一種大量制備BCG-CpG-DNA的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用Q?Sepharose?HP離子交換制備卡介菌CpG-DNA的方法，將卡介菌培養(yǎng)繁殖后裂解，獲得卡介菌裂解液，裂解液離心，從離心后的卡介菌裂解液中直接將多糖、蛋白和RNA等雜質(zhì)除掉以獲得純化的卡介菌CpG-DNA，該方法制得的卡介菌CpG-DNA無有機溶劑殘留。
【專利說明】—種大量制備BCG-CpG-DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從卡介菌提取的CpG-DNA (簡稱BCG_CpG_DNA)及其制備方法，BCG-CpG-DNA可用作治療和預防用疫苗的佐劑。
【背景技術(shù)】
[0002]佐劑是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐劑方面，雖然鋁佐劑的應用已有80年歷史，其安全性也經(jīng)過了長期應用的檢驗，但由于其對細胞免疫作用不明顯，尤其對細胞免疫為主的疫苗，如對高純化的第二代重組疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人們一直致力于新型佐劑的研究。
[0003]近年來，CpG-DNA成為新型免疫佐劑的研究熱點。除了人工合成的CpG寡核苷酸(CpG 0DN)之外，原核生物的DNA是CpG-DNA的主要來源。BCG-CpG-DNA是從卡介菌(BCG)中提取的菌體DNA片段，其富含未甲基化CpG基序，具有免疫刺激活性，可用作治療和預防用疫苗中的佐劑。
[0004]原有工藝(專利ZL200410033878.1)在制備BCG_CpG_DNA的過程中使用有機溶劑酚、氯仿來除去多糖、蛋白等雜質(zhì)，酚、氯仿均為有毒試劑，在制藥生產(chǎn)中使用有潛在的危險。如果用于生產(chǎn)，不但有安全隱患，產(chǎn)品中有殘留量需進行檢測，也增加了質(zhì)量控制檢測項目。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明對BCG-CpG-DNA原制備工藝進行了改進，采用離子交換純化的方法，從BCG的菌體裂解液中直接將多糖、蛋白和RNA等雜質(zhì)除掉，以純化BCG的菌體DNA(BCG-CpG-DNA)，無有機溶劑殘留，該方法尤其適合純化大分子量的BCG-CpG-DNA片段。
[0006]本發(fā)明基本工藝為:菌體培養(yǎng)、菌體裂解、裂解液澄清、裂解液純化、純化液濃縮、濃縮液除菌分裝。
[0007]本發(fā)明對BCG-CpG-DNA的分離純化可通過如下的方法實現(xiàn):
[0008]在獲得卡介菌菌體裂解液之后,利用Q Sepharose HP離子交換柱從卡介菌裂解液分離卡介菌CpG-DNA。
[0009]卡介菌CpG-DNA裂解液的Q Sepharose HP離子交換柱分離可以在TE緩沖體系或磷酸鈉緩沖體系中進行。
[0010]如果在磷酸鈉緩沖體系中進行分離，卡介菌CpG-DNA裂解液樣品可采用如下的上樣緩沖液:0-0.5M氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5-8.5，優(yōu)選上樣緩沖液為0.5M氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5 ;如下的洗脫緩沖液:1M氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，PH7.5-8.5，優(yōu)選洗脫緩沖液為IM氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5。優(yōu)選上樣后的洗脫采用梯度洗脫，梯度洗脫的方法為先用50% -65%所述洗脫緩沖液洗脫，之后用100%所述洗脫緩沖液洗脫，根據(jù)樣品洗脫峰后，電導和紫外檢測穩(wěn)定后就可以停止洗脫；進一步優(yōu)選為先用50% -65%所述洗脫緩沖液洗脫用量2-7CV，之后用100%所述洗脫緩沖液洗脫用量2-7CV ;更優(yōu)選先用50%所述洗脫緩沖液洗脫用量7CV，之后用100%所述洗脫緩沖液洗脫用量2CV。
[0011]如果在TE緩沖體系中進行分離，卡介菌CpG-DNA裂解液樣品可采用如下的上樣緩沖液:0-0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5_8.5，優(yōu)選上樣緩沖液為 0.5M NaCl+50mMTris+lmM EDTA ρΗ7.5 ;如下的洗脫緩沖液:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA ρΗ7.5-8.5，優(yōu)選洗脫緩沖液為IM NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5。優(yōu)選上樣后的洗脫采用梯度洗脫，梯度洗脫的方法為25-65%所述洗脫緩沖液洗脫，繼續(xù)100%所述洗脫緩沖液洗脫，根據(jù)樣品洗脫峰后，電導和紫外檢測穩(wěn)定后就可以停止洗脫；進一步優(yōu)選為25% -65%所述洗脫緩沖液洗脫用量4-10CV，繼續(xù)100%所述洗脫緩沖液洗脫用量2-10CV ;更優(yōu)選為30%所述洗脫緩沖液洗脫用量7CV，繼續(xù)100%所述洗脫緩沖液洗脫用量2CV。
[0012]為了得到更好的分離純化效果，在用Q Sepharose HP離子交換柱純化前，卡介菌裂解液可以進一步進行澄清化處理。所述的澄清化處理可以是將破碎的菌體裂解液稀釋到200mg / ml的濃度,高速冷凍離心機4°C、8000-12000rpm / min離心，10_20minX2次,收集上清，和/或經(jīng)1.0-1.2 μ m的濾器過濾。破碎卡介菌菌體以獲得菌體裂解液時所用的液體體系和稀釋卡介菌裂解液時所用的液體體系，可以是去離子蒸餾水，也可以是合適的緩沖液，為了方便之后的分離純化操作，優(yōu)選使用的液體體系是分離純化操作時所用的上樣緩沖液或洗脫緩沖液。
[0013]進一步為了得到更好的分離純化效果，在分離純化時，上樣的卡介菌CpG-DNA裂解液樣品中可以含有0-0.5M NaCl，優(yōu)選含有0.5M NaCl，為達到該目標，可以在菌體破碎裂解和稀釋卡介菌菌體裂解液時使用相應的上樣緩沖液。如果在菌體破碎裂解和稀釋卡介菌菌體裂解液時使用的是去離子蒸餾水，則可以在上樣時采用相應的洗脫液稀釋上樣樣品，以達到上樣CpG-DNA裂解液樣品中含有0-0.5M NaCl的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1A BCG裂解液的S印haceyl400HR純化圖譜；
[0015]圖1B BCG裂解液S印haceyl400HR純化后的電泳圖譜；
[0016]圖2A BCG裂解液的S印harose4FF純化圖譜；
[0017]圖2B BCG裂解液的S印harose4FF純化后的電泳圖譜；
[0018]圖2C BCG裂解液的S印harose4FF純化后的電泳圖譜(續(xù))；
[0019]圖3A BCG裂解液的Q Sepharose FF純化圖譜；
[0020]圖3B BCG裂解液的Q Sepharose FF純化后的電泳圖譜；
[0021]圖4A BCG裂解液的Q Sepharose HP純化圖譜；
[0022]圖4B BCG裂解液的Q Sepharose HP純化后的電泳圖譜；
[0023]圖4C BCG裂解液的Q Sepharose HP純化洗脫組分2的電泳圖譜；
[0024] 圖5A BCG 裂解液的 20ml Q Sepharose HP 純化圖譜，0-100% IOCV ；
[0025] 圖5B BCG 裂解液的 20ml Q Sepharose HP 純化的電泳圖譜，0-100% IOCV ；
[0026] 圖6A BCG 裂解液的 20ml Q Sepharose HP 純化圖譜，65% 4CV100% 7CV ；
[0027] 圖6B BCG 裂解液的 20ml Q Sepharose HP 純化的電泳圖譜，65% 4CV100% 7CV ；
[0028]圖7BCG裂解液的400ml Q Sepharose HP純化的電泳圖譜；[0029]圖8A 洗脫緩沖液 1:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5 的洗脫圖譜:
[0030]圖8B 洗脫緩沖液 2:2M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5 的洗脫圖譜；
[0031 ] 圖9A緩沖液調(diào)成ρΗ7.5純化圖譜；
[0032]圖9Β緩沖液調(diào)成ρΗ8.0純化圖譜；
[0033]圖9C緩沖液調(diào)成ρΗ8.5純化圖譜；
[0034]圖9D緩沖液調(diào)成ρΗ9.0純化圖譜；
[0035]圖9Ε緩沖液分別調(diào)成ρΗ7.5,8.0,8.5,9.0純化電泳檢測圖譜；
[0036]圖1OA BCG裂解液的4000ml Q Sepharose HP純化圖譜，菌體量724g ;
[0037]圖1OB BCG裂解液的4000ml Q Sepharose HP純化圖譜，菌體量529g ;
[0038]圖1OC BCG 裂解液的 4000ml Q Sepharose HP 純化圖譜，菌體量 1382g ；
[0039]圖11 A液稀釋樣品、線性梯度上升B液濃度洗脫純化效果電泳圖，其中泳道1，11:Ikb DNA ladder Marker ；2:上樣樣品過濾前；3:上樣樣品過濾后；4:流穿峰；5:洗脫峰I ;6:洗脫峰2 ；7:洗脫峰3 ；8:洗脫峰4 ；9:洗脫峰5 ；10:洗脫峰6 ；
[0040]圖12A樣品B液稀釋I倍、線性梯度上升B液濃度洗脫核酸純化圖譜；
[0041]圖12B樣品B液稀釋I倍、線性梯度上升B液濃度洗脫核酸純化后電泳圖，其中泳道1，7:lkb DNA ladder Marker ；2:上樣樣品過濾膜前；3:上樣樣品過濾膜后；4:流穿峰；
5:洗脫峰I ;6:洗脫峰2 ；
[0042]圖12C樣品B液稀釋I倍、線性梯度上升B液濃度洗脫核酸純化后CRnase處理電泳圖，其中泳道1，8 =1000bp DNA Marker ；2:上樣樣品；3 =RNase A處理過的上樣樣品；4:洗脫峰I ;5 =RNase A處理過的洗脫峰I ;6:洗脫峰2 ；7 =RNase A處理過的洗脫峰2 ；
[0043]圖13A線性梯度上升B液濃度洗脫核酸的優(yōu)化純化圖譜；
[0044]圖13B線性梯度上升B液濃度洗脫核酸的優(yōu)化后電泳圖，其中，泳道1:上樣樣品；
2:洗脫峰 2 ；3:洗脫峰 3 ；4:洗脫峰 4 ；5:lkb DNA ladder Marker ；
[0045]圖14A磷酸鈉緩沖體系純化BCG-CpG-DNA最優(yōu)條件的純化圖譜；
[0046]圖14B磷酸鈉緩沖體系純化BCG-CpG-DNA最優(yōu)條件的純化電泳圖，其中，泳道1:1kb DNA ladder Marker ；2:上樣樣品；3:50%洗脫收集液I ;4:50%洗脫收集液2 ；5:50%洗脫收集液3 ；6:50%洗脫收集液4 ；7:100%洗脫收集液；
[0047]圖15 TE緩沖體系純化BCG-CpG-DNA的純化圖譜。
【具體實施方式】
[0048]以下通過具體實施例和試驗結(jié)果詳細介紹本發(fā)明的創(chuàng)新和應用意義所在，以幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的精神和實質(zhì)，但不構(gòu)成對本發(fā)明實施范圍的限定。
[0049]BCG-CpG-DNA 的制備
[0050]步驟一、菌體培養(yǎng):
[0051]將卡介菌菌種接種于馬鈴薯蘇通培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)種于改良的液體蘇通培養(yǎng)基，37°C下培養(yǎng)14-20天；
[0052]其中，馬鈴薯蘇通培養(yǎng)基的制備方法可以是:
[0053]取洗凈新鮮土豆(1個)，用穿刺器穿成圓柱，再用刀切成4公分長斜面；
[0054]用流動飲用水沖洗土豆斜面I小時；[0055]用純化水沖洗土豆斜面塊；
[0056]用蘇通培養(yǎng)基沖洗斜面塊；
[0057]取蘇通培養(yǎng)基20ml，加入100ml滅菌大管中；
[0058]將沖洗后的土豆斜面放入裝有蘇通培養(yǎng)基的滅菌大管中；
[0059]10磅20分鐘滅菌。
[0060]改良的液體蘇通培養(yǎng)基配方及制備:
[0061]天冬素(AR):4g
[0062]檸檬酸(AR):2g
[0063]K2HPO4.3H20 (AR):0.5g
[0064]MgSO4.7H20 (AR):0.5g
[0065]檸檬酸鐵銨(CP):0.05g
[0066]甘油(藥用):60ml
[0067]蒸餾水:94 0ml
[0068]以NH3.H2O 調(diào)節(jié) ρΗ7.2-7.4 之間，
[0069]然后加1% (W / V)硫酸鋅1ml，10磅20分鐘滅菌。
[0070]步驟二、菌體收集:
[0071]待菌體生長至對數(shù)期時，對培養(yǎng)瓶逐瓶檢查后，收集菌膜，加入適量去離子蒸餾水洗滌，壓干后稱重。
[0072]步驟三、菌體裂解:
[0073]將收集的菌體以去離子蒸餾水或BCG-CpG-DNA離子交換分離用的上樣緩沖液按Ig / ml混勻，以組織搗碎勻漿機獲得菌體裂解液。
[0074]步驟四、裂解液澄清:
[0075]將破碎的菌體裂解液以去離子蒸餾水或BCG-CpG-DNA離子交換分離用的上樣緩沖液稀釋到200mg / ml的濃度，高速冷凍離心機4 °C、8000-12000rpm / min離心,10-20minX2次，收集上清。上柱前可以再經(jīng)1.0-1.2 μ m的濾器過濾。
[0076]步驟五、澄清裂解液純化:
[0077]A、純化柱填料的選擇
[0078](一 )凝膠過濾
[0079]1、凝膠過濾填料:S印haceyl400HR:分離范圍2X 104_8X IO6
[0080]空色譜柱:XK16/ 100 (GE 產(chǎn)品)
[0081]柱床體積:180ml，
[0082]柱床聞度:90cm
[0083]緩沖液:0.01M PBS
[0084]流速:1.5ml/ min
[0085]上樣:2ml BCG裂解液
[0086]BCG裂解液的純化圖譜見圖1A ;將各收集產(chǎn)物進行電泳分析，結(jié)果見圖1B(電泳條件:(λ 8%凝膠電泳，150V,45min);電泳結(jié)果表明S印haceyl400HR填料不能將BCG-CpG-DNA有效分離。
[0087]2、凝膠過濾填料:Sepharose4FF:分離范圍 6 X 104_20X IO7[0088]色譜柱:XK16/ 100 (GE 產(chǎn)品)
[0089]柱床體積:180ml,
[0090]柱床高度:90cm
[0091]緩沖液:2M(NH4)2SO4+1OmMEDTA+1OOmMTrisHCl ρΗ7.0
[0092]流速:1.5ml/ min
[0093]上樣:2ml BCG裂解液
[0094]回收:6mg / 150柱體積
[0095]BCG裂解液的純化圖譜見圖2A ;將各收集產(chǎn)物進行電泳分析，結(jié)果見圖2B、圖2C(電泳條件:0.8%凝膠電泳，150V，45min);電泳結(jié)果表明S印harose4FF填料不能將BCG-CpG-DNA有效分離。[0096]( 二 )離子交換
[0097]1、離子交換介質(zhì):Q Sepharose FF, Iml預裝柱(GE產(chǎn)品)。
[0098]純化條件
[0099]緩沖液:A液:50mM Tris+lmM EDTA pH8.0
[0100]B 液:IM NaCl+50mM Tris+lmM EDTA ρΗ8.0
[0101]樣品:1.07mg/ ml BCG 裂解液
[0102]上樣量:1ml
[0103]BCG裂解液純化圖譜見圖3A，根據(jù)吸光圖譜收集樣品，結(jié)果顯示分別在B液濃度25%、60%、70%有樣品洗脫下來，樣品做水平核酸電泳，結(jié)果見圖3B(電泳條件:0.8%凝膠電泳，電壓150V，時間45分鐘)；電泳結(jié)果顯示DNA存在于流穿峰中，同時70 %B液洗脫液中含有部分大分子量的BCG-CpG-DNA ;純化圖譜和電泳結(jié)果顯示流穿峰中BCG-CpG-DNA的量遠超過70%洗脫峰中BCG-CpG-DNA的量，這說明大部分BCG-CpG-DNA流穿，BCG-CpG-DNA不能有效地結(jié)合在介質(zhì)Q Sepharose FF上。
[0104]2、離子交換介質(zhì):Q Sepharose HP, Iml預裝柱(GE產(chǎn)品)。
[0105]緩沖液:A液:50mM Tris+lmM EDTA pH8.0
[0106]B 液:IM NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH8.0
[0107]樣品:1.07mg / ml BCG 裂解液；
[0108]上樣量:1ml
[0109]BCG裂解液純化圖譜見圖4A，根據(jù)吸光圖譜收集樣品，結(jié)果顯示，共有三個洗脫峰，將各洗脫峰進行電泳分析，電泳圖譜見圖4B(電泳條件:0.8%凝膠電泳，150V，45min)；電泳結(jié)果顯示，流穿中有少量核酸，洗脫峰I無BCG-CpG-DNA，洗脫峰2為小分子量核酸，洗脫峰3為BCG-CpG-DNA。將洗脫峰2加入RNase37°C處理0.5h與原樣一起進行電泳分析，電泳圖譜見圖4C(電泳條件:3%凝膠電泳)，結(jié)果顯示加酶處理過的樣品無條帶顯示，表明洗脫峰2為RNA。純化圖譜和電泳結(jié)果表明Q Sepharose HP填料能將DNA與RNA分離，因此選用Q Sepharose HP填料。
[0110]純化填料實驗結(jié)果:選擇Q Sepharose HP填料,Q Sepharose HP能將RNA同目的物DNA區(qū)別開來，同時Q Sepharose HP填料顆粒小，分辨率高，線性放大能力較好。
[0111]B、純化填料放大、梯度選擇實驗
[0112]( 一 ) Q Sepharose HP,填料體積 2Oml,色譜柱:)(K16 / 20.[0113]上樣量:12.5ml BCG裂解液
[0114]上樣緩沖液:50mMTris+lmM EDTA pH8.0
[0115]洗脫緩沖液:1MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH8.0
[0116]梯度0-100% IOCV
[0117]上樣流速:1ml/ min
[0118]洗脫流速:5ml/ min [0119]BCG裂解液的純化圖譜圖5A ;將各收集峰進行電泳分析，電泳圖譜見圖5B (電泳條件:0.8%凝膠電泳，電壓150V，時間45分鐘)，結(jié)果顯示，流穿峰中無目的DNA，洗脫峰2、3中有少量DNA，但體積少，8為RNA，9為目的DNA ;純化圖譜顯示B液60-70%可以將目的DNA與其他雜質(zhì)分離，因此選擇65%和100%兩個梯度進行洗脫實驗。
[0120](二)Q Sepharose HP,填料體積 2Oml,色譜柱:)(K16 / 20.[0121]上樣量:12.5ml BCG裂解液
[0122]上樣緩沖液:50mMTris+lmM EDTA pH8.0
[0123]洗脫緩沖液:1MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH8.0
[0124]梯度65 % 4CV100 % 7CV
[0125]上樣流速:1ml/ min
[0126]洗脫流速:5ml/ min
[0127]BCG裂解液的純化圖譜圖6A ;將各收集峰進行電泳分析，電泳圖譜見圖6B (電泳條件:0.8%凝膠電泳，150V，，45min)，結(jié)果顯示，流穿峰中無目的DNA，65%洗脫為小分子量的RNA，100%洗脫峰中為目的DNA。
[0128]同時根據(jù)紫外分光檢測的結(jié)果，如表1所示:100%洗脫峰共26ml，3倍稀釋后A260=0.8969，則DNA的回收量為3.5mg / 12.5mlBCG裂解液，該產(chǎn)率適合放大。
[0129]表1Q Sepharose HP純化各峰組分含量檢測
[0130]
DNAug/ml 蛋白 ug/mlRNA
體積---^--
紫外分光Lowary法蒽酮法0_8%_電
_________泳
細菌裂解液 μ ,
12ml…2233940-------
(200mg/ml)___
流穿峰28.5ml__---__98__656__
65%洗脫峰17ml----1164147__有 RNA
100% 洗脫峰26ml__135__47__74__——
乙醇沉淀DNA丨4.8ml726未測出未測出 -----------
[0131]上述實驗結(jié)果表明，使用Q Sepharose HP陰離子交換柱能較好的將目的DNA同多糖、蛋白及RNA分離。目前20ml的Q Sepharose HP介質(zhì)每次可以純化3.5_5mgDNA,將QSepharose HP介質(zhì)體積放大，則DNA的產(chǎn)量將擴大。
[0132]C、TE緩沖體系純化條件選擇[0133](一)純化緩沖液鹽濃度的選擇
[0134]1、上樣緩沖液鹽離子濃度的選擇
[0135]Q Sepharose HP,填料體積 400ml,色譜柱:)(K50 / 30
[0136]樣品:200ml
[0137]上樣緩沖液1:50mM Tris+lmM EDTA pH8.5
[0138]上樣緩沖液2:0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH8.5
[0139]洗脫緩沖液:1MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH8.5
[0140]梯度洗脫:上樣緩沖液1，65%、100%
[0141]梯度洗脫:上樣緩沖液2，30%、100%
[0142]純化產(chǎn)物檢測結(jié)果如表2所示；將各收集峰進行電泳分析，電泳圖譜見圖7，電泳結(jié)果表明:(1)兩種不同鹽濃度的上樣緩沖液純化樣品，上樣緩沖液I上樣，流穿較少，大量的色素吸附，上樣后進行洗脫，目的洗脫峰有些許乳光現(xiàn)象，紫外吸收掃描圖譜260 / 230、260 / 280均低于上樣緩沖液2的相應結(jié)果；(2)上樣緩沖液2含0.5M鹽離子，減少了色素的吸附，基本流穿，對介質(zhì)有益，且其檢測指標也優(yōu)于上樣緩沖液I。因此，上樣緩沖液選擇含0.5M鹽離子的緩沖液比較合適。
[0143]表2純化產(chǎn)物檢測
[0144]
【權(quán)利要求】
1.一種制備卡介菌CpG-DNA的方法,其包括:利用Q Sepharose HP離子交換柱從卡介菌裂解液分離卡介菌CpG-DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的離子交換柱分離可以在TE緩沖體系或磷酸鈉緩沖體系中進行。
3.如權(quán)利要求2所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的離子交換柱分離在磷酸鈉緩沖體系中進行。
4.如權(quán)利要求3所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的離子交換柱分離在磷酸鈉緩沖體系中進行時，洗脫緩沖液為IM氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，PH7.5-8.5 ;優(yōu)選洗脫緩沖液為IM氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5 ;任選上樣時使用如下的上樣緩沖液:0-0.5M氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5-8.5，優(yōu)選上樣緩沖液為0.5M氯化鈉+50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5。
5.如權(quán)利要求4所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中上樣后的洗脫采用梯度洗脫，梯度洗脫的方法為50% -65%所述洗脫緩沖液洗脫，繼續(xù)100%所述洗脫緩沖液洗脫。
6.如權(quán)利要求2所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的離子交換柱分離在TE緩沖體系中進行。
7.如權(quán)利要求6所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的離子交換柱分離在TE緩沖體系中進行時，洗脫緩沖液為IM NaCl+50mM Tris+lmM EDTApH7.5-8.5 ;優(yōu)選洗脫緩沖液為IM NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5 ;任選上樣時使用如下的上樣緩沖液: 0-0.5MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5_8.5，優(yōu)選上樣緩沖液為0.5MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5。
8.如權(quán)利要求7所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中上樣后的洗脫采用梯度洗脫，梯度洗脫的方法為25-65%所述洗脫緩沖液洗脫，繼續(xù)100%所述洗脫緩沖液洗脫。
9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的制備卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌裂解液在QSepharose HP離子交換柱分離純化前進一步進行了澄清化處理，優(yōu)選所述的卡介菌裂解液澄清化處理方法是將破碎的菌體裂解液稀釋到200mg / ml的濃度，高速冷凍離心機4°C、8000-12000rpm / min離心，10_20minX 2次,收集上清,和/或經(jīng)1.0-1.2 μ m的濾器過濾。
【文檔編號】C12N15/10GK103642794SQ201310586057
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】王國治, 趙愛華, 寇麗杰 申請人:中國食品藥品檢定研究院