噬菌體展示技術(shù)篩選的具有抗凝血活性的多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用噬菌體展示技術(shù)篩選的具有抗凝血活性的多肽，屬于抗凝血藥物 研發(fā)與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血是機體重要的生理防御過程，但病理性血栓嚴重危害著人類健康。血栓栓塞 癥已經(jīng)成為臨床上常見的致殘及致死的重要原因之一，它主要發(fā)生在心腦血管疾病患者、 手術(shù)后病人以及孕產(chǎn)婦當中。此外，現(xiàn)代臨床檢驗中，許多檢驗項目的血液標本需要抗凝來 檢測，而在體外血液很容易凝固。這就使得研究高效、穩(wěn)定、副作用小的抗凝血藥物或制劑 成為一個有巨大臨床應(yīng)用價值和前景的熱點。
[0003] 能夠阻止血液凝固的化學(xué)試劑或物質(zhì)，稱為抗凝劑或抗凝物質(zhì)。目前應(yīng)用在臨床 檢驗的抗凝劑主要有天然抗凝劑（如肝素）、Ca2+鰲合劑（檸檬酸鈉、氟化鉀、EDTA、草酸鹽 等），應(yīng)用于臨床治療的主要有肝素、水蛭素、丹參、阿司匹林以及華法林等。其中肝素是一 種酸性不對稱結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖，抗凝作用在體內(nèi)外均較強，在臨床上應(yīng)用比較廣泛，但用量 過大時會引起出血、血小板減少、骨質(zhì)疏松、耐藥性和過敏等副反應(yīng)。水蛭素及其衍生物比 伐盧定是肝素安全有效的替代藥，可用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥，且不易發(fā)生導(dǎo)管血栓。 水蛭素衍生物基因工程雙功能水蛭素（RGD-hirudin)已于2005年獲國家食品藥品監(jiān)督管 理局批準進入臨床研究，臨床適應(yīng)癥為血管吻合術(shù)后的抗凝、防栓治療，并可用于治療心絞 痛、深靜脈血栓等疾病。比伐盧定（Bivalirudin，Hirulog)地西盧定（desirudin)及來匹盧 定（1印irudin)是水蛭素的衍生肽。其中比伐盧定的效果較好，能通過用序列（D)-F-P-R-P 結(jié)合凝血酶抑制凝血。小分子類肽代替（D)-F-P-R-P合成價廉及給藥方便的抗凝血藥，目 前已取得很大進展，它們均為功能單一的凝血酶催化中心抑制劑或因子X a等抑制劑。丹 參和阿司匹林通過抑制血小板聚集達到抗凝血作用。華法林是目前應(yīng)用最廣泛的口服抗 凝藥之一，為雙香豆素衍生物，它通過與維生素K競爭羧化酶，阻礙凝血因子激活和阻滯抗 凝，從而達到抗凝作用。臨床用于預(yù)防或治療血管內(nèi)血栓形成及手術(shù)或受傷后引起的血栓 性靜脈炎等。
[0004] 除此以外，目前國內(nèi)外臨床使用的主要抗凝血藥物還存在能透過胎盤致畸、損害 肝腎等副作用。而多肽藥物由于其擁有小分子量，對天然蛋白酶酶解的穩(wěn)定性相對更好，更 易被人體吸收，而且其毒性小、副作用低、無蓄積性、分子認知性良好、構(gòu)效關(guān)系明顯、藥效 學(xué)顯著，已成為國際抗凝新藥研究的熱點，已進入臨床應(yīng)用及臨床研究的多肽主要有阿加 曲班（argatroban)、希美加群（ximelagatran)、達比加群（dabigatran)等，還有一系列類 肽化合物被合成。
[0005] 噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外 殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使 外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體 表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)，這樣使得大量隨機多肽與其DNA編碼 序列之間建立了直接聯(lián)系。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活 性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未 結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌 體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪~5輪的"吸附-洗脫-擴增" 后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。
[0006] 目前抗凝血多肽的篩選方法主要包括從生化分離技術(shù)、基于序列同源性的生物信 息學(xué)方法、在現(xiàn)有天然多肽上進行修飾合成等等，往往具有工作量大、效率低等缺點。隨著 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展，我們以特定的分子為靶標，以特定的分子洗脫特異性結(jié)合的噬菌 體，使所產(chǎn)生的多肽功能便有了可預(yù)測性和較強的目的性。由于肝素能夠和肝素結(jié)合表皮 生長因子HB-EGF高度特異性結(jié)合且具備確定的高度抗凝的作用，因此，HB-EGF被選擇作為 靶標，肝素鈉競爭性洗脫此類噬菌體，篩選得到類似于肝素抗凝血活性的多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種噬菌體展示技術(shù)篩選的 具有抗凝血活性的多肽。
[0008] 本發(fā)明首先成功將靶標HB-EGF的目的基因?qū)肓嗽吮磉_載體pET-30a，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，帶有載體上標簽的重組蛋白（His) 6-HB-EGF大量表達。
[0009] 經(jīng)兩步親和層析純化后，我們得到了較純的重組蛋白（His)6-HB-EGF,然后為了排 除噬菌體會結(jié)合標簽蛋白從而造成非特異性序列產(chǎn)生的可能性，我們利用重組蛋白上的腸 激酶酶切位點將其標簽酶解去掉，之后利用鎳柱親和層析去掉酶切后蛋白樣品中的標簽蛋 白，最終得到了 HB-EGF。
[0010] HB-EGF經(jīng)包被固定以后，使隨機十二肽噬菌體文庫中的噬菌體與之結(jié)合，以具有 抗凝血活性的肝素鈉為有效成分競爭性洗脫特異性結(jié)合靶分子的噬菌體，經(jīng)過3輪淘選， 富集得到具有高親和力的噬菌體。將淘選到的單克隆噬菌體擴增提取之后，對其進行測 序，并合成了出現(xiàn)頻率較高（73%，17%)的兩個多肽，多肽1(SEQ. ID. NO. 1)和多肽2 (SEQ. ID. NO. 2) 〇
[0011] 經(jīng)APTT、試管法、剪尾法對多肽進行體內(nèi)外抗凝血活性驗證，結(jié)果表明其中多肽2 具有顯著的抗凝血活性（P〈〇. 05或P〈0. 01)且呈劑量依賴性，而多肽1并沒有明顯的抗凝 活性（P>0. 05)。將體內(nèi)注入多肽的小鼠留作觀察一周，發(fā)現(xiàn)小鼠各項生理指標和行為基本 正常，且沒有發(fā)生死亡。
[0012] 本發(fā)明所提供的多肽序列如表1.所示：
[0013] 表1?多肽的序列.
[0014]
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到的多肽，在體內(nèi)和體外實驗均具有顯著的抗 凝血活性，并且，未觀察到小鼠的急性或慢性毒性作用。本發(fā)明中原料靶標HB-EGF和其配 體肝素鈉來源廣、成本低；而且在淘選多肽的后期，可以通過提取噬菌體很容易得到其所對 應(yīng)隨機多肽的信息；多肽序列較短，在體內(nèi)容易運輸，且易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，所以整個生 產(chǎn)過程耗時短、成本低、操作易行，同時又大大提高了藥物篩選的成功率，使得本發(fā)明具有 廣闊的臨床應(yīng)用價值和前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1.重組蛋白（His)6-HB-EGF的氨基酸序列；陰影部分為（His) 6標簽，加粗斜體 部分為腸激酶酶切位點，下劃線部分為目的蛋白HB-EGF。
[0018] 圖2.蛋白表達載體pET-3(W(His)6/HB-EGF的構(gòu)建驗證結(jié)果；其中A. 1%瓊脂糖 凝膠電泳驗證HB-EGF PCR擴增產(chǎn)物；B.重組質(zhì)粒pET-30aAHis)6/HB-EGF雙酶切驗證結(jié) 果。
[0019] 圖3.蛋白表達載體pET-30aAHis)6/HB_EGF的測序結(jié)果，其中GeneBankSeq表 示注冊的HB-EGF序列，InsertSeq表示實際插入載體的目的基因序列測序結(jié)果。
[0020] 圖 4. SDS-PAGE和 Western Blotting驗證重組蛋白（His)6-HB-EGF 的表達、純化及 酶切結(jié)果；其中A. 15% SDS-PAGE驗證蛋白誘導(dǎo)表達結(jié)果，其中M是蛋白標記，1是pET-30a 空載體表達的蛋白，2是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-3(W(His) 6/HB-EGF表達的蛋白，3-4是0. 8mM IPTG誘導(dǎo)的pET-30aAHis)6/HB-EGF表達的蛋白；B. Western Blotting驗證（His)6-HB-EGF 表達和腸激酶酶切結(jié)果，所用抗體為HB-EGF單克隆抗體，其中1是蛋白（His) 6-HB-EGF, 2是酶切之后的蛋白樣品HB-EGF ;C. 15% SDS-PAGE分析蛋白純化結(jié)果，1-4是連續(xù)收集的 蛋白洗脫樣品；D. Western Blotting檢測腸激酶酶切（His)6-HB-EGF蛋白結(jié)果，所用抗體 為（His)6單克隆抗體，其中1表示全長蛋白（His) 6-HB-EGF，2-3表示酶切之后的蛋白樣品 (His)6〇
[0021] 圖5.噬菌體展示流程圖，其中A.以HB-EGF為靶分子，使噬菌體隨機十二肽庫與 預(yù)先固定好的靶分子結(jié)合；B.洗掉未結(jié)合的噬菌體；C.用HB-EGF配體0. 5mM的肝素鈉溶液 洗脫特異性結(jié)合靶分子的噬菌體；D.將洗脫下來的噬菌體擴增后進行下一輪的篩選；E.按 照A、B、C、D進行3輪淘選，最終富集到與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體。
[0022] 圖6.噬菌體淘選序列分布結(jié)果圖；經(jīng)3輪淘選之后，對得到的噬菌體隨機多肽序 列進行測序，共得到5種序列，多肽1即序列1，其氨基酸序列為TNCVQTRSLCPP ;多肽2即序 列2,其氨基酸序列為AGAEVEALFNNK。
[0023] 圖7.多肽體內(nèi)外的抗凝血效果檢測圖，其中A.試管法檢測多肽1和多肽2體內(nèi) 抗凝血作用；B.剪尾法檢測多肽2體內(nèi)抗凝血作用；C. APTT檢測多肽2體外抗凝血作用。* 表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01，林*表示P〈0. 001，NS表示無統(tǒng)計學(xué)意義。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1. pET-3(W(His)6/HB-EGF蛋白表達載體的構(gòu)建
[0025] 從 GeneBank 里提取編碼 HB-EGF 的片段（aa63 - 149, GenBank 注冊號 NM_001945)， 設(shè)計 PCR 引物：Forward primer 5' -CGGGATCCGACTTGCAAGAGGCAGAT-3'(SEQ. ID. NO. 3)和 Reverse primer 5' -CCAAGCTTTCATGGGAGGCTCAGCCC-3' (SEQ. ID. NO. 4)，下劃線部分別為 酶切位點 BamHI 和 Hind III。PCR 產(chǎn)物和載體 pET-30a (Novagen，#69909-3)經(jīng) BamHI (NEW ENGLAND BioLabs，#R0136S)和 Hind III (NEW ENGLAND BioLabs，#R0104S)37°C酶切 3h 之 后，用T4DNA連接酶（NEW ENGLAND BioLabs，#M0202S)在16°C連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 進入DH5 a感受態(tài)細胞（全式金，⑶201)，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在卡那霉素抗性（50 y g/ml) LB平板上培養(yǎng)直至單菌落長出，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切驗證，將重組質(zhì)粒送華大基 因測序，得到質(zhì)粒 pET-3(W(His)6/HB-EGF。
[0026] 為大量獲得目的蛋白HB-EGF并利于后續(xù)的純化，本發(fā)明將HB-EGF基因插入表達 載體pET-30a中，蛋白大量表達后經(jīng)鎳柱親和層析和肝素親和層析純化，最后利用腸激酶 將（把8) 6標簽切掉，如圖1所示，為重組蛋白（His) 6-HB-EGF的氨基酸序列。圖2A顯示PCR 反應(yīng)后得到了目的基因；目的基因被連入載體pET-30a后進行雙酶切驗證，圖2B中顯示出 現(xiàn)兩個條帶，分別是pET-30a載體部分和目的基因HB-EGF部分；最后經(jīng)過測序驗證，圖3顯 示實際插入載體的目的基因序列與GeneBank中注冊的序列比對結(jié)果完全相同。
[0027] 實施例2. (His)6-HB-EGF的誘導(dǎo)表達、純化、酶切及驗證
[0028] (His)6-HB-EGF的誘導(dǎo)表達：將重組質(zhì)粒pET-3(W(His)6/HB-EGF轉(zhuǎn)化宿主菌 BL21 (DE3)(全式金，⑶601)，利用卡那霉素抗性LB平板篩選重組子，挑取單菌落于含卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6。。= 0. 5~0. 8。將培養(yǎng)物以體積比1:50的比例 接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C劇烈震蕩培養(yǎng)至0D6。。= 0. 5~0. 8,