具有改善的噬菌體抗性的培養(yǎng)物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有改善的噬菌體抗性的培養(yǎng)物
[0001] 本申請(qǐng)是發(fā)明人于2008年2月29日提交的題為"具有改善的噬菌體抗性的培養(yǎng) 物"的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200880014507. 5的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞針對(duì)靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用一個(gè)或多個(gè)cas基因或蛋白以調(diào)節(jié)細(xì)胞針對(duì)靶 核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在開(kāi)發(fā)和使 用菌株組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 了用于標(biāo)記和/或鑒定細(xì)菌的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR 基因座確定噬菌體對(duì)細(xì)胞的潛在毒力和使用CRISPR-cas調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒 力水平的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于開(kāi)發(fā)和使用噬菌體作為生物控 制劑的方法和組合物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 培養(yǎng)物并且尤其起子培養(yǎng)物廣泛地在食品工業(yè)中用于制造發(fā)酵產(chǎn)品，包括乳產(chǎn)品 (例如酸奶、酪乳和干酪）、肉產(chǎn)品、焙烘產(chǎn)品、酒和蔬菜產(chǎn)品。培養(yǎng)物的制備是耗費(fèi)工時(shí)的， 占用大量空間和設(shè)備，并且在增殖步驟期間存在腐敗細(xì)菌和/或噬菌體污染的相當(dāng)大的風(fēng) 險(xiǎn)。因細(xì)菌噬菌體（噬菌體）感染和增殖所致的細(xì)菌培養(yǎng)失敗是伴隨工業(yè)使用細(xì)菌培養(yǎng)物 的主要問(wèn)題。存在眾多不同種類(lèi)的噬菌體并且新毒株持續(xù)出現(xiàn)。另外，需要用于追蹤此類(lèi) 培養(yǎng)物中所用的細(xì)菌的方法和組合物。實(shí)際上，盡管培養(yǎng)物開(kāi)發(fā)取得進(jìn)展，還存在為工業(yè)用 途改善培養(yǎng)物的持續(xù)需要。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞針對(duì)靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用一個(gè)或多個(gè)cas基因或蛋白以調(diào)節(jié)細(xì)胞針對(duì)靶 核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在開(kāi)發(fā)和使 用菌株組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 了用于標(biāo)記和/或鑒定細(xì)菌的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR 基因座確定噬菌體對(duì)細(xì)胞的潛在毒力和使用CRISPR-cas調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒 力水平的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于開(kāi)發(fā)和使用噬菌體作為生物控 制劑的方法和組合物。
[0007] 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生至少一種噬菌體抗性變異菌株的方法，包括步驟：(a)使 包含CRISPR基因座的至少一部分的親代細(xì)菌菌株暴露于至少一種核酸序列以產(chǎn)生包含 至少一種噬菌體抗性變異菌株的細(xì)菌混合物，其中所述的噬菌體抗性變異菌株包含經(jīng)修 飾的CRISPR基因座；(b)從所述細(xì)菌混合物中選出噬菌體抗性變異菌株；（c)從步驟（b) 中選出的噬菌體抗性菌株中選擇在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的噬菌 體抗性變異菌株；和（d)分離至少一種噬菌體抗性變異菌株，其中所述菌株在經(jīng)修飾的 CRISPR基因座中包含額外的核酸片段。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括步驟：t匕 較親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座或其部分和噬菌體抗性變異菌株的經(jīng)修飾的CRISPR基 因座，以鑒定在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含從該親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座中缺 少的至少一個(gè)額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌株。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該 方法還包括選擇噬菌體抗性變異菌株的步驟，其中所述的噬菌體抗性變異菌株在經(jīng)修飾 的CRISPR基因座中包含額外的核酸片段。在一些實(shí)施方案中，使親代細(xì)菌菌株暴露于 兩種或多種核酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株同時(shí)暴露于兩種或多種 核酸序列，而在一些備選的實(shí)施方案中，使親代細(xì)菌菌株依次暴露于兩種或多種核酸序 列。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使親代細(xì)菌菌株通過(guò)由包含所述核酸序列的至少一 種噬菌體感染而暴露于該核酸序列。在一些其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一種噬菌體選 自由覆蓋噬菌體科（Corticoviridae)、囊狀噬菌體科（Cystoviridae)、絲桿狀噬菌體科 (Inoviridae)、光滑噬菌體科（Leviviridae)、微小噬菌體科（Microviridae)、肌尾噬菌體 科（Myoviridae)、短尾噬菌體科（Podoviridae)、長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae)和復(fù)層噬 菌體科（Tectiviridae)組成的組。在一些額外的優(yōu)選實(shí)施方案，至少一種噬菌體是天然存 在的噬菌體，而在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種噬菌體是使用噬菌體抗性細(xì)菌通 過(guò)選擇壓力所獲得的突變噬菌體。在另外的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，使所述親代細(xì)菌菌株通 過(guò)天然的核酸攝取機(jī)制暴露于該核酸。在一些實(shí)施方案中，天然的核酸攝取機(jī)制包括天然 感受態(tài)。在一些其它實(shí)施方案中，天然的核酸攝取機(jī)制通過(guò)接合或轉(zhuǎn)化親代細(xì)菌菌株。仍在 其他的實(shí)施方案中，噬菌體抗性菌株是噬菌體不敏感性突變體。又在其它的實(shí)施方案中，親 代細(xì)菌菌株是噬菌體不敏感性突變體。在一些其他實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株的CRISPR基 因座的5'端和/或3'端與所述噬菌體抗性變異菌株的經(jīng)修飾的CRISPR基因座比較。仍在 一些其他實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座的至少第一CRISPR重復(fù)序列或至少 第一CRISPR間隔區(qū)序列的5'端和/或3'端與噬菌體抗性變異菌株的經(jīng)修飾的CRISPR基 因座比較。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，噬菌體抗性變異菌株在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含 至少一個(gè)額外核酸片段。在一些其它實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座的至少一 部分和噬菌體抗性變異菌株的經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過(guò)擴(kuò)增所述CRISPR 基因座的至少一部分和經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分進(jìn)行比較，以產(chǎn)生擴(kuò)增的 CRISPR基因座序列和擴(kuò)增的經(jīng)修飾的CRISPR基因座序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使用 聚合酶鏈反應(yīng)開(kāi)展擴(kuò)增。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座的至少 一部分和噬菌體抗性變異菌株的經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過(guò)對(duì)所述CRISPR 基因座的至少一部分和經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分測(cè)序進(jìn)行比較。在一些特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括步驟：對(duì)擴(kuò)增的CRISPR基因座序列和擴(kuò)增的經(jīng)修飾的 CRISPR序列基因座測(cè)序。在一些其它實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的額外核酸片 段是額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該額外的重復(fù)序列-間隔區(qū) 單元包含至少約44個(gè)核苷酸。在一些備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單 元包含約44個(gè)-約119個(gè)核苷酸。然而，不意圖使本發(fā)明限于這些具體的大小范圍，因?yàn)樵?本發(fā)明中使用了其他大小范圍，如本文中所述。在一些實(shí)施方案中，所述額外重復(fù)序列-間 隔區(qū)單元包含與親代細(xì)菌菌株的CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約95 %同 一性的至少一個(gè)核苷酸序列。在一些其他實(shí)施方案中，所述的額外重復(fù)序列-間隔區(qū)單元 包含與至少一種噬菌體的基因組中的核苷酸序列具有至少約95%同一性的至少一個(gè)核苷 酸序列。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株是工業(yè)用菌株。在一些其它實(shí)施方 案中，親代細(xì)菌菌株易受至少一種噬菌體感染。在一些其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，該親代細(xì)菌 菌株包含選自起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物（probioticculture)和膳食補(bǔ)充培養(yǎng)物（dietary supplementculture)的培養(yǎng)物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該親代細(xì)菌菌株包含從培養(yǎng) 物獲得的菌株。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該培養(yǎng)物是起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和/ 或膳食補(bǔ)充培養(yǎng)物。在其它的實(shí)施方案中，親代細(xì)菌菌株選自埃希氏菌屬（Escherichia)、 志賀氏菌屬（Shigella)、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella)、歐文氏菌屬（Erwinia)、耶爾森氏 菌屬（Yersinia)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、弧菌屬（Vibrio)、軍團(tuán)菌屬（Legionella)、 假單胞菌屬（Pseudomonas)、奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、博德特氏菌屬（Bordetella)、 螺桿菌屬（Helicobacter)、利斯特氏菌屬（Listeria)、農(nóng)桿菌屬（Agrobacteria)、葡萄 球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Staphylococcus)、腸球菌屬（Enterococcus)、 梭菌屬（Clostridium)、棒桿菌屬（Corynebacterium)、分枝桿菌屬（Mycobacterium)、 密螺旋體屬（Treponema)、疏螺旋體屬（Borrelia)、弗朗西絲菌屬（Francisella)、布 魯氏菌屬（Brucella)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、弗 蘭克氏菌屬（Frankia)、巴爾通氏體屬（Bartonella)、立克次氏體屬（Rickettsia)、希 瓦氏菌屬（Shewanella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、腸桿菌屬（Enterobacter)、變形菌 屬（Proteus)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、索絲菌屬（Brochothrix)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、短桿菌屬（Brevibacterium)、丙酸桿菌屬（Propionibacterium)、乳 球菌屬（Lactococcus)、乳桿菌屬（lactobacillus)、片球菌屬（Pediococcus)、明串珠菌屬 (Leuconostoc)和酒球菌屬（Oenococcus)。
[0008] 本發(fā)明也提供了使用本文中所述方法獲得的至少一種噬菌體抗性變異菌株。在一 些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了噬菌體抗性變異菌株，其中所述噬菌體抗性變異菌株 是工業(yè)用菌株。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該噬菌體抗性變異菌株包含工業(yè)用菌株，其中所 述工業(yè)用菌株是起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物、膳食補(bǔ)充培養(yǎng)物和/或其他有用培養(yǎng)物的至少 一種組分。
[0009] 本發(fā)明也提供了組合物，該組合物包含使用本文中所述方法產(chǎn)生的噬菌體抗性變 異菌株。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含使用本文中所述方 法產(chǎn)生的至少兩種噬菌體抗性變異菌株。本發(fā)明也提供了包含這些組合物中的至少一種組 合物的食物和/或飼料。本發(fā)明也提供了用于制備食物和/或飼料的方法，所述方法包括添 加這些組合物中的至少一種組合物至所述食物或飼料。本發(fā)明也提供了包含這些組合物中 的至少一種組合物的起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物、膳食補(bǔ)充培養(yǎng)物和其他有用培養(yǎng)物。本發(fā)明 也