專利名稱：木聚糖酶SlxB及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木聚糖酶SlxB及其編碼基因。
背景技術(shù)：
木聚糖(Xylan)是一類分子結(jié)構(gòu)變化范圍很大的多糖，從僅由β _1，4糖苷鍵連接的多聚木糖線性分子到高度分支的異聚多糖。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，約占植物總糖的三分之一，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的再生生物資源。木聚糖酶(E.C
3.2.1.8)是一類以內(nèi)切方式降解木聚糖分子中β_1，4-木糖苷鍵的酶系。近年來，木聚糖酶在食品、紡織、飼料、能源工業(yè)中都顯示了廣闊的應(yīng)用前景。特別是在制漿造紙工業(yè)中該酶用于紙漿漂白，能夠增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂白用化學(xué)物質(zhì)的用量，從而有效減輕造紙業(yè)對環(huán)境的污染。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的氨基酸組成和疏水簇序列分析，可將其歸為F/10和G/11兩大家族。相比于F/10家族木聚糖酶，G/11家族木聚糖酶具有分子量較小，易于穿透纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及不含纖維素酶活性的特點，從而更適合應(yīng)用于紙漿漂白工藝中。熱穩(wěn)定性是木聚糖酶工業(yè)生產(chǎn)、儲藏、運輸以及應(yīng)用過程中追求的又一重要特性。因此，獲得熱穩(wěn)定性的木聚糖酶對于木聚糖酶的應(yīng)用具有重要的實踐價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 一個目的是提供一種熱穩(wěn)定性高的木聚糖酶(蛋白質(zhì))及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)的編碼基因，為任何編碼上述蛋白的DNA，具體為核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白質(zhì)在作為木聚糖酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實驗證明，本發(fā)明的木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基礎(chǔ)上，其半衰期顯著延長，Tm值顯著增高，最適溫度也顯著提高。因此，本發(fā)明的木聚糖酶在木聚糖應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1為SlxB與其突變體S1XB-M2熱穩(wěn)定性比較。(A)SlxB與SlxB_M2在65°C熱穩(wěn)定性比較；⑶SlxB與SlxB-M2Tm值比較。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。淺青紫鏈霉菌Strptomyces lividans CGMCC N0.4.1309購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；pET-28a(+)購自 Novagen，產(chǎn)品目錄號為 69865-3 ；實施例1、木聚糖酶SlxB及其熱穩(wěn)定性的提高淺青紫鏈霉菌S.1ividans產(chǎn)生的木聚糖酶SlxB中四個氨基酸相應(yīng)地突變?yōu)閅l I，H12，D13，Y15和F16，產(chǎn)生突變體SlxB_M2，并將其熱穩(wěn)定性與其相應(yīng)的野生型木聚糖酶進(jìn)行比較。一、木聚糖酶SlxB的制備及穩(wěn)定性檢測

實驗組:1、PCR擴(kuò)增木聚糖酶SlxB的編碼基因以淺青紫鏈霉菌S.lividans(CGMCC 4.1309)的基因組DNA為模板，用引物SlxB-PU SlxB-P2 (表I)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、酶切、連接用Nde I和EcoRI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)先使用Nde I和EcoRI雙酶切的pET-28a(+)進(jìn)行連接，得到重組載體；3、轉(zhuǎn)化、篩選以及測序驗證用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取單菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序驗證.結(jié)果獲得的序列(即SlxB編碼基因)如序列表中序列I所示；該序列編碼序列2所示蛋白(即SlxB蛋白)。證明構(gòu)建的質(zhì)粒及重組菌正確。將陽性克隆記作BL21-pET-SlxB，陽性質(zhì)粒記作pET-SlxB。4、酶的表達(dá):挑取BL2-pET_SlxB單菌落接入含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，于37°C過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物接種于IL含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基，37°C劇烈振蕩(200rpm)培養(yǎng)，至發(fā)酵液的0D_值達(dá)到0.6-0.8左右，再向發(fā)酵體系中加入IPTG (終濃度
0.5mM)，30°C條件下再培養(yǎng)6_8小時。發(fā)酵完畢后，5000rpm離心15分鐘，收集菌體；用pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后12，OOOrpm離心15min。收集上清液，即為含有目的蛋白的粗酶液。5、酶的純化:采用鎳柱親和層析進(jìn)行純化，在Amersham公司的AKTA FPLC系統(tǒng)中用Iml裝量的HiTrap chelating HP column(鎳柱)純化上清。非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I用于平衡純化柱體和上樣。蛋白上樣量為10ml，流速設(shè)為lml/min。用20%非變性鎳柱洗脫緩沖液(即非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為80: 20)進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。用80%非變性鎳柱洗脫緩沖液(即非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為20: 80)進(jìn)行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度。
非變性鎳柱結(jié)合緩沖液1:0.02M磷酸鹽緩沖液，0.5M氯化鈉，pH7.4 ；非變性鎳柱洗脫緩沖液I1:0.02M磷酸鹽緩沖液，0.5M氯化鈉，0.5M咪唑，pH7.4。6、目的酶液的酶活檢測:方法與實施例1中實驗一中所述相同。木聚糖酶酶活的測定:木聚糖酶酶活的測定采用DNS法。取40 μ I適當(dāng)稀釋的酶液，加入 360 μ I 1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液，50°C溫育 10η η』Λ 600μ IDNS溶液后，99°C溫育15min，冷卻到室溫后540nm處測定吸光值。酶活定義:每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生I μ mo I木糖的酶量定義為一個酶活單位。1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液的組成:Ig 木聚糖溶于 10OmT, 20mM 朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0)中。
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DNS溶液的組成:50g 3，5_ 二硝基水楊酸溶于4L水中，不斷攪拌，緩緩加入80gNa0H,使之完全溶解，繼續(xù)攪拌，將1500g酒石酸鉀鈉分?jǐn)?shù)次加入，并小心加熱，溶液最高溫度不超高45°C。冷卻至室溫后定容至5L。如果溶液不澄清，用Whatman I號濾紙過濾，然后棕色瓶室溫貯藏。制作DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線，將酶液測定結(jié)果與DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到酶液中酶活量。對照組:同時將空載體pET_28a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選驗證，得到含有空載體pET-28a(+)的陽性克隆，記作BL21-pET-28a(+)，作為對照菌。按照上述步驟將對照菌進(jìn)行酶的表達(dá)和純化，對純化得到的液體進(jìn)行酶活檢測。實驗設(shè)3次重復(fù)，實驗組檢測均具有木聚糖酶活性，而對照組均未檢測到木聚糖酶酶活。( 二)酶熱穩(wěn)定性的檢測:取在特定溫度下處理不同時間的木聚糖酶酶液進(jìn)行剩余酶活的測定。根據(jù)剩余酶活曲線計算其半衰期(t1/2)。剩余酶活) = P/PmaX*100%。其中P為木聚糖酶在70°C或80°C條件下分別處理不同時間，取樣后迅速置于冰上，在50°C，pH 6.0條件下測定的酶活。Pmax為木聚糖酶未進(jìn)行熱處理在50°C，pH 6.0條件下測定的酶活。半衰期(t1/2)的定義:酶失活至原來活性一半時所需時間。實驗設(shè)3次重復(fù)。(三)Tm值測定:差示掃描量熱儀[Nano DSC (TA instruments)]測定木聚糖酶Tm值。酶蛋白的變性溫度(Tm值)定義:是在連續(xù)升溫的過程中，50%蛋白發(fā)生變性時所對應(yīng)的溫度。DSC測定的升降溫速率為1°C/min,木聚糖酶蛋白濃度為1.0mg/mL。為防止在升溫過程中樣品的蒸發(fā)，所有的DSC實驗均維持3atm的壓力。實驗數(shù)據(jù)用Nano DSC自帶的DSCRun軟件進(jìn)行分析處理。蛋白質(zhì)DSC曲線的吸熱峰所指征的溫度即為該蛋白的Tm值。實驗設(shè)3次重復(fù)。(四)最適溫度比較木聚糖酶在不同溫度下的酶活，測定其最適溫度。最適溫度的測定是在20mM檸檬酸緩沖液(PH6.0)中于不同溫度下(30-90°C )進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定木聚糖酶酶活。實驗設(shè)3次重復(fù)。二、木聚糖酶SlxB的突變體(SlxB_M2)的制備及穩(wěn)定性檢測
(一 )木聚糖酶突變體(SlxB_M2)的制備實驗組:1、重疊延伸PCR擴(kuò)增SlxB_M2基因(I)以pET-SlxB質(zhì)粒為模板，以Pl和SlxB_P2為引物擴(kuò)增SlxB_M2基因上游片段，以P2和SlxB-Pl為引物擴(kuò)增SlxB-M2基因下游片段。(2)膠回收步驟(I)中擴(kuò)增的上下游片段，并以回收的上下游片段為模板，以Pl和P2為引物，PCR擴(kuò)增得到SlxB-M2全長基因片段。2、酶切、連接用NdeI和EcoRI雙酶切重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)先使用NdeI和EcoRI雙酶切的pET-28a(+)進(jìn)行連接，得到重組載體；3、轉(zhuǎn)化、篩選以及測序驗證用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取單菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序驗證，結(jié)果獲得序列表中序列3所示基因(編碼序列4所示蛋白)，表明得到插入基因序列正確的陽性克??；將陽性克隆記作BL21-pET-SlxB-M2，將陽性質(zhì)粒記作pET-SlxB_M2。序列4所示蛋白(即SlxB木聚糖酶5個氨基酸共同突變體)與序列2所示蛋白(即SlxB木聚糖酶)相比，存在以下差別:序列4自N端起第11位氨基酸突變成Y、自N端起第12位氨基酸突變成H，自N 端起第13位氨基酸突變成D，自N端起第16位氨基酸突變成F。序列3所示基因也可按照其他的常規(guī)方法制備得到，如人工合成。4、酶的表達(dá):方法與實驗一中所述相同。5、酶的純化:方法與實驗一中所述相同。6、目的酶液的酶活檢測:方法與實驗一中所述相同。對照組:同時將空載體pET_28a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選驗證，得到含有空載體pET-28a(+)的陽性克隆，記作BL21-pET-28a(+)，作為對照菌。按照上述步驟將對照菌進(jìn)行酶的表達(dá)和純化，對純化得到的液體進(jìn)行酶活檢測。實驗設(shè)3次重復(fù)，實驗組檢測均具有木聚糖酶活性，而對照組均未檢測到木聚糖酶酶活。(二)酶熱穩(wěn)定性的檢測方法與實驗一中所述相同。實驗設(shè)3次重復(fù)。(三)Tm值測定方法與實驗一中所述相同。實驗設(shè)3次重復(fù)。(四)最適溫度:方法與實驗一中所述相同。實驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明SlxB-M2的熱穩(wěn)定性得到的明顯的提高。木聚糖酶SlxB在引入這四個氨基酸殘基的突變后，在65°C的半衰期由原來的2.1min提高到73.6min (圖1A和表2)。Tm值也由原來的61.5°C提高到75.7V (圖1B和表2)。表I用于克隆木聚糖酶及其突變基因的引物
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒。
5.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在作為木聚糖酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木聚糖酶SlxB及其編碼基因。該木聚糖酶SlxB為氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基礎(chǔ)上，其半衰期顯著延長，Tm值顯著增高，最適溫度也顯著提高。因此，本發(fā)明的木聚糖酶在木聚糖應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N7/01GK103184205SQ20111045132
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者張山, 董志揚(yáng) 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所