專利名稱：：蛋白質(zhì)固定化支持體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)能夠在固定化用支持體上高效固定化的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法、以及蛋白質(zhì)被固定化的蛋白質(zhì)固定化支持體。
背景技術(shù)：
：關(guān)于蛋白質(zhì)被固定化的支持體，將該蛋白質(zhì)作為探針來使用，以便對生物體物質(zhì)、化學物質(zhì)進行純化或檢測。例如，已固定了與抗體分子具有親和性的蛋白質(zhì)的蛋白A、蛋白G的支持體，被用于抗體的親和純化。另外，抗體被固定化的支持體，被用作利用抗原抗體^^應(yīng)而對該抗原進^ft檢測、定量的診斷試劑。當在這樣的純化或檢測中使用將蛋白質(zhì)固定化了的支持體時，通常為了使作為該支持體的性能指標的純化容量、檢測靈^t度提高，需要增加蛋白質(zhì)的固定化量。作為將蛋白質(zhì)結(jié)合在固定化用支持體上的方法，通常是使具有^或甲M醃基等活性官能團的固定化用支持體、與蛋白質(zhì)分子中的M進行偶聯(lián)。但是，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子種類，由于具有氨基的氨基酸的含有率少、原因，會有無法將足夠量的蛋白質(zhì)固定化的情況。另外，就已被固定化于支持體上的蛋白質(zhì)而言，在蛋白質(zhì)的功能、活性體現(xiàn)中發(fā)揮重要作用的氨基被消耗在與支持體的結(jié)合中，由此會有功能、活性喪失的情況。進而，近年來，作為蛋白質(zhì)固定化支持體的用途，開發(fā)出使用各種蛋白質(zhì)或抗體被總體固定化的蛋白質(zhì)芯片、抗體芯片，對與來源于作為檢查對象的患者的生物體材料或藥品候補的低分子化合物有相互作用的分子種及其強度進行評價的方法。在蛋白質(zhì)芯片、抗體芯片的制造中，為了使獲得的信號的解析容易進行，要求減少在各種蛋白質(zhì)之間固定化量的不均。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種即便是以往難以在固定化用支持體上固定足夠量的蛋白質(zhì)，也能使其在支持體高效固定化從而能夠增加固定化量的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，以及利用上述制造方法得到的蛋白質(zhì)固定化支持體。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人等進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用具有含堿性^J^酸分子的標簽序列的蛋白質(zhì)，例如即侵是以往固定后反應(yīng)的效率差且固定化量不夠充分的蛋白質(zhì)，也可以增大蛋白質(zhì)固定化量，從而完成了該研究。本發(fā)明的一個實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，包含在支持體上將具有標簽序列的蛋白質(zhì)固定化的工序，所述的標簽序列含有堿性氨基酸為連續(xù)三個以上的序列。就上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，上M性Jl^酸可以是賴氨酸、精氨酸、及組氨酸中的任意一種。就上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，上述標簽序列可以是組氨酸標簽。就上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，上述固定化用支持體可以具有選自氛基、環(huán)氣基、及曱^t?；械闹辽僖环N官能團。就上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，上述固定化用支持體可以是磁性粒子。本發(fā)明的一個實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體，可以通過上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而獲得。根據(jù)上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，例如，即便是固定后反應(yīng)的效率差而無法得到足夠的固定化量的蛋白質(zhì)，也可以增加蛋白質(zhì)固定化量。因此，就通過上述蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法得到的上述蛋白質(zhì)固定化支持體而言，蛋白質(zhì)的固定化量大。具體實施例方式以下，對本發(fā)明的一個實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體及其制造方法進:^H兌明。1.蛋白質(zhì)固定化支持體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一個實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，包含在支持體上將具有標簽序列的蛋白質(zhì)(以下也稱為"標簽蛋白質(zhì)")固定化的工序，所述的標簽序列含有堿性氛基酸為連續(xù)三個以上的序列。本發(fā)明的一個實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體，蛋白質(zhì)和固定化支持體借助與標簽序列結(jié)合的官能團(例如亞氨基、酰胺鍵)進行化學結(jié)合。1.1.標簽蛋白質(zhì)就本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，在固定化用支持體上固定化的標簽蛋白質(zhì)，含有具有堿性氨基酸為連續(xù)三個以上的序列的標簽序列。標簽序列的M酸數(shù)為3個以上，對長度的上限沒有限制，但為了抑制對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響，通常優(yōu)選5~30個。標簽序列優(yōu)選其一部分或全部由堿性M酸形成，更優(yōu)選由從賴氨酸、精氨酸及組氨酸中選擇的堿性^^酸連續(xù)3個以上的序列形成，進一步優(yōu)選含有賴氨酸、精氨酸及組氨酸中的任意一種^J^酸連續(xù)3個以上的序列，特別優(yōu)選僅由上述任意一種M酸連續(xù)3~10個的序列形成。在標簽序列僅由賴氨酸、精氨酸及組氨酸中的任意一種M酸形成的情況下，這些標簽序列分別為寡聚賴氨酸、寡IMt氨酸、寡聚組氨酸。另外，由五聚體或六聚體形成的寡聚組氨酸通常是被稱為組氨酸標簽(HisTag)的標簽。從能夠使用市售的表達載體(vector)、能夠容易地構(gòu)建重組蛋白質(zhì)這一點出發(fā)，優(yōu)選使用組氨酸標^ft為標簽序列。作為在蛋白質(zhì)上附加標簽序列的方法，例如可以舉出在蛋白質(zhì)的一級序列上組入標簽序列的方法、在蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上以接枝狀附加標簽序列的方法。當在蛋白質(zhì)的一級序列中組入標簽序列時，為了使對蛋白質(zhì)的性質(zhì)造成的影響為最小限，優(yōu)選在作為蛋白質(zhì)分子的末端的N末端或C末端附加標簽序列，但也可以向蛋白質(zhì)的內(nèi)部序列組入標簽序列。此時，關(guān)于蛋白質(zhì)，可以通過制備組入了下述序列的表達載體，培養(yǎng)用該表達載體而轉(zhuǎn)化的;U^桿菌等，從該;U^桿菌分離純化表達的蛋白質(zhì)，由此來制備，所述的序列例如在使閱讀框一致的狀態(tài)下將編碼蛋白質(zhì)的基因及編碼標簽序列的基因融合而得的序列。當在蛋白質(zhì)的氨基酸瓶基上以接枝狀附加標簽序列時，例如，可以通制備。作為蛋白質(zhì)和標簽序列的偶聯(lián)方法，例如在將蛋白質(zhì)和標簽序列混合的狀態(tài)下，使用N-乙基-N，-(二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)等碳化二亞胺試劑等進行處理，由此可以在蛋白質(zhì)的氨基和/或亞氨基與標簽序列的末端氛基之間、蛋白質(zhì)的羧基和標簽序列的氨基和/或亞氨基之間、或者它們兩者處將蛋白質(zhì)和標簽序列偶聯(lián)。1.2.固定化用支持體使標簽蛋白質(zhì)固定化的固定化用支持體，優(yōu)選具有與標簽蛋白質(zhì)進行化學結(jié)合的官能團。這樣的官能團例如優(yōu)選是從氣基、環(huán)氣基、及曱M醃基中選擇的至少一種。由于在標簽序列中含有堿性氨基酸，所以固定化用支持體所具有的官能團由這些官能團組成，由此在標簽序列中的堿性氨基酸中所含的JL^和/或亞氨基與上述官能團高^L^應(yīng)，其結(jié)果，蛋白質(zhì)和固定化用支持體借助標簽序列進行化學結(jié)合，由此可以使標簽蛋白質(zhì)有效地固定化在固定化用支持體上，認為這有助于固定化量的增大。另外，標簽序列含有堿性氨基酸為連續(xù)3個以上的序列。堿性氨基酸具有#^及亞#*或任意一方，所以在標簽序列中，堿性氨基酸中所含的氨基和/或亞氣基的密度高，如后所述，該氛基和/或亞氨基的反應(yīng)性高。由此，與標簽蛋白質(zhì)中存在于標簽序列以外的部位的氨基等相比，可以使官能團發(fā)生反應(yīng)，所以可以減少對蛋白質(zhì)自身性質(zhì)的影響，認為這有助于已固定化的蛋白質(zhì)的性質(zhì)的維持。通過上述方法，可以得到標簽蛋白質(zhì)在標簽蛋白質(zhì)和固定化支持體上高效進行化學結(jié)合而得的蛋白質(zhì)固定化支持體。關(guān)于固定化用支持體中所含的官能團，在制作固定化用支持體時，例如，除了能夠通過共聚、接枝共聚、偶聯(lián)、等離子體處理等操作進行化學導入之外，還能夠通過混入、涂敷等操作對固定化用支持體進行物理導入。如果考慮官能團的導入效率，優(yōu)選官能團進行化學導入。1.3.標簽蛋白質(zhì)和固定化用支持體的固定化作為標簽蛋白質(zhì)和固定化用支持體的結(jié)合方法，例如可以舉出通過使而使標簽蛋白質(zhì)和固定化用支持體化學結(jié)合的方法。例如，當在固定化用支持體中有^&存在時，可以使用EDC等碳化二亞胺試劑通過胺偶聯(lián)法結(jié)合該羧基與蛋白質(zhì)中的JL^和/或亞氨基。就本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，作為要固定化的蛋白質(zhì)，在使用含有如下標簽序列的蛋白質(zhì)的情況下，可以使得與固定化用支持體中的官能團的偶聯(lián)效率飛躍性增大，因此可以將蛋白質(zhì)向固定化用支持體的固定化量大幅增加，所述的標簽序列具有堿性氨基酸為連續(xù)3個以上的序列。其結(jié)果，即^1A以往難以以足夠量在固定化用支持體上固定化的蛋白質(zhì)(例如蛋白G、蛋白A)，也能夠有效地在固定化用支持體上固定化。進而，就本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，作為標簽序列，使用賴氨酸、精氨酸及組氨酸中的任意一種氨基酸為連續(xù)3個以上的序列，由此可以進一步增大與固定化用支持體中的官能團的偶聯(lián)效率。其原因考慮為，當相同M酸連續(xù)以簇狀存在時，這些氨基酸殘基的反應(yīng)性增大。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因尚不確定，但認為通過使用賴氨酸、精關(guān)的氛基、亞氛基的密度局部增高，所以與作為反應(yīng)對象的固定化用支持體的官能團的相互作用增大，以及標簽序列的氣基酸的立體構(gòu)象成為適合反應(yīng)的位置等。另外，就本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而言，在固定用支持體具有從氛基、環(huán)氡基、及甲M耽基中選擇的至少一種官能團的情況下(特別是具有的官能團為環(huán)ltJ^L曱M醃基或其任意一方的情況)，可以使蛋白質(zhì)向固定化用支持體的固定化量增大。此時，關(guān)于蛋意一種M酸為連續(xù)3個以上的標簽序列，與反應(yīng)有7白質(zhì)和固定化用支持體的結(jié)合，可以在將兩者^t于適當?shù)娜軇┲兄笸ㄟ^混合一定時間來實現(xiàn)。對固定化用支持體的材質(zhì)沒有特別限定，例如可以是有機、無機、玻璃、金屬、或它們的復合體。作為固定化用支持體的形態(tài)，例如可以舉出粒子狀、膜狀、玻片狀、盤狀、板狀、纖維狀、管狀。在固定化用支持體為粒子狀的情況下，固定化用支持體優(yōu)選為磁性粒子。此時，固定化用支持體可以在粒子的內(nèi)部或表面含有磁性體。在固定化用支持體為磁性粒子的情況下，磁性體優(yōu)選僅含于該粒子的內(nèi)部而非在表面露出。由于固定化用支持體為磁性粒子，可以利用磁作用對粒子進行固液分離。磁性粒子的內(nèi)部組成可以為均質(zhì)，也可以為非均質(zhì)，但優(yōu)選殘留磁化少且含有超順磁性的磁性，粒的非均質(zhì)粒子。另外，就磁性粒子而言，通過使其比重低而使其在水中的沉降減慢，容易向水中^t,所以優(yōu)選含有有機物。作為具有非均質(zhì)的內(nèi)部組成的磁性粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可以舉出(I)由有機聚合物等非磁性的有機物形成的在連續(xù)相中有磁性體微粒分散的粒子；(II)以磁性，粒的二次凝聚物為核且以有機聚合物等非磁性的有機物為殼的粒子；(III)具有由有機聚合物等非磁性體形成的核粒子、在該核粒子的表面設(shè)有超順磁性微粒的二次凝聚物層(磁性體層)、和作為磁性體層的外層的有機聚合物層的粒子等。其中，優(yōu)選(III)在含有超順磁性微粒的二次凝聚物層的核粒子(以下將"含有超順磁性微粒的二次凝聚物層的核粒子"表示為"母粒子")的外層具有有機聚合物層的粒子。有機聚合物層可以由兩層以上的聚合物層構(gòu)成。需要說明的是，在各種粒子中使用的有機聚合物，優(yōu)選除了核-殼型粒子的核部分之外，形成粒子5^面的聚合物具有從氛基、環(huán)IL^、及甲^t?；羞x擇的至少一種官能團。另外，核粒子和其外層(磁性體層)的界面、以及磁性體層和其外層(有機聚合物層)的界面，可以是兩層的成分混合存在的狀態(tài)。作為上述(I)的粒子的優(yōu)選制造方法，例如可以舉出在特開平9-208788號公報中公開的方法。另外，作為上述(III)的粒子的優(yōu)選制造方法，例如可以舉出在特開2004-205481號乂》4艮中>^開的方法。作為磁性體，例如可以使用四氧化三鐵(Fe304)、三氧化二鐵(Y-Fe203)等各種鐵氧體、鐵、錳、鈷、鉻等金屬或這些金屬的合金等。通過使用平均粒徑為30nm以下的磁性體，可以得到基本上為超順磁性的固定化用支持體。關(guān)于磁性體的含量，優(yōu)選占所有粒子重量的比例為10重量°/。以上，更優(yōu)選20~80重量％。在這里，如果占所有粒子重量的比例為10重量％以下，則不會得到良好的磁分離性，分離需要相當長的時間，所以不優(yōu)選。另一方面，如果占所有粒子重量的比例為80重量％以上，則在粒子表面露出的磁性體增多，所以不優(yōu)選。在固定化用支持體是粒子狀的情況下，對粒子(固定化用支持體粒子)的粒徑?jīng)]有特別限制，通常為10nm~10mm。粒徑由激光衍射散射法求出。另外，上述粒子的形狀沒有必要為球狀，可以是針狀等異形粒子。作為本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的一例，可以舉出使與抗體分子具有親和性的作為蛋白質(zhì)的蛋白A或蛋白G在瓊脂糖制皿等固定化用支持體上固定化的支持體。關(guān)于該支持體，與以往的支持體相比，蛋白A或蛋白G的固定化量更多，因而可以增大抗體的純化容量。另外，在本實施方式涉及的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法中，要固定化的蛋白質(zhì)是抗體，使用聚合物乳膠等的,作為固定化用支持體，將抗體與該微粒結(jié)合而得的固定化支持體用作夾心ELISA法等的免疫診斷用支持體時，可以增加抗體的固定化量。由此，就分析對象抗原的測定臨界濃度而言，低濃度側(cè)及高濃度側(cè)均很寬，所以可以制作測定對象的濃度的動態(tài)范圍寬且可以在短時間內(nèi)檢查的診斷試劑。進而，當使各種蛋白質(zhì)或抗體總體地在芯片上固定化而制作蛋白質(zhì)芯片或抗體芯片時，可以制作在各種蛋白質(zhì)之間固定化量的波動少，能高精度評價的芯片。2.實施例以下，對本發(fā)明的實施例進^i兌明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。2.1.合成例l(具有氛基的固定化用支持體(膝性粒子)的合成)將75%二(3，5,5-三甲基己?；?過氧化物溶液(日本油脂制"PEROYL355-75(S)")2質(zhì)量份混合到1%十二烷絲酸鈉水溶液20質(zhì)量份，用超聲波^t劑微細乳化。將其放到裝有粒徑0.77nm的聚苯乙烯粒子13質(zhì)量份及水41質(zhì)量份的反應(yīng)器中，在25匸下攪拌12小時。使用其他容器，通過0.1°/。十二烷J^l酸鈉水溶液400質(zhì)量份將苯乙烯96質(zhì)量份及二乙烯基苯4質(zhì)量份乳化，將得到的液體放入到上述反應(yīng)器中，在40n下攪拌2小時，然后升溫至751C，聚合8小時。冷卻至室溫之后，進一步水洗利用離心分離而僅取出粒子的產(chǎn)物，干M粉碎，得到核粒子。核粒子的數(shù)均粒徑為1.5jum。接著，向油性磁性流體(商品名"EXP系列"，F(xiàn)errotec公司制)中添加丙酮，使粒子析出并沉淀，然后對其進行干燥，由此得到具有經(jīng)疏水化處理的表面的鐵氧體系的磁性體微粒(一次平均粒徑0.01nm)。接著，用混合機對上述核粒子15g及上U性體粒子15g進行混合，使用雜交系統(tǒng)NHS-O型(奈良M制作所(林)制)，以葉片(攪拌翼)的圓周速度100m/秒(16200rpm)對該混合物處理5分鐘，得到在表面具有由磁性體微粒形成的磁性體層的數(shù)均粒徑為2.0nm的母粒子。接著，將含有十二烷基^:酸鈉0.25重量％及非離子性乳化劑(商品名"Emulgen150"，花王(林)制)0.25重量％的水溶液(以下稱為"分散劑水溶液")375g^到1L可拆式燒瓶中，接著，^具有上i^t性體層的母粒子15g,用均化器進行分狀，然后加熱至601C。向a劑水溶液150g中加入甲基丙烯酸甲酯27g、三羥曱基丙烷三甲基丙烯酸酯(以下稱為"TMP")3g、及二(3，5，5-三甲基己醃基)過氧化物(日本油脂公司制；PEROYL355)0.6g，使其分^:得到預制乳狀液，用1小時30分鐘將該預制乳狀液滴加到溫座_控制成60n的上述1L可拆式燒瓶中。在滴加結(jié)束后，保持601C并攪拌1小時，然后向^t劑7JC溶液75g中加入甲基丙烯酸環(huán)己酯13.5§、甲基丙烯酸L5g、及二(3，5，5-三甲基己SLiO過氧化物(日本油脂公司制；PEROYL355)0.3g，使其^ft得到預制乳狀液，用1小時30分鐘將該預制乳狀液滴加到溫度控制成60n10的上述1L可拆式燒瓶中。然后升溫至751C，然后進一步繼續(xù)聚合2小時，^^應(yīng)結(jié)束。接著，使用磁力對上述可拆式燒瓶中的粒子進行分離，然后4吏用蒸餾水反復清洗。綜上，得到具有氣基的膝性粒子(以下為"A粒子")。2.2.合成例2(具有環(huán)氧基的固定化用支持體(磁性粒子)的合成)在合成例1中，使用13.5g的GMA及1.5g的TMP來代替13.5g的甲基丙烯酸環(huán)己酯及i.sg的甲基丙烯酸，除此之外，進行與合成例l相同的步驟，由此得到具有環(huán)氡基的粒子(以下為"粒子B")。2.3.合成例3(具有甲M酖基的固定化用支持體(磁性粒子)的合成)取利用凍結(jié)干燥得到的5g粒子B放到1L可拆式燒瓶中，it^lmol/L的硫酸60ml，在601C下攪拌6小時。接著，使用磁力對上述可拆式燒瓶中的粒子進行分離，然后4吏用蒸鎦水反復清洗。綜上，得到具有2，3-二羥基丙基的磁性粒子。使將該粒子進行凍結(jié)千燥而得到的干燥粒子l.Oga于8ml的吡啶中，然后添加對甲笨晴酰氯0.2g，室溫下攪拌2小時。反應(yīng)后，使用磁力分離粒子，用丙酮清洗4次，接著用蒸鐳水清洗4次，得到2，3-二羥基丙基被曱M?；拇判粤Ｗ?以下為"C粒子")。該磁性粒子(粒子C)的數(shù)均粒徑為2.9nm。2.4.實施例l對以下的四種蛋白質(zhì)，評價其向具有氛基的粒子A的固定化量。所述四種蛋白質(zhì)如下所示。(i)N末端具有組氨酸分子為連續(xù)6個的6組氨酸標簽的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(His6-GST、UpstateBiotechnology公司制，目錄編號No.12—350，分子量27kDa)，(ii)同樣在N末端具有6組氨酸標簽的Aktl(His6—Aktl、UpstateBiotechnology乂>司制，目錄編號No.14-279,分子量59kDa),(iii)同樣在N末端具有6組氨酸標簽的泛素(Ubiquitin)(His6—泛素、AFFINITIResearchProductsLtd制，目錄編號No.UW8610，分子量9.4kDa)、(iv)N末端具有組氨酸分子為連續(xù)10個的10組氨酸標簽的泛素(HislO-泛素、R&DSystemsInc制，目錄編號No.701-UB，分子量10kDa)o首先，利用超濾作用將各蛋白質(zhì)的溶劑置換成磷酸鈉緩沖溶液(10mM、pH7.0)，推^據(jù)吸光度將濃度調(diào)制成1.0mg/mL。如下所示評價這些蛋白質(zhì)向粒子A的固定化量。從粒子A^L液取lmg量的粒子到試管中，使用試管用的磁力架對粒子進行分離，然后除去上清，接著分歉于100iLiL的0.1M的MES緩沖溶液(pH5.0)中。向其中添加EDC的MES溶液(濃度10mg/mL)5HL，在25TC下反應(yīng)30分鐘。使用磁力架分離粒子并舍棄溶劑，新添加MES緩沖溶液100jiL。向其中加入蛋白質(zhì)溶液20nL，在25"C下振蕩反應(yīng)3小時。最后用0.5mL的洗滌液(0.05%含有Tween20表面活性劑的PBS緩沖液)清洗粒子4次，得到蛋白質(zhì)固定化磁性粒子。使用作為蛋白質(zhì)定量法的BCA測定法對該蛋白質(zhì)固定化量進行定量。濃度是以作為測定對象的蛋白質(zhì)溶液為標準物質(zhì)而算出。將其結(jié)果示于表2,5.比較例l作為實施例l的比較例，對以下的四種蛋白質(zhì)，采用與實施例l所用的方法相同的方法，測定其向粒子A的固定化量。所述四種蛋白質(zhì)如下所示。(i)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST、Sigma公司制，產(chǎn)品No.G5663，分子量26kDa),(ii)具有GST標簽的Aktl(GST-Aktl、Abnovacorporation公司制，目錄No.H00000207-P01，分子量79kDa)，(iii)泛素(泛素、NovusBiologicalsInc制，目錄編號No.NB800-PC40,分子量8.5kDa)，(iv)N末端具有GST標簽的泛素(GST-泛素、NovusBiologicalsInc制，目錄編號No.NB800-PC42，分子量35kDa)。利用超濾作用將各蛋白質(zhì)的溶劑置換成磷酸鈉緩沖溶液(10mM、pH7.0),利用吸光度將濃度調(diào)制成1.0mg/mL后使用。將得到的結(jié)果示于表l。2.6.實施例2在本實施例中，對于在實施例l中使用的四種蛋白質(zhì)，評價其向具有環(huán)氧基的粒子B的固定化量。從粒子B^L液取lmg量的粒子到試管中，使用試管用的磁力架對粒子進行分離，然后除去上清，接著^L于Lys6-蛋白G的0.1M硼酸緩沖溶液(pH9.5)中。向其中添加蛋白質(zhì)溶液20nL，在37"C下振蕩^[24小時。最后用0.5mL的洗滌液(0.05%含有Tween20表面活性劑的PBS緩沖液)清洗粒子4次，得到蛋白質(zhì)固定化磁性粒子。使用與實施例l所用的方法相同的方法，測定該蛋白質(zhì)固定化量。將其結(jié)果示于表2。2.7.比較例2在本比較例中，作為實施例2的比較例，對在比較例l中使用的四種蛋白質(zhì)，采用與實施例2所用的方法相同的方法，測定其向具有環(huán)氧基的粒子B的固定化量。將其結(jié)果示于表2。2.8.實施例3在本實施例中，作為粒子，使用具有甲M酰基的粒子C來代替粒子B，除此之外，采用與實施例2相同的材料和方法，進行將M白質(zhì)固定在粒子上的處理，然后測定蛋白質(zhì)的固定化量。將其結(jié)果示于表3。2.9.比較例3在本比較例中，作為實施例3的比較例，作為粒子，使用具有甲MiL基的粒子C來代替粒子B，除此之外，采用與比較例2相同的材料和方法，進行將各蛋白質(zhì)固定在粒子上的處理，然后測定蛋白質(zhì)的固定化量。將其結(jié)果示于表3?！脖?〕每lmg含有羧基的粒子A對蛋白質(zhì)的固定化量實施例l比較例lHis6-GST18"gGST10wgHis6—Akt114MgGST—Akt19tfgHis6-泛素14wg泛素9"gHis10-泛素16GST—泛素11wg〔表2〕13每lmg含有環(huán)氧基的粒子B對蛋白質(zhì)的固定化量實施例2比較例2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>〔表3〕每lrag含有甲^t?；牧Ｗ覥對蛋白質(zhì)的固定化量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本實施例中，使用蛋白G作為蛋白質(zhì)，對向固定化用支持體的固定化量中的標簽序列的效果進行研究。蛋白G是改變文獻BengtGussetal.(1986)TheEMBOJournal.5(7)1567-1575中記載的分子而使用。對于文獻中的蛋白G的JL&酸編號190號至384號的序列，制作在其N末端融合了有連續(xù)6個賴氨酸分子的6賴氨酸標簽(以下記為"Lys6")的賴氨酸標簽融合蛋白。按照文獻中記載的方法，獲得編碼氨基酸編號l卯號至384號的序列的基因，化學合成對其M末端側(cè)的6M酸序列進行的DNA，將其和對C末端的12^酸進行編碼的DNA用作PCR引物，用PCR法進行擴增，由此制作使與6賴氨酸標簽進行編碼的DNA融合且對蛋白G進行編碼的基因，將其導入到表達載體中，用大腸桿菌使其表達，然后對該大腸桿菌進行分離純化，由此制備具有目標標簽序列(賴氨酸標簽)的蛋白質(zhì)(Lys6-蛋白G)。利用與在實施例1中使用的方法相同的方法，將該Lys6-蛋白G固定于具有氛基的粒子A，測定其固定化量。將其結(jié)果示于表4。另外，測定該Lys6-蛋白G固定化粒子的免疫球蛋白G(IgG)固定化量。從Lys6-蛋白G固定化粒子的^ft液取lmg量的粒子到試管中，使用試管用的磁力架對粒子進行分離，然后除去上清，接著^ft于50nL的0.1M檸檬酸—磷酸緩沖溶液(pH5.0)中。向其中添加10nL的人IgG(Sigma公司制、商品編號14506)的0.1M檸檬酸-磷酸緩沖溶液(lmg/mL、pH5.0)，25匸下振蕩反應(yīng)1小時。用O.lM檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH5.0)清洗未>^應(yīng)的人IgG數(shù)次，然后用50nL的0.1M檸檬酸緩沖溶液(pH2.0)洗脫被粒子俘獲的人IgG，利用吸光度計算已回收的IgG量。將得到的每lmg粒子的IgG結(jié)合容量示于表4。2.11.比較例4制作與實施例4中舉出的文獻中的蛋白G的氨基酸編號l卯號至384號的序列相當?shù)牡鞍譍分子。按照文獻中記載的方法，獲得編碼蛋白G的"ll^酸編號190號至384號的序列的基因，將其導入到表達栽體中，用U桿菌使其表達，然后進行分離純化，由此制備目標蛋白G。利用與在實施例1中使用的方法相同的方法，將該蛋白G固定于具有氣基的粒子A上，測定其固定化量。將其結(jié)果示于表4。另外，利用與在實施例4中使用的方法相同的方法，測定人IgG的結(jié)合容量。將其值示于表4中?！脖?〕每lmg粒子的蛋白G固定化量和人IgG結(jié)合容量實施例4比較例4Lys6—蛋白G固定化量(Mg/腿一bead)IgG結(jié)合容量(Mg/邁g—bead)蛋白G固定化量("g/mg—bead)IgG結(jié)合容量(Mg/呢一bead)7.0161.52.8由表1~4所示可以確認，以含有連續(xù)3個堿性氨基酸的序列的標簽序列制作蛋白質(zhì)來制備標簽蛋白質(zhì)，將該標簽蛋白質(zhì)固定于固定化用支持體上，由此可以使蛋白質(zhì)在固定化用支持體上的固定化量增大。表l表示每lmg含有羧基的粒子A的蛋白質(zhì)固定化量。根據(jù)表l，無論4吏用何種蛋白質(zhì)，關(guān)于向固定化用支持體(含有氣基的粒子)的固定化量，與不具有標簽序列(扭s標簽)的蛋白質(zhì)相比，具有標簽序列(扭s標簽)的蛋白質(zhì)的固定化量更多。表2表示每lmg含有環(huán)氧基的粒子B的蛋白質(zhì)固定化量。根據(jù)表2，無論使用何種蛋白質(zhì)，與不具有標簽序列(His標簽)的蛋白質(zhì)相比，具有標簽序列(His標簽)的蛋白質(zhì)的固定化量更多。表3表示每lmg含有甲^Mtit^的粒子C的蛋白質(zhì)固定化量。根據(jù)表3，無論使用何種蛋白質(zhì)，關(guān)于向固定化用支持體(含有甲^t醃基的粒子)的固定化量，與不具有標簽序列(His標簽)的蛋白質(zhì)相比，具有標簽序列(His標簽)的蛋白質(zhì)的固定化量更多。表4表示每lmg含有羧基的粒子的蛋白G及Lys6-蛋白G固定化量、以;^AlgG結(jié)合容量。根據(jù)表4，蛋白G向固定化用支持體(含有g(shù)的粒子)的固定化量，通過使用將蛋白G與Lys6標簽融合而得到的標簽蛋白質(zhì)而得到提高。另外，將標簽蛋白質(zhì)(Lys6-蛋白G)固定化的粒子的IgG結(jié)合容量，大于將不具有Lys6標簽的蛋白質(zhì)(蛋白G)固定化的粒子的IgG結(jié)合容量，由此明確，通過使用將蛋白質(zhì)(蛋白G)與標簽序列(Lys6標簽)融合而得到的標簽蛋白質(zhì)(Lys6-蛋白G)，能夠提高蛋白質(zhì)固定化支持體的性能。另外，由表4所示可以確認，在使用蛋白G作為蛋白質(zhì)的情況下，固定化量增大，其結(jié)果，可以提高由IgG結(jié)合容量表示的蛋白質(zhì)固定化支持體的性能。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，其特征在于，包含在支持體上將具有標簽序列的蛋白質(zhì)固定化的工序，所述的標簽序列含有堿性氨基酸為連續(xù)三個以上的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，其中，所述堿性^J^^i賴氨酸、精氨酸、及組氨酸中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，其中，所述標簽序列是組氨酸標簽'4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任意一項所述的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，其中，所述固定化用支持體是磁性粒子。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任意一項所述的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，其中，所述固定化用支持體具有選自氛基、環(huán)氧基、及曱^tSL^中的至少一種官能團。6.—種蛋白質(zhì)固定化支持體，其特征在于，是通過權(quán)利要求1~5中任意一項所述的蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法而獲得的。全文摘要本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)固定化支持體的制造方法，包含在支持體上將具有標簽序列的蛋白質(zhì)固定化的工序，所述的標簽序列含有堿性氨基酸為連續(xù)三個以上的序列。文檔編號G01N33/543GK101632019SQ200880008020公開日2010年1月20日申請日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日發(fā)明者村田充弘,片寄聰,福田哲夫申請人:Jsr株式會社