脂肪酸鏈；g)是脂肪酸的醇衍生物。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物具有至少一種以下特性a)其與添加劑混合從而形成添加劑組合物；b)所述基質形成化合物或所述添加劑組合物包含至少一種選自下組的化合物或由其組成i)脂肪酸，來自脂肪酸的醇衍生物，單甘油酯，甘油二酯，脂質及其衍生物，優(yōu)選酸基團被羥基或硫醇或醚或硫醚基團、或者ω-羥基烯或其醚或硫醇或硫醚類似物取代的相應化合物；單?；视?，優(yōu)選是順式的單不飽和單?；视?，更優(yōu)選是油酸單甘油酯(C18 :c9), 棕櫚酸單甘油酯(C16 :c9)和單維寧(C18 :c7)；中等鏈長的烷基糖苷；聚亞烷基二醇，聚乙二醇，二?；视土字瑔熙；视土字澳苄纬缮锞酆衔锝Y晶基質的它們的衍生物；和 /或 )聚酮，糖脂，異戊烯醇脂，固醇脂，鞘脂，甘油磷脂和甘油脂和/或脂質衍生物，尤其是磷脂酰膽堿(PC)，具體是D0PC，磷脂酰乙醇胺，具體是DOPE，磷脂酰絲氨酸，具體是D0PS， 心磷脂，溶血卵磷脂，2-油酸單甘油酯，油酰胺，膽固醇，細胞膜組分，和天然或合成的能穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的化合物。
6.一種制造結晶裝置的方法，該結晶裝置包括多個具有預定量的至少一種能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物的容器，其中該方法根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的方法進行。
7.一種包括多個容器的結晶裝置，其中至少一些所述容器包含確定均相量的至少一種能形成膜蛋白結晶基質的固體基質形成化合物。
8.如權利要求7所述的結晶裝置，其特征在于，所述基質形成化合物尚未形成結晶基質。
9.如權利要求7或8所述的結晶裝置，其特征在于，所述能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物具有至少一種以下特性a)其與添加劑混合從而形成添加劑組合物；b)所述基質形成化合物或所述添加劑組合物包含至少一種選自下組的化合物或由其組成i)脂肪酸，脂肪酸的醇衍生物，單甘油酯，甘油二酯，脂質及其衍生物，優(yōu)選酸基團被羥基或硫醇或醚或硫醚基團、或ω-羥基烯或其醚或硫醇或硫醚類似物取代的相應化合物； 單酰基甘油，優(yōu)選是順式單不飽和單?；视?，更優(yōu)選是油酸單甘油酯(C18 :c9)，棕櫚酸單甘油酯(C16 :c9)和單維寧(C18 :c7)；中等鏈長的烷基糖苷；聚亞烷基二醇，聚乙二醇， 二?；视土字?，單?；视土字澳苄纬缮锞酆衔锝Y晶基質的它們的衍生物；和/或 )聚酮，糖脂，異戊烯醇脂，固醇脂，鞘脂，甘油磷脂和甘油脂和/或脂質衍生物，尤其是磷脂酰膽堿(PC)，具體是D0PC，磷脂酰乙醇胺，具體是DOPE，磷脂酰絲氨酸，具體是D0PS， 心磷脂，溶血卵磷脂，2-油酸單甘油酯，油酰胺，膽固醇，細胞膜組分，和天然或合成的能穩(wěn)定結晶基質中的膜蛋白的化合物。
10.如權利要求7-9中任一項所述的結晶裝置或者根據(jù)如權利要求1-6中任一項所述方法生產(chǎn)的結晶裝置在結晶生物聚合物、尤其是膜蛋白的方法中的應用。
11.一種結晶生物聚合物的方法，其中使如權利要求7-9中任一項所述的結晶裝置或者根據(jù)如權利要求1-6中任一項所述方法生產(chǎn)的結晶裝置的至少一個容器中包含的確定量的至少一種基質形成化合物與液體接觸從而形成結晶基質，所述基質形成化合物能形成膜蛋白結晶基質。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述液體包含水、一種或多種添加劑和/ 或待結晶的生物聚合物。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特征在于，使所述結晶基質與沉淀液接觸。
14.如權利要求10-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述結晶裝置包括至少一個用于接受所述至少一種能形成膜蛋白結晶基質的基質形成化合物的容器，以及至少一個與所述至少一個容器連通的儲器，其中優(yōu)選將沉淀液分配在所述儲器中。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述儲器中的沉淀液被覆蓋物覆蓋，優(yōu)選被膜覆蓋，以防止蒸發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于加載結晶裝置和用于制造結晶裝置的方法，所述結晶裝置包括多個具有預定量的至少一種基質形成化合物的容器，所述基質形成化合物能形成膜蛋白結晶基質，所述方法包括以下步驟a)將所述至少一種基質形成化合物的聚集狀態(tài)改變成流體狀態(tài)，從而允許對所述至少一種基質形成化合物進行分配，和b)將確定量的所述至少一種基質形成化合物分配進所述結晶裝置的至少一個容器中，所述分配的基質形成化合物在所述容器內固化。從而獲得預填充的結晶裝置，可用作消費品，尤其是用在自動結晶法中。本發(fā)明還提供了采用分別制備的結晶裝置進行的蛋白質結晶方法。
文檔編號C30B7/00GK102170946SQ200980139732
公開日2011年8月31日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權日2008年9月30日
發(fā)明者F·謝弗, G·布爾特, J·庫比西克, J·拉巴恩 申請人:于利奇研究中心有限公司, 恰根有限公司