專利名稱：蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)菌的應(yīng)用，特別涉及蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在 斑節(jié)對蝦等海產(chǎn)品養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)俗稱鬼蝦、草蝦、花蝦、竹節(jié)蝦、斑節(jié)蝦、牛形對蝦，聯(lián) 合國糧農(nóng)組織通稱大虎蝦。是對蝦中個(gè)體最大的一種，成熟個(gè)體一般體長22. 5cm 32cm， 體重137g 211g，為當(dāng)今世界上蝦類養(yǎng)殖普遍的品種之一。目前不排污的養(yǎng)殖方式，造成對蝦的排泄物、殘存飼料、浮游生物的殘?bào)w等有機(jī)廢 物均在池塘中積累，到了養(yǎng)殖的中后期，不可避免地出現(xiàn)底質(zhì)污染，水體質(zhì)量下降，條件致 病菌和致病菌增多，生態(tài)環(huán)境惡化，從而引發(fā)蝦病的發(fā)生。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中尋求一種新 的方法，既可減少換水，又可提高其存活率和生長率，是廣大養(yǎng)殖者之所盼。中草藥對斑節(jié)對蝦生長性能具有無藥物殘留、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)，但有見效慢的 缺點(diǎn)?？股貙σ种撇≡⑸锏姆敝常瑴p少其代謝毒素對蝦的毒害作用等方面起到了積 極的作用，但是長期使用抗生素，特別是濫用抗生素，其種種弊端也逐漸顯露出來。如破壞 蝦塘中自然生態(tài)平衡，對蝦的機(jī)體免疫力產(chǎn)生不良影響，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等副作用， 給養(yǎng)殖業(yè)和作為消費(fèi)者的人類的健康都帶來了潛在的危害。因此，開發(fā)一種簡便易行、安 全、優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)的無公害健康的斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖新技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)的共識(shí)。蛭弧菌是寄生于其他細(xì)菌，并能導(dǎo)致宿主細(xì)菌裂解的一類細(xì)菌；比一般細(xì)菌小，能 通過細(xì)菌濾器，有類似噬菌體的作用；革蘭氏染色呈陰性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻 弧菌等引發(fā)蝦病害的潛在致病菌。蛭弧菌的生活史可分為脫離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體狀態(tài)和在宿 主細(xì)菌內(nèi)生長發(fā)育的蛭質(zhì)體狀態(tài)。蛭弧菌游泳體侵入宿主時(shí)，在宿主細(xì)胞壁上產(chǎn)生一個(gè)孔 隙，當(dāng)蛭弧菌侵入到宿主的周質(zhì)空間后孔隙重新封閉。游泳體失去鞭毛，和宿主細(xì)胞一起被 稱為"蛭質(zhì)體"。與游泳體相比，蛭質(zhì)體不僅具有制備、保存更為方便，環(huán)境耐受力強(qiáng)，作用 時(shí)間雖略慢但更久的特點(diǎn)，同時(shí)還具有潛在的滅活疫苗功能。當(dāng)蛭弧菌游泳體入侵宿主細(xì) 胞后，宿主細(xì)胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也進(jìn)入蛭質(zhì)體狀態(tài)，開始 分泌多種酶，消解宿主細(xì)胞的大分子為小分子物質(zhì)，進(jìn)而整合為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，使自身生 長，變長。最終，長條狀的蛭質(zhì)體分成很多短的節(jié)段，長出鞭毛，重新成為游泳體。之后，它 們分泌必需的酶類，破壁而出，再次成為脫離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體。在此 蛭質(zhì)體發(fā)育期間，蛭弧菌并不改變宿主細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，使原宿主仍具有免疫原性，可刺激 生物體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。這一功能使得應(yīng)用蛭弧菌蛭質(zhì)體于斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中，可提高對 蝦抗病能力，有效預(yù)防對蝦弧菌病。這些特性使得蛭弧菌蛭質(zhì)體適合作為一種微生物制劑，以應(yīng)用于對蝦的養(yǎng)殖過程 中。筆者通過實(shí)驗(yàn)，證明了蛭弧菌蛭質(zhì)體在成蝦養(yǎng)殖過程中能夠明顯地提高蝦的存活率、免 疫力以及促進(jìn)蝦生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，提供蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖 中的應(yīng)用方法。其特征按照養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)原理，海洋生物的生長環(huán)境要求，生物之間的相互關(guān) 系及無公害養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，人工創(chuàng)造養(yǎng)殖環(huán)境，減少投入成本，提高斑節(jié)對蝦免疫力，促進(jìn)斑節(jié) 對蝦快速生長，提高經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用。所述蛭弧菌蛭弧菌為(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用是將飼料在蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液 中浸泡15-45min。所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用是在水體中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體 菌液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體濃度為IO1 l(fpfu/mL。所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液的制備方法為接種宿主于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在35°C和200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng) 4 "C，5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧菌 BDFM05，在溫度25 ;35°C下，以150 300rpm搖床培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和 蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min后，去除 含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即為蛭弧菌蛭質(zhì)體；將蛭弧菌蛭質(zhì)體用DNB液體培養(yǎng) 基、水、生理鹽水或0. 2mol/ L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO11 1012pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、蛭弧菌蛭質(zhì)體對致病或潛在致病菌有較強(qiáng)的裂解力，而且能改善養(yǎng)殖生物腸道 環(huán)境，促進(jìn)生長。因此，與現(xiàn)有斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖方法相比，本發(fā)明具有使蝦抗病能力強(qiáng)，存活率 提高，生長快等特點(diǎn)。2、本發(fā)明采用蛭弧菌蛭質(zhì)體預(yù)防和調(diào)節(jié)、環(huán)境調(diào)控相結(jié)合的方案，達(dá)到了提高斑 節(jié)對蝦的免疫力，促進(jìn)斑節(jié)對蝦攝食和快速生長，最長可達(dá)到30天不換水，降低生產(chǎn)成本， 提高經(jīng)濟(jì)效益的效果。3、本發(fā)明所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦的應(yīng)用中安全性好，現(xiàn)有的研究表明 蛭弧菌對蝦類無毒性作用，對人類無致病性。4、本發(fā)明所述蛭弧菌蛭質(zhì)體潛在滅活疫苗功能可刺激對蝦產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，可 提高對蝦抗病能力，有效預(yù)防對蝦弧菌病。因此，此方法也可以推廣到其他的蝦或水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖，增加經(jīng)濟(jì)效益，是新時(shí)期 漁業(yè)增效農(nóng)民增收的可靠技術(shù)支撐。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及表格對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
實(shí)施例1蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液的制備所述的蛭質(zhì)體通過以下方法得到在含有副溶血弧菌(接種濃度為IO7CfuAiL的 菌 ImL) (Vibrio parahaemolyticus，購于美國典型物種保藏中心 American Type Culture Collection, ATCC 17802)的 IL DNB(dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯 0.88，酪蛋白酸水解物0.58，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7.6)中接入 ImL濃度為l(fpfu/mL蛭弧菌，于、250rpm培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液經(jīng)4°C 6000rpm離心15min 后，去除上清，沉淀用IOOmL DNB懸浮，即得蛭質(zhì)體；蛭弧菌BDFM05蛭質(zhì)體菌體的濃度達(dá)到 109pfu/mLo實(shí)施例2蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦普通養(yǎng)殖中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的具體實(shí)施地點(diǎn)為華南地區(qū)某養(yǎng)殖場，實(shí)施時(shí)間為3個(gè)月。(1)養(yǎng)殖池塘條件，養(yǎng)殖池底面積為10畝，池深2m，池底為泥沙質(zhì)，池底平整，養(yǎng)殖 池配備水泵、增氧機(jī)，并配備泵站間門和較完備的進(jìn)排水系統(tǒng)；(2)放養(yǎng)前的準(zhǔn)備，試驗(yàn)地海域的水源水質(zhì)符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)要求，海水經(jīng)過砂濾、沉淀處理后進(jìn)入養(yǎng)殖池，符合農(nóng)業(yè)部《無公害食 品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。放苗前10天，用80目的袖狀網(wǎng)過濾后進(jìn)水， 同時(shí)施氮、磷、鉀復(fù)合肥培養(yǎng)餌料生物，使池水透明度達(dá)到40cm，養(yǎng)殖池水鹽度10%。；(3)蝦苗選擇與放養(yǎng)，蝦苗選擇個(gè)體大小整齊，體長1. 1-1. 3cm的黑殼蝦苗，群體 發(fā)育整齊，肌肉飽滿透明，附肢中色素正常，胃腸充滿食物，蝦苗活動(dòng)活潑，對水流刺激反應(yīng) 靈敏，無外部寄生物及附著污物，放苗時(shí)水溫20°C，3月20日放苗。養(yǎng)成池水色為黃綠色、 透明度30cm，pH在8. 5，投放密度為5萬只/畝。蝦苗運(yùn)至養(yǎng)殖池邊，用充氧氣頭向苗袋內(nèi) 充氧半小時(shí)，同時(shí)逐步加入塘內(nèi)池水，使逐步縮小溫差和醒苗；(4)投飼管理，配合飼料1號(hào)(購買于廣東恒興集團(tuán)有限公司，下同)為常規(guī)的 對蝦養(yǎng)殖飼料，符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品漁用配合飼料安全限量》 (NY5072-2002)的規(guī)定。每次投餌前，將配合飼料1號(hào)用蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡30min，菌 液中的蛭弧菌蛭質(zhì)體的濃度達(dá)到ΙΟ1、^)3、105、107pfu/mL,養(yǎng)殖前期和中期，蝦平均體長6cm 以下時(shí)，日投2次，日投放量控制在蝦重的15%;養(yǎng)殖后期，平均體長達(dá)到6cm時(shí)，日投5次， 日投放量控制在蝦重的8% ；(5)養(yǎng)殖期的水環(huán)境管理，養(yǎng)殖期間正常曝氣，使水中溶解氧達(dá)到5mg/L。采取不 同換水周期，5、10、15、20、25、30天換水一次，每次換水控制在25cm深的水量，透明度保持 在30cm，每次換水后加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使水體中的菌體濃度達(dá)到101、ΙΟ3、105、107pfu/ mL,加菌方法為用相應(yīng)的池水稀釋菌液后，均勻潑灑全池，使菌液混合均勻。實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，平均分為A-D4個(gè)試驗(yàn)組，B、C、D每個(gè)試驗(yàn)組有6個(gè)小組， 分別為 B1、C1、D1 ；B2、C2、D2 ；B3、C3、D3 ；B4、C4、D4 ；B5、C5、D5 ；B6、C6、D6 ；B1-D6 每小組再 分為4組，即Bl-l-Bl-4. . . D6-1-D6-4，每組2個(gè)重復(fù)。對5組試驗(yàn)對蝦初始體重進(jìn)行方差 整齊性檢驗(yàn)，組間差異不顯著(P > 0. 05)。五組試驗(yàn)組的處理如下A組工廠生產(chǎn)的養(yǎng)殖方式，池塘水透明度低于20cm時(shí)進(jìn)行換水，每次換水換掉 50cm深的水(量)，維持池水透明度在35cm，投放配合飼料1號(hào)B組在水體中潑灑蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使水體中蛭質(zhì)體菌體濃度分別達(dá)到101、103、105、l(fpfu/mL，投放配合飼料1號(hào)C組投喂經(jīng)濃度為IO1、ΙΟ3、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡后的配合飼 料1號(hào)D組在水體中加入蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使菌體濃度分別達(dá)到101、ΙΟ3、105、107pfu/ mL,同時(shí)分別投喂經(jīng)濃度為IO1UO3UO5UObfuAiL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡后的配合飼料 1號(hào)B1、C1、D1 組每 5 天換水-B2、C2、D2 組每 10 天換水B3、C3、D3 組每 15 天換水B4、C4、D4 組每 20 天換水B5、C5、D5 組每 25 天換水B6、C6、D6 組每 30 天換水-次，換掉25cm深的水(量) 一次，換掉25cm深的水(量 一次，換掉25cm深的水(量 一次，換掉25cm深的水(量 一次，換掉25cm深的水(量 一次，換掉25cm深的水(量Bl-U Cl-U D1-1. . . D6-1換水后加入蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液使水體中菌體濃度為 IO1PfVmLBl-U Cl-2、Dl-2. . . D6-2換水后加入蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液使水體中菌體濃度為 103pfu/mLBl-U Cl-3、Dl-3. . . D6_3換水后加入蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液使水體中菌體濃度為 105pfu/mLBl-U Cl-4、Dl-4. . . D6_4換水后加入蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液使水體中菌體濃度為 107pfu/mL斑節(jié)對蝦實(shí)驗(yàn)效果檢測(1)生長指標(biāo)的測定每組隨機(jī)抽取50尾對蝦檢測生長情況，對蝦長度測定采用精度為0. Imm的游標(biāo)卡 尺度量，體重采用電子天平稱量。試驗(yàn)生長指標(biāo)按如下公式計(jì)算成活率(%) = Nt/NoX100% ；增重率(％) = (Wt-W0)/W0X 100% ；體長增長率(%) = (Lt-L0)/L0X 100% ；式中N。為試驗(yàn)開始時(shí)斑節(jié)對蝦總尾數(shù)；Nt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)斑節(jié)對蝦總尾數(shù)；W。為試 驗(yàn)開始時(shí)斑節(jié)對蝦體重；Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)斑節(jié)對蝦體重；Lo為試驗(yàn)開始時(shí)斑節(jié)對蝦體長； Lt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)斑節(jié)對蝦體長；試驗(yàn)測得的斑節(jié)對蝦各項(xiàng)生長指標(biāo)見表一 表四與A組相比，B、C、D組的成活 率、增重率、體長增長率均有明顯提高，B、C、D組成活率的增加值分別> 25. 08%,25. 78%, 28. 55 % ；增重率的增加值分別彡40. 54%,65. 62%,86. 35% ；體長增長率增加值分別 彡 0. 09%,0. 17%,3. 19%。從表一-表四可以看出，在對蝦養(yǎng)殖過程中，在相同的換水周期下，隨著蛭弧菌蛭 質(zhì)體的濃度升高，成活率、增重率、體長增長率都明顯升高，且都明顯高于工廠生產(chǎn)對照A 組，說明采用新型的添加蛭弧菌蛭質(zhì)體的方法，能明顯提高斑節(jié)對蝦的成活率、增重率、體 長增長率，這在實(shí)際生產(chǎn)過程中，不僅大大節(jié)約了用水量，而且節(jié)省了大量的人力，物力資 源，節(jié)約了養(yǎng)殖成本；從不同換水周期來看，相同濃度下的各組對蝦成活率、增重率、體長增長率沒有顯著的變化。說明新型養(yǎng)殖方法下，5-30天不換水蛭弧菌蛭質(zhì)體都能催進(jìn)對蝦的 生長。就B、C、D三組不同處理方式而言，均提高對蝦的養(yǎng)殖成活率、增重率和體長增長率， 但同時(shí)在水體與飼料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液效果最佳。因此，無論在水中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使水體蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液濃度為 IO1-IO7PfuZmL,或者是在飼料中添加濃度為IO1-KfpfuAiL蛭弧菌游泳質(zhì)體菌液，或是兩者 兼用，雖長達(dá)30天不換水，都會(huì)促進(jìn)斑節(jié)對蝦的攝食和快速生長，并且同時(shí)在水中與飼料 中添加菌液的效果最好。表一斑節(jié)對蝦生長指標(biāo)的檢測
權(quán)利要求
1.蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭弧菌為(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 209172。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用是將飼料在蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液中浸泡 15-45min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用是在水體中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使水體 中蛭弧菌蛭質(zhì)體濃度為IO1 l(fpfu/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液的制備方法為接種宿主于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在35°C和200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng)4°C， 5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧菌BDFM05，在 溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和蛭弧菌游 泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌 游泳體的上清，得到的沉淀即為蛭弧菌蛭質(zhì)體；將蛭弧菌蛭質(zhì)體用DNB液體培養(yǎng)基、水、生 理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為1011 1012pfu/ mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及蛭弧菌蛭質(zhì)體在斑節(jié)對蝦等海產(chǎn)品養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其通過在水體和飼料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體實(shí)現(xiàn)。具體包括養(yǎng)殖池塘條件，放養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作，蝦苗選擇和放養(yǎng)，投飼管理和養(yǎng)殖期的水環(huán)境管理。關(guān)鍵技術(shù)是在水體中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使水體蛭弧菌蛭質(zhì)體濃度為101-107pfu/mL，同時(shí)飼料要用濃度為101-107pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡30min，養(yǎng)殖期間可達(dá)30天換水一次。本發(fā)明為生物養(yǎng)殖方法，綠色、安全、無污染，效果顯著，能夠改善水質(zhì)，促進(jìn)斑節(jié)對蝦生長，提高免疫力，提高成活率，有極好的發(fā)展前景。對提高經(jīng)濟(jì)效益和食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102037917SQ20101026867
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者王沛賢, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)