專利名稱：一種紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于紅外光譜分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是一類與生命相關(guān)的生物大分子，是生命體最重要的組成部分之一。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)，不考慮側(cè)鏈的構(gòu)象及整個(gè)肽鏈的空間排列。常見的測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有X射線晶體衍射、核磁共振光譜、圓二色光譜、紫外光譜、熒光光譜與紅外光譜法等。X射線晶體衍射是確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法。雖然其能夠提供完整的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)信息，但它要求高質(zhì)量的單晶樣品，對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來說，得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難。核磁共振(NuclearMagnetic Resonance,簡(jiǎn)稱NMR)技術(shù)可以測(cè)定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象，但一般限于研究分子量不超過20 kD的較小的蛋白，而且對(duì)樣品的需求量大、純度要求高并且整個(gè)測(cè)定過程較慢，因而也受到較大的限制。圓二色譜(Circular Dichroism，簡(jiǎn)稱⑶)法被廣泛地用于測(cè)定溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)和多肽構(gòu)象的研究，但是只限于很窄的濃度范圍內(nèi)的澄清的溶液，且誤差很大。紫外和熒光光譜只限于測(cè)定蛋白質(zhì)分子中少數(shù)含有芳香族和雜環(huán)族的共軛環(huán)系統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)(如Trp，Try，Phe) ο 紅夕卜光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopic,簡(jiǎn)禾爾 FT-IR)屬于分子振動(dòng)吸收光譜，是化合物鑒定和結(jié)構(gòu)分析的常用手段。其獨(dú)特之處在于可以測(cè)定不同狀態(tài)、不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此它是目前研究蛋白質(zhì)及多肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的有效手段之一。然而在水溶液情況下，要得到高質(zhì)量的紅外圖譜，一般要求蛋白質(zhì)的濃度很高(>12mg/ml)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度下降時(shí)，紅外圖譜的質(zhì)量嚴(yán)重下降，特別是在對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象敏感的酰胺I帶。隨著噪音干擾的強(qiáng)度增加，二階導(dǎo)數(shù)的組成峰發(fā)生扭曲，這將直接影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算的準(zhǔn)確度。這一傳統(tǒng)方法對(duì)于蛋白質(zhì)濃度的要求使得紅外光譜在研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)受到限制，比如對(duì)疫苗的研究、對(duì)一些難溶性蛋白質(zhì)的研究等等。更為重要的是，由于熒光光譜和圓二色譜等技術(shù)研究蛋白質(zhì)時(shí)要求濃度很低，而傳統(tǒng)紅外光譜方法要求濃度很高，二者互相比較時(shí)就存在很大不確定性。因此建立一種測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的紅外光譜方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、測(cè)試效率高的用紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明提出的紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，采用蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀，具體步驟如下
1、制備氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物，具體步驟為
a.質(zhì)量濃度為洲氫氧化鋁膠體和蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的緩沖液(如50 mM Tris, PH 7.8，100 mM KCl, 1 mM EDTA)按體積比為1 4_1 6混合，以低轉(zhuǎn)速4000_5000rpm (每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，revolutions per minute)離心 2-3 分鐘；
b.去除上清液，用緩沖液(如50mM Tris, PH 7.8,100 mM KCl, 1 mM EDTA)將步驟a中得到的氫氧化鋁沉淀重懸至原濃度；
c.將低濃度(為0.5mg/ml-l. 5mg/ml)的蛋白質(zhì)和步驟b中所得的氫氧化鋁膠體按體積1:8-1:12混合，搖勻后放置室溫孵化30-40分鐘；
d.將步驟c中所得的混合物以轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心2_3分鐘，去除上清液；
2、收集譜圖將由緩沖液洗過的的氫氧化鋁膠體均勻的鋪滿蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀的6. 5um固定光程的CaF2樣品池，使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件收集背景光譜；在相同條件下，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物均勻的鋪滿CaF2樣品池，調(diào)節(jié)固定樣品池，使得和背景的光程一樣，收集樣品的紅外光譜3、譜圖處理使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物的紅外圖譜扣除氫氧化鋁膠體的背景圖譜；位于2000 ^-1750 CnT1間呈一條光滑直線作為背景扣除與否的標(biāo)志；使用Prota軟件中Mvitsky-Golay求導(dǎo)功能對(duì)蛋白質(zhì)吸收光譜進(jìn)行二次求導(dǎo)，獲得二級(jí)導(dǎo)數(shù)譜，并作基線修正。。氫氧化鋁是一種纖維狀粒子，這種粒子聚集后以松散的形式存在，粒子大小I-IOum。其表面可以吸附大量的蛋白質(zhì)。將氫氧化鋁膠體和低濃度蛋白質(zhì)溶液混合后，蛋白質(zhì)吸附在氫氧化鋁表面，形成氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物作為紅外光譜樣品用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。商品化的氫氧化鋁佐劑實(shí)際上是Al (OH)3的不完全脫水產(chǎn)物，即纖維狀結(jié)晶的偏氫氧化鋁。不同生產(chǎn)批次間的商用氫氧化鋁粒徑可能有差異，目前以丹麥生產(chǎn)的Alhydrogel為公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，其膠粒大小為3. 07um，通過傳統(tǒng)紅外光譜法測(cè)得氫氧化鋁佐劑的比表面積約為514m2/g。本發(fā)明實(shí)施例中選用上述丹麥生產(chǎn)的產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明在保持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)不變和高質(zhì)量紅外圖譜的前提下，對(duì)蛋白質(zhì)樣品濃度的要求可低至0. 5mg/ml，和傳統(tǒng)方法相比，至少降低了 M倍，拓寬了紅外光譜對(duì)蛋白質(zhì)研究的范圍，且操作簡(jiǎn)單、方便，不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮，節(jié)省了大量時(shí)間，提高了測(cè)試效率。更重要的是，該發(fā)明使得蛋白紅外光譜能和熒光光譜及圓二色譜這二種常用的研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的光譜技術(shù)可以直接進(jìn)行比較。


圖1為傳統(tǒng)方法測(cè)定環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(CRP)濃度分別為3，6，9，12，15 mg/ml時(shí)的紅外吸收?qǐng)D譜。圖2為傳統(tǒng)方法測(cè)定CRP濃度分別在3，6，9，12，15 mg/ml時(shí)的酰胺I帶的紅外二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜。圖3為濃度從上到下分別為0. 5，1. 0，1. 5 mg/ml的CRP-AL (OH) 3復(fù)合物的紅外光譜和傳統(tǒng)方法測(cè)定15 mg/ml CRP的紅外圖譜的比較。圖4為濃度分別為0.5，1.0，1.5 mg/ml的蛋白激酶(PK)與AL(OH)3復(fù)合物的紅外光譜和傳統(tǒng)方法測(cè)定15mg/mlH(的紅外圖譜的比較。圖5為濃度分別為0. 5，1. 0，1. 5mg/ml的鈣調(diào)蛋白(CaM)與AL(OH) 3復(fù)合物的紅外光譜和傳統(tǒng)方法測(cè)定15 mg/ml CaM的紅外圖譜的比較。圖6為濃度分別為0. 5，1. 0，1. 5 mg/ml的蛋白磷酸化酶(CN)和AL(OH)3復(fù)合物的紅外光譜和傳統(tǒng)方法測(cè)定15 mg/ml CN的紅外圖譜的比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
采用蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀，該紅外光譜儀分辨率McnT1，波長范圍4000 011^-450cm-1，掃描次數(shù)3次\秒，掃描總數(shù)120次；
(a) 1 ml質(zhì)量濃度為洲氫氧化鋁膠體(Breentagg公司)和5mlTEK緩沖液(50 mMTris, PH 7. 8，100 mM KCl, 1 mM EDTA)混合后(兩者體積比為1:5)，以轉(zhuǎn)速5000 rpm離心2分鐘；
(b)去除上清液，用TEK緩沖液將步驟(a)中得到的氫氧化鋁沉淀重懸至原濃度；
(c)取濃度為0.5 mg/ml和1. 0 mg/ml, 1. 5mg/ml的環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(CRP)等蛋白各50 ul，分別和500 ul步驟(b)中所得的洲氫氧化鋁混合后，室溫孵化30分鐘；
(d)將步驟(c)中所得的混合物以轉(zhuǎn)速5000rpm離心2分鐘，去除上清液，得氫氧化鋁和CRP等蛋白的復(fù)合物；
(e)步驟(b)所得氫氧化鋁膠體均勻的鋪滿6.5 um固定光程的紅外光譜CaF2樣品池，收集背景光譜。參數(shù)分辨率4 cnT1，波長范圍4000 ^-450 cnT1，掃描次數(shù)3次\秒，掃描總數(shù)120次；
(f)在和步驟(e)參數(shù)設(shè)置相同條件下，將氫氧化鋁-蛋白復(fù)合物均勻的鋪滿CaF2樣品池，調(diào)節(jié)固定樣品池的螺絲，使得和背景的光程一樣后，收集樣品的紅外光譜(g)譜圖處理使用數(shù)據(jù)處理軟件，將步驟(f)得到的氫氧化鋁-環(huán)磷酸腺苷受體蛋白復(fù)合物的圖譜扣除步驟(e)得到的氫氧化鋁膠體的背景圖譜，得到氫氧化鋁-環(huán)磷酸腺苷受體蛋白復(fù)合物的紅外吸收?qǐng)D譜，位于2000 ^-1750 cnT1間呈一條光滑直線作為背景扣除與否的標(biāo)志。使用Prota軟件中Mvitsky-Golay求導(dǎo)功能對(duì)蛋白質(zhì)吸收光譜進(jìn)行二次求導(dǎo)，獲得二級(jí)導(dǎo)數(shù)譜，并作基線修正；
(f)將步驟(g)獲得的0. 5 mg/ml, 1. 0 mg/ml, 1. 5 mg/ml的氫氧化鋁-蛋白復(fù)合物二級(jí)導(dǎo)數(shù)譜和傳統(tǒng)方法測(cè)定的蛋白濃度為15mg/ml時(shí)的紅外二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果表明環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(CRP)在低濃度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜和高濃度15mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜基本重合，說明環(huán)磷酸腺苷受體蛋白和氫氧化鋁結(jié)合后，在保持較高的紅外圖譜質(zhì)量時(shí)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。實(shí)施例2:
蛋白質(zhì)為丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, HO，緩沖液為50 mM Tris, PH 7.5，其他條件與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明丙酮酸激酶(PK)在低濃度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜和高濃度15mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜基本重合，說明丙酮酸激酶和氫氧化鋁結(jié)合后，在保持較高的紅外圖譜質(zhì)量時(shí)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。實(shí)施例3:
蛋白質(zhì)為鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)，緩沖液為 50 mM Tris, 100 mM NaCl, PH 7.5。其他條件與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明鈣調(diào)蛋白(CaM)在低濃度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜和高濃度15mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜基本重合，說明鈣調(diào)蛋白和氫氧化鋁結(jié)合后，在保持較高的紅外圖譜質(zhì)量時(shí)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。
實(shí)施例4:
蛋白質(zhì)為蛋白磷酸化酶(CalcineurimCN)，其他與實(shí)施例3相同。結(jié)果表明蛋白磷酸化酶(CN)在低濃度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜和高濃度15mg/ml時(shí)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)圖譜基本重合，說明蛋白磷酸化酶和氫氧化鋁結(jié)合后，在保持較高的紅外圖譜質(zhì)量時(shí)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。
權(quán)利要求
1. 一種紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于具體如下(1)制備氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物，具體步驟為a.將質(zhì)量濃度為洲氫氧化鋁膠體和蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的緩沖液按體積比為1:4-1:6混合，以低轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心2_3分鐘；b.去除上清液，用緩沖液將步驟a中得到的氫氧化鋁沉淀重懸至原濃度；c.將濃度為0.5mg/ml-l. 5mg/ml的蛋白質(zhì)和步驟b中所得的氫氧化鋁膠體按體積1:8-1:12混合，搖勻后放置室溫孵化30-40分鐘；d.將步驟c中所得的混合物以轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心2_3分鐘，去除上清液；(2)收集譜圖將由緩沖液洗過的氫氧化鋁膠體均勻的鋪滿蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀的.6. 5um固定光程的CaF2樣品池，使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件收集背景光譜；在相同條件下，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物均勻的鋪滿CaF2樣品池，調(diào)節(jié)固定樣品池，使得和背景的光程一樣，收集樣品的紅外光譜圖；(3)譜圖處理使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物的紅外圖譜扣除氫氧化鋁膠體的背景圖譜；位于2000 ^-1750 CnT1間呈一條光滑直線作為背景扣除與否的標(biāo)志，使用軟件中Mvitsky-Golay求導(dǎo)功能對(duì)蛋白質(zhì)吸收光譜進(jìn)行二次求導(dǎo)，獲得二級(jí)導(dǎo)數(shù)譜，并作基線修正。
全文摘要
本發(fā)明屬于紅外光譜分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種紅外光譜測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明利用氫氧化鋁膠體對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性，濃縮低濃度蛋白質(zhì)，形成氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物，用于紅外光譜檢測(cè)。該發(fā)明使得紅外光譜在測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)濃度的要求降低至0.5mg/ml，和傳統(tǒng)紅外光譜測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)方法相比對(duì)蛋白質(zhì)濃度的要求至少下降了24倍。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、測(cè)試效率高。
文檔編號(hào)G01N21/35GK102393379SQ20111035378
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者余紹寧, 吁亭, 高錚亞 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)