專利名稱：一種酵母菌菌株及用它制備噬菌蛭弧菌制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種酵母菌菌株，同時(shí)本發(fā)明還涉及了用該酵母菌菌株制備噬菌蛭 弧菌制劑的方法。
背景技術(shù)：
噬菌蛭弧菌是美國(guó)科學(xué)家Stolp和PetZlodl962年發(fā)現(xiàn)的一種小型寄生性革蘭氏 陰性細(xì)菌。它具有獨(dú)特的生活周期，一是在宿主細(xì)胞外的自由游動(dòng)階段，另一是在宿主細(xì)胞 內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖階段。噬菌蛭弧菌這種奇特的生活方式，引起了人們的廣泛興趣。1963年被 命名為噬菌蛭弧菌。噬菌蛭弧菌是專門以捕食細(xì)菌為生的寄生性細(xì)菌，它比普通的細(xì)菌小，有類似噬 菌體的作用，但它不是病毒，它具有細(xì)菌的一切形態(tài)特征。噬菌蛭弧菌是自然界的自凈因子 之一，它不易于寄生于有益菌中，但易于寄生于致病菌中，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水體中的許多革 蘭氏陰性菌像嗜水氣單胞菌、弧菌、鰻壺菌等都是水產(chǎn)動(dòng)物的病源菌。近10多年來(lái)在噬菌蛭弧菌的應(yīng)用開發(fā)方面，國(guó)內(nèi)開展了許多研究。1994年農(nóng)業(yè)部 文件，將噬菌蛭弧菌列入飼料藥物添加劑允許使用的微生物有益菌類中。1995年上海大學(xué) 生物醫(yī)藥中心邵桂元等人以鯽魚出血性腹水病病原菌點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌為宿主菌，從自然界 分離到6株噬菌蛭弧菌均對(duì)此病菌有溶菌性。并在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)病原菌的自然凈化作用方 面進(jìn)行了研究，為利用噬菌蛭弧菌控制魚塘細(xì)菌性病害的發(fā)生，開展生物防治新技術(shù)提供 了依據(jù)和途徑。1997年廈門大學(xué)生物系楊淑專等人在廈門沿海分離到噬菌蛭弧菌。噬菌 蛭弧菌的數(shù)量與海水中弧菌類的數(shù)量成正相關(guān)。滅菌海水中只加入噬菌蛭弧菌，其數(shù)量出 現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，若同時(shí)加入鰻弧菌8927菌株，則噬菌蛭弧菌數(shù)量增加并導(dǎo)致宿主菌數(shù)減少。以 后他們又用噬菌蛭弧菌對(duì)25株對(duì)蝦病原菌和大腸桿菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄 球菌采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行噬菌試驗(yàn)，結(jié)果表明不同噬菌蛭弧菌菌株的寄生范圍不同， 但所有供試宿主菌都能被某些噬菌蛭弧菌寄生，形成清晰的噬斑。他們的實(shí)驗(yàn)為利用噬菌 蛭弧菌進(jìn)行海產(chǎn)品養(yǎng)殖生物防治細(xì)菌感染提供了佐證。2002年趙明森的研究表明噬菌蛭 弧菌在蝦蟹病害防治中跨以防止或減少蝦蟹病害的發(fā)生和蔓延，對(duì)引起蝦蟹致病的病原菌 清除率相當(dāng)高，嗜水氣單胞菌清除率為97.2%，點(diǎn)狀單胞菌清除率為95.8%，弧菌清除率 為93%，大腸桿菌清除率為91. 8%，沙門氏菌清除率為97. 3%，并且噬菌蛭弧菌能改善蝦 蟹體內(nèi)外的環(huán)境，促進(jìn)蝦蟹健康生長(zhǎng)，增強(qiáng)蝦蟹集體的免疫能力。2004年曾地剛等研究表明 在魚塘水中加入噬菌蛭弧菌能有效地減少池塘水中的細(xì)菌總數(shù)?？梢姡S著國(guó)內(nèi)外對(duì)噬菌蛭弧菌研究工作的不斷深入，隨著噬菌蛭弧菌產(chǎn)品的不 斷推廣應(yīng)用，在改變?nèi)藗儗?duì)抗生素的依賴、減少抗生素、化學(xué)消毒劑等的殘留等方面將起到 越來(lái)越大的作用。目前國(guó)內(nèi)外絕大部分的噬菌蛭弧菌產(chǎn)品都是采用大腸桿菌為宿主菌，將大腸桿菌 滅活后作為噬菌蛭弧菌的宿主這種生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，這種工藝存在幾大問(wèn)題1、大多數(shù)大腸桿菌為有害細(xì)菌，不小心就會(huì)造成污染，風(fēng)險(xiǎn)較大，雖然也有一些工程菌株如大腸桿菌的C600菌株為非致病性菌，但也不屬于有益菌，不能作為益生菌直接利 用；2、需要將培養(yǎng)好的大腸桿菌進(jìn)行離心濃縮，取出菌體后滅活，這樣產(chǎn)生了大量的 離心廢水，滅活工藝又需要很大的能源消耗；3、終端的噬菌蛭弧菌產(chǎn)品為單一的噬菌蛭弧菌產(chǎn)品，其功能作用十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種酵母菌菌株，該菌株可作為噬菌蛭弧菌的宿
主。 本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種用上述酵母菌菌株制備噬菌蛭弧菌制劑的方法。該 制備方法簡(jiǎn)化了噬菌蛭弧菌的生產(chǎn)工藝，減少污水排放和能源消耗。本發(fā)明的第一個(gè)目的提供的酵母菌的新菌株XD03S，它具有作為噬菌蛭弧菌寄生 宿主的能力。該酵母菌的新菌株XD03S已經(jīng)于2010年1月29日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏，并收到保藏登記號(hào)CCTCC NO =M 2010036。本發(fā)明第二個(gè)目的通過(guò)以下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種用上述酵母菌菌株制備噬菌蛭 弧菌制劑的方法，其包括以下步驟(1)蛭弧菌的純化以大腸桿菌為靶細(xì)胞，采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié) 合的方法分離從自然界中分離噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培 養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行至少10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，得到噬菌能 力強(qiáng)的噬菌蛭弧菌純系菌株；(2)將步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO: M2010036)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到噬菌蛭弧菌制劑。本發(fā)明所述的步驟(2)中的復(fù)合培養(yǎng)中優(yōu)選使用的培養(yǎng)基采用糖蜜5 20克、 蛋清粉2 5克、水1000毫升，PH條件為3. 3-7. 8。本發(fā)明所述的步驟(2)中的復(fù)合培養(yǎng)的溫度23 36°C。本發(fā)明所述的步驟(2)中噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí) 間優(yōu)選1 5天。僅用噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S進(jìn)行培養(yǎng)得到的噬菌蛭弧菌制劑 的功能較為單一，因此發(fā)明人篩選出能與酵母菌菌株XD03S共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢 桿菌，建立用上述酵母菌菌株制備噬菌蛭弧菌制劑的同位培養(yǎng)方法，旨在得到功能較為全 面的噬菌蛭弧菌制劑。所述的方法具體如下(1)蛭弧菌的純化以大腸桿菌為靶細(xì)胞，采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié) 合的方法分離從自然界中分離噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培 養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行至少10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，得到噬菌能 力強(qiáng)的噬菌蛭弧菌純系菌株；(2)以酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)分別與乳酸菌、酵母菌和芽孢桿 菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，篩選出能與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)共生的乳酸菌、酵 母菌和芽孢桿菌；(3)將步驟(2)中所得的能與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌以及酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)先進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)， 然后再接種步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)得到噬菌蛭弧菌制劑。本發(fā)明所述的步驟(2)和步驟(3)中的復(fù)合培養(yǎng)中 優(yōu)選使用的培養(yǎng)基采用糖蜜 5 20克、蛋清粉2 5克、水1000毫升，PH條件為3. 3-7. 8。本發(fā)明所述的步驟(2)和步驟(3)中的復(fù)合培養(yǎng)的溫度23 36°C。本發(fā)明所述的步驟(3)中能與酵母菌XD03S(CCTCC NO =M 2010036)共生的乳酸 菌、酵母菌和芽孢桿菌以及酵母菌XD03S(CCTCC NO =M 2010036)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選 1 4天。本發(fā)明所述的步驟(3)中接種步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株后繼續(xù)進(jìn)行 培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選1 5天。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明提供的酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)是非致病性細(xì)菌，而且 是一種益生菌，但是具有作為噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力。采用該酵母菌菌株制備噬菌蛭 弧菌制劑，可以不需要進(jìn)行離心、滅活等工序，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，且保障了生產(chǎn)安全。2、本發(fā)明采用具有作為噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力的酵母菌菌株 XD03S(CCTCCN0 =M 2010036)作為噬菌蛭弧菌的宿主進(jìn)行制備噬菌蛭弧菌制劑，無(wú)需進(jìn)行 離心、滅活等生產(chǎn)工序，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，提高了生產(chǎn)效率，而且減少污水排放及能源消耗。3、本發(fā)明通過(guò)共生培養(yǎng)，篩選出可以與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036) 共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036) 一起培養(yǎng) 一段時(shí)間后，加入噬菌蛭弧菌一起培養(yǎng)，最終得到的復(fù)合型噬菌蛭弧菌制劑，該產(chǎn)品中不僅 具有噬菌蛭弧菌，同時(shí)還有益生菌與其共生，能夠同時(shí)發(fā)揮噬菌蛭弧菌對(duì)致病菌的吞噬作 用和益生菌的調(diào)節(jié)作用。增加和增強(qiáng)了了噬菌蛭弧菌制劑的功能，將大大促進(jìn)和加速其推 廣應(yīng)用?？梢灶A(yù)計(jì)，在今后把噬菌蛭弧菌作為一種“活的抗生素”運(yùn)用于農(nóng)業(yè)以及醫(yī)學(xué)方面 將是國(guó)外研究及應(yīng)用的主要方向，因此本品的開發(fā)成功具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。本發(fā)明的復(fù)合型噬菌蛭弧菌制劑產(chǎn)品已經(jīng)在廣東省、海南省、福建省等地進(jìn)行了 大面積的中試推廣，例如珠海市對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)化研究院有限公司，深圳市綠寶地生物科技有限 公司，古勞鎮(zhèn)呂源根養(yǎng)殖場(chǎng)，新珠魚蝦藥店，中山市板芙恒達(dá)魚藥店，還有海南省文昌李燦 雄漁藥店、福建漳州市李長(zhǎng)生漁藥店等經(jīng)過(guò)一年的中試結(jié)果證明，該產(chǎn)品提高了魚、蝦等水 產(chǎn)的成活率，深受養(yǎng)殖戶的歡迎，對(duì)提高他們的養(yǎng)殖成功率起到了關(guān)鍵性的作用。本發(fā)明的酵母菌菌株XDS03已經(jīng)于于2010年1月29日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏，并收到保藏登記號(hào)CCTCC NO =M 2010036。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(1)原料的準(zhǔn)備1)水樣的采集收集養(yǎng)殖塘中取水樣，底泥，封存準(zhǔn)備作為噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株的分離試驗(yàn)的菌 源。2)宿主菌的制備
從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購(gòu)買大腸桿菌C600作為前期宿主菌，把 C600分別制成C600菌懸液，3500r/min離心成菌泥，并把菌泥制成1010cfu/ml菌懸液，一 部分不滅菌即活菌泥C600，一部分滅菌即滅活菌泥C600，處理完后放入4度冰箱保存待用。(2)蛭弧菌的分離 采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行分離1)取300ml C600的菌懸液、300ml活菌泥C600和300ml滅活菌泥C600分別裝在 不同的三角瓶中。把所得的水樣一部分在3000r/min離心15min，取上清液分別加入到三 角瓶中的C600的菌懸液、活菌泥C600和滅活菌泥C600中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶加入20ml上清 液，重復(fù)三次，在28-32°C的溫度下靜置培養(yǎng)4-6天，再把培養(yǎng)好的菌液在3000r/min下離心 15min，取上清液用雙層自來(lái)水瓊脂法做菌斑分離實(shí)驗(yàn)；2)取300ml C600的菌懸液、300ml活菌泥C600和300ml滅活菌泥C600分別裝在 不同的三角瓶中。把所得的水樣分別加入到三角瓶中的的C600的菌懸液、活菌泥C600和 滅活后的C600中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶加入20ml上清液，重復(fù)三次。在28-32°C的溫度下靜止培 養(yǎng)4-6天。再把培養(yǎng)好的菌液在3000r/min下離心15min，取上清液用雙層自來(lái)水瓊脂法做 菌斑分離實(shí)驗(yàn)；3)雙層自來(lái)水瓊脂法下層用滅菌的1. 7%自來(lái)水瓊脂倒入直徑18cm滅菌的培養(yǎng) 皿中，50ml/皿，凝固后放入45度左右的恒溫箱中保溫3h左右，上層把滅菌的0. 8%自來(lái)水 瓊脂粉培養(yǎng)基分裝到比色管，7ml/管，再加入滅活后的C600的菌泥0. 8ml，放在45度左右 的水浴鍋中保溫，最后將在3000r/min離心15min的水樣上清液0. 5ml加入到40度左右的 比色管中搖勻后迅速倒入準(zhǔn)備好的底層培養(yǎng)基上，使其均勻分布在上面，凝固后放入28度 左右的恒溫箱倒置培養(yǎng)4-6天，連續(xù)觀察；(3)蛭弧菌的純化利用大腸桿菌C600為宿主，采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊 脂相結(jié)合的方法進(jìn)行反復(fù)純化得到噬菌蛭弧菌的基礎(chǔ)菌株，由于菌種不純，培養(yǎng)出來(lái)的噬 菌斑不純，菌斑小，不清晰，因此需要對(duì)野生菌株進(jìn)行純化選育。利用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行 液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)10代連續(xù)的單個(gè)菌斑傳代，選育 出形成噬菌斑大，菌斑清晰，菌斑形成時(shí)間短的蛭弧菌菌株XD03。(4)非大腸桿菌宿主的篩選利用XD03分別以3株乳酸菌，3株酵母菌，8株芽孢桿菌為宿主，利用單個(gè)菌斑傳 代法進(jìn)行液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行馴化培養(yǎng)，篩選出能夠形成菌斑的 宿主，每次挑起噬菌斑大，菌斑清晰，形成菌斑時(shí)間短的菌斑進(jìn)行下一次篩選實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)12 代連續(xù)的單個(gè)菌斑傳代，篩選出一株酵母菌，能夠達(dá)到形成噬菌斑大，菌斑清晰，菌斑形成 時(shí)間短的目標(biāo)，我們將這株酵母菌命名為XD03S(CCTCC NO =M 2010036)。(5)復(fù)合宿主的篩選取3株酵母菌XD03S (CCTCC NO =M 2010036)分別與3株乳酸菌，2株酵母菌，8株 芽孢桿菌益生菌的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選能與XD03S共生的菌株，最后篩選出能與XD03S共生 的1株乳酸菌、1株酵母菌、1株芽孢桿菌，將這三株菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到復(fù)合宿主菌，上述 復(fù)合培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23°C，PH條件為3. 3，培養(yǎng)基為糖蜜5克、蛋清粉2克、水1000毫升。
(6)噬菌蛭弧菌制劑的培養(yǎng)本步驟采用培養(yǎng)基為糖蜜5克、蛋清粉2克、水1000毫升，PH條件為3. 3。以1 株酵母菌XD03S(CCTCC NO :M 2010036)與步驟(5)中得到可與酵母菌XD03S (CCTCCNO :M 2010036)共生的1株乳酸菌、1株酵母菌和1株芽孢桿菌作為復(fù)合宿主菌接種至培養(yǎng)基中， 先在23°C溫度下，PH條件為3. 3的條件下進(jìn)行培養(yǎng)1天，然后再接種步驟(3)中得到的噬 菌蛭弧菌XD03菌種，然后在23°C溫度下，PH條件為3. 3的條件下進(jìn)行培養(yǎng)1天，得到噬菌 蛭弧菌制劑。實(shí)施例二 與實(shí)施例一不同的是 (5)復(fù)合宿主的篩選取株酵母菌XD03S CCTCC NO =M 2010036)與3株乳酸菌，2株酵母菌，8株芽孢桿 菌益生菌的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選能與XD03S共生的菌株，最后篩選出能與XD03S共生的1株 乳酸菌、1株酵母菌、1株芽孢桿菌，將這三株菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到復(fù)合宿主菌，上述復(fù)合培 養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為36°C，PH條件為7. 8，培養(yǎng)基為糖蜜20克、蛋清粉5克、水1000毫升。(6)噬菌蛭弧菌制劑的培養(yǎng)本步驟采用培養(yǎng)基為糖蜜20克、蛋清粉5克、水1000毫升，PH條件為7. 8。以 1株酵母菌XD03S (CCTCC NO :M 2010036)與步驟(5)中得到可與酵母菌XD03S (CCTCCNO :M 2010036)共生的1株乳酸菌、1株酵母菌和1株芽孢桿菌作為復(fù)合宿主菌接種至培養(yǎng)基中， 先在36°C溫度下，PH條件為7. 8的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4天，然后再接種步驟(3)中得到的噬 菌蛭弧菌XD03菌種，然后在36°C溫度下，PH條件為7. 8的條件下進(jìn)行培養(yǎng)5天，得到噬菌 蛭弧菌制劑。實(shí)施例三與實(shí)施例一不同的是(5)復(fù)合宿主的篩選取株酵母菌XD03S (CCTCC NO =M 2010036)與3株乳酸菌，2株酵母菌，8株芽孢桿 菌益生菌的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選能與XD03S共生的菌株，最后篩選出能與XD03S共生的1株 乳酸菌、1株酵母菌、1株芽孢桿菌，將這三株菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到復(fù)合宿主菌，上述復(fù)合培 養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為30°C，PH條件為5. 5，培養(yǎng)基為糖蜜15克、蛋清粉3. 5克、水1000毫升。(6)噬菌蛭弧菌制劑的培養(yǎng)本步驟采用培養(yǎng)基為糖蜜15克、蛋清粉3. 5克、水1000毫升，PH條件為5. 5。以 1株酵母菌XD03S (CCTCC NO :M 2010036)與步驟(5)中得到可與酵母菌XD03S (CCTCC NO: M 2010036)共生的1株乳酸菌、1株酵母菌和1株芽孢桿菌作為復(fù)合宿主菌接種至培養(yǎng)基 中，先在30°C溫度下，PH條件為5. 5的條件下進(jìn)行培養(yǎng)3天，然后再接種步驟(3)中得到的 噬菌蛭弧菌XD03菌種，然后在30°C溫度下，PH條件為5. 5的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4天，得到噬 菌蛭弧菌制劑。實(shí)施例四與實(shí)施例一不同的是(5)復(fù)合宿主的篩選取株酵母菌XD03S (CCTCC NO =M 2010036)與3株乳酸菌，2株酵母菌，8株芽孢桿菌益生菌的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選能與XD03S共生的菌株，最后篩選出能與XD03S共生的1株 乳酸菌、1株酵母菌、1株芽孢桿菌，將這三株菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到復(fù)合宿主菌，上述復(fù)合培 養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26°C，PH條件為4. 0，培養(yǎng)基為糖蜜10克、蛋清粉4克、水1000毫升。(6)噬菌蛭弧菌制劑的培養(yǎng)本步驟采用培養(yǎng)基為糖蜜10克、蛋清粉4克、水1000毫升，PH條件為4. 0。以 1株酵母菌XD03S (CCTCC NO :M 2010036)與步驟(5)中得到可與酵母菌XD03S (CCTCCNO :M 2010036)共生的1株乳酸菌、1株酵母菌和1株芽孢桿菌作為復(fù)合宿主菌接種至培養(yǎng)基中， 先在26°C溫度下，PH條件為4. 0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)2天，然后再接種步驟(3)中得到的噬 菌蛭弧菌XD03菌種，然后在26°C溫度下，PH條件為4. 0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)3天，得到噬菌 蛭弧菌制劑。

實(shí)施例五與實(shí)施例一 四不同的是本實(shí)施例不采用復(fù)合宿主菌，只采用酵母菌 XD03S(CCTCC NO :M 2010036)作為宿主菌。步驟(6)噬菌蛭弧菌制劑的培養(yǎng)本步驟采用培養(yǎng)基為糖蜜10克、蛋清粉4克、水1000毫升，PH條件為6. 0。以1 株酵母菌XD03S(CCTCC NO =M 2010036)接種至培養(yǎng)基中，先在28°C溫度下，PH條件為6. 0 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)3天，然后再接種步驟(3)中得到的噬菌蛭弧菌XD03菌種，然后在28°C 溫度下，PH條件為6. 0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)5天，得到噬菌蛭弧菌制劑。實(shí)施例六本發(fā)明提供的噬菌蛭弧菌制劑在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用試驗(yàn)應(yīng)用試驗(yàn)在珠三角進(jìn)行，分別在江門大鰲、臺(tái)山，中山板芙、橫欄和珠海白蕉的冬 棚蝦塘同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)地區(qū)選擇兩個(gè)養(yǎng)殖技術(shù)條件比較好、養(yǎng)殖水平基本一致的養(yǎng)殖 戶進(jìn)行試驗(yàn)，共在5個(gè)區(qū)域10個(gè)養(yǎng)殖戶30 口南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖塘中進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)養(yǎng)殖戶選 擇3 口面積為5畝左右的養(yǎng)殖塘，試驗(yàn)塘采用本發(fā)明提供的噬菌蛭弧菌制劑，用量是每公斤 產(chǎn)品用1畝水體(按一米水深計(jì)算)，用法是用本塘水稀釋后全塘均勻潑灑，每隔7天使用 一次。對(duì)照養(yǎng)殖塘一采用市面上普通的噬菌蛭弧菌(南京福潤(rùn)德公司生產(chǎn)的三聯(lián)噬菌王)， 用法用量同上；對(duì)照養(yǎng)殖塘二采用普通的生物制劑(江西天意公司生產(chǎn)的EM菌)，用法用 量同上。所有試驗(yàn)養(yǎng)殖塘和對(duì)照養(yǎng)殖塘種苗、放苗時(shí)間、使用的飼料及其他用藥情況基本一 致，三個(gè)月后各試驗(yàn)養(yǎng)殖塘的試驗(yàn)結(jié)果非常一致，10個(gè)養(yǎng)殖戶的試驗(yàn)養(yǎng)殖塘成活率平均超 過(guò)95 %，對(duì)照養(yǎng)殖塘一的成活率平均85 %，對(duì)照養(yǎng)殖塘二的成活率平均為50 %，整個(gè)養(yǎng)殖 過(guò)程各試驗(yàn)塘的發(fā)病率很低，養(yǎng)殖水質(zhì)一直保持穩(wěn)定，說(shuō)明本發(fā)明的噬菌蛭弧菌制劑在養(yǎng) 殖水體中應(yīng)用不僅對(duì)控制致病性細(xì)菌有較好的作用，對(duì)穩(wěn)定養(yǎng)殖水質(zhì)，調(diào)節(jié)樣子微生態(tài)環(huán) 境也有良好的作用。對(duì)照養(yǎng)殖塘一所采用的普通噬菌蛭弧菌對(duì)控制致病性細(xì)菌有較好的作 用，但是由于其中沒有有益菌的作用，沒有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、穩(wěn)定水質(zhì)的菌種，養(yǎng)殖過(guò)程中 水質(zhì)不夠穩(wěn)定，由水質(zhì)引起的死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。對(duì)照塘二采用的普通EM菌對(duì)有較強(qiáng)的調(diào) 節(jié)水質(zhì)的作用，但是對(duì)有害的致病性細(xì)菌無(wú)能為力，因此，養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌性疾病及其并發(fā) 的病毒性病害時(shí)有發(fā)生，養(yǎng)殖成功率總體較低。本發(fā)明以上實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，然而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局 限于以上實(shí)施例。所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員只需取酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌作為原 料，依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
權(quán)利要求
一種酵母菌的新菌株XD03S(CCTCC NOM 2010036)，其具有作為噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力。
2.一種用權(quán)利要求1所述的酵母菌菌株制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，其 包括以下步驟(1)蛭弧菌的純化以大腸桿菌為靶細(xì)胞，采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的 方法分離從自然界中分離噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培養(yǎng)和 雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行至少10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，得到噬菌能力強(qiáng) 的噬菌蛭弧菌純系菌株；(2)將步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S(CCTCCNO M2010036)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到噬菌蛭弧菌制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中 的復(fù)合培養(yǎng)中優(yōu)選使用的培養(yǎng)基采用糖蜜5 20克、蛋清粉2 5克、水1000毫升，PH 條件為3. 3-7.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中 的復(fù)合培養(yǎng)的溫度23 36°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中 噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間為1 5天。
6.一種用權(quán)利要求1所述的酵母菌菌株制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，其 包括以下步驟(1)蛭弧菌的純化以大腸桿菌為靶細(xì)胞，采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的 方法分離從自然界中分離噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培養(yǎng)和 雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行至少10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，得到噬菌能力強(qiáng) 的噬菌蛭弧菌純系菌株；(2)以酵母菌菌株XD03S(CCTCCNO =M 2010036)分別與乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌進(jìn) 行復(fù)合培養(yǎng)，篩選出能與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)共生的乳酸菌、酵母菌 和芽孢桿菌；(3)將步驟(2)中所得的能與酵母菌菌株XD03S(CCTCCNO =M 2010036)共生的乳酸菌、 酵母菌和芽孢桿菌以及酵母菌菌株XD03S(CCTCC NO =M 2010036)先進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，然后再 接種步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)得到噬菌蛭弧菌制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(2)和 步驟(3)中的復(fù)合培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基采用糖蜜5 20克、蛋清粉2 5克、水1000毫 升，PH條件為3. 3-7.8。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(2)和 步驟(3)中的復(fù)合培養(yǎng)的溫度23 36°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(3) 中能與酵母菌XD03S(CCTCC NO =M 2010036)共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌以及酵 母菌 XD03S (CCTCC NO :M 2010036)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)的時(shí)間為1 4天。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，所述的步驟(3) 中接種步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間為1 5天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母菌的新菌株XD03S(CCTCC NOM 2010036)，其具有作為噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力。本發(fā)明還公開了使用上述的酵母菌菌株制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其包括以下步驟(1)蛭弧菌的純化以大腸桿菌為靶細(xì)胞，采用液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法分離從自然界中分離噬菌蛭弧菌基礎(chǔ)菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代法進(jìn)行液體培養(yǎng)和雙層自來(lái)水瓊脂相結(jié)合的方法進(jìn)行至少10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，得到噬菌能力強(qiáng)的噬菌蛭弧菌純系菌株；(2)將步驟(1)中所得的噬菌蛭弧菌純系菌株與酵母菌菌株XD03S(CCTCC NOM 2010036)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)得到噬菌蛭弧菌制劑。該制備方法簡(jiǎn)化了噬菌蛭弧菌的生產(chǎn)工藝，減少污水排放和能源消耗。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101845403SQ20101016190
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日
發(fā)明者楊雄, 黃潔容 申請(qǐng)人:楊雄