專利名稱：白色鏈霉菌mc-15菌株及該菌株制備發(fā)酵液的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防馬鈴薯晚疫病的白色鏈霉菌MC-15菌株及其該菌株制備的 發(fā)酵液及應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵及植物病害生物防治領(lǐng)域，專用于植物病害的生長防治。
背景技術(shù)：
馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界四大糧食作物之一，由馬鈴薯晚疫病菌引 起的晚疫病是發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)最主要的制約因子之一。馬鈴薯晚疫病由馬鈴薯晚疫病菌引 起，可發(fā)生于葉、葉柄、莖及塊莖上，種子塊莖感染病菌是導(dǎo)致大田馬鈴薯晚疫病發(fā)生最主 要的因素甚至被認(rèn)為是唯一的因素，因?yàn)槁淙胩镩g的病殘?bào)w、土壤中的病原菌存活時(shí)間最 長為90天，均不能作為初侵染來源。該病菌有性生殖需要A1和A2兩種交配型結(jié)合才能完 成，通常只有A1交配型，缺少A2交配型，但馬鈴薯晚疫病菌A2交配型在各地的出現(xiàn)使有性 生殖具備了條件，因而導(dǎo)致病菌新的變異不斷出現(xiàn)，如致病型發(fā)生變化產(chǎn)生新的生理小種， 造成馬鈴薯品種的抗性不斷喪失，使得晚疫病的控制難度更大，迄今為止，對于馬鈴薯晚疫 病仍以選育抗病品種為主、并結(jié)合化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。國內(nèi)學(xué)者蔣繼志等發(fā)現(xiàn)洋蔥浸出液中的某些水溶性成分、大蒜和丁香等植物離體 組織及其提取物，對馬鈴薯晚疫病菌靜止孢萌發(fā)、附著孢形成也具有強(qiáng)烈的抑制作用。曹克 強(qiáng)等也發(fā)現(xiàn)生物潔凈劑和大蒜提取物對馬鈴薯晚疫病菌孢子萌發(fā)具有很好的抑制作用，且 隨著提取物濃度的增加，抑制率也相應(yīng)增強(qiáng)，最高可達(dá)100%。張培花等發(fā)現(xiàn)不同溶劑所得 到的紫莖澤蘭提取物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長也具有不同程度的抑制作用，其中石油醚 提取物的抑制效果最好，將紫莖澤蘭提取物與甲霜靈混配使用的抑制效果更好，其抑制率 達(dá)95. 43%。王樹桐等報(bào)道知母的水提取物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長、游動(dòng)孢子釋放和 休止孢萌發(fā)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用，還發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯離體葉片上，知母提取物對晚疫病具 有顯著的防治效果，盆栽試驗(yàn)中知母提取物的保護(hù)效果達(dá)70%以上，持效期可達(dá)5天。以 上均是從植物中獲得抑菌物質(zhì)，但植物生長受季節(jié)、地區(qū)等限制，不易迅速大量獲得抑菌物 質(zhì)，且提取工藝復(fù)雜繁鎖、成本高昂，沒有得到推廣應(yīng)用。除利用植物及其提取物抑制馬鈴 薯晚疫病菌外，不少學(xué)者探索利用微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物控制馬鈴薯晚疫病菌。有報(bào)道表明 擬青霉菌發(fā)酵濃縮物YFC對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長具有明顯的抑制作用，2g/L的YFC對 菌絲生長的相對抑制率達(dá)63. 00% ；盆栽實(shí)驗(yàn)YFC對馬鈴薯晚疫病的預(yù)防和治療效果分別 為83. 35%和35. 63%;還有人測定了 8種真菌發(fā)酵液在5種不同濃度下對馬鈴薯晚疫病菌 菌絲生長、游動(dòng)孢子靜止、靜止胞萌發(fā)、附著胞形成和侵入絲形成等不同階段的影響，發(fā)現(xiàn) 立枯絲核菌發(fā)酵液的抑制作用最強(qiáng)，濃度為100%時(shí)，對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制 率達(dá)到90. 4%，靜止胞萌發(fā)率為2. 4%，附著胞及侵入絲均未見形成；楊懷文等發(fā)現(xiàn)一株嗜 線蟲致病桿菌的代謝物可抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲體生長及孢子萌發(fā)。以上研究僅是抑菌 或盆栽實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，還未見有實(shí)際田間應(yīng)用的報(bào)道，且抑菌率較低。所以提供一種抑菌率 更高，在田間應(yīng)用效果最好，能得到切實(shí)推廣應(yīng)用的白色鏈霉菌就成為該技術(shù)領(lǐng)域急需解 決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種白色鏈霉菌MC-15 菌株及其該菌株制備發(fā)酵液的方法和應(yīng)用，由白色鏈霉菌MC-15菌株制備的發(fā)酵液可產(chǎn)生 具有強(qiáng)烈抑制馬鈴薯晚疫病菌的作用及促進(jìn)馬鈴薯生長和抗病的活性代謝產(chǎn)物，可用于提 高馬鈴薯抗晚疫病能力和促進(jìn)馬鈴薯的增產(chǎn)。為完成上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種白色鏈霉菌(Str印tomyces albus)MC-15 菌株，保藏號為 CGMCC No. 3652。上述白色鏈霉菌(Str印tomyces albus)MC-15菌株的獲得方法如下(一)樣品的采集在河北省保定市滿城縣東馬村番茄地中按常規(guī)方法采集土樣，鏟去表層土，用取 樣器取10-15cm深度處的土樣50g裝入無菌牛皮紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干后采用土壤稀釋 法進(jìn)行分離；( 二 )樣品的梯度稀釋與特定功能菌株的分離篩選(1)單一菌落式分離培養(yǎng)稱取陰干后的土樣10g置于內(nèi)裝90mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于lOOrpm搖 床上振蕩30min后，靜止lOmin得到土壤懸浮液，取其中0. 5mL加入4. 5mL無菌水中，再依次 稀釋成不同濃度的土壤稀釋液10_2、10_3、10_4、10_5 ；用移液器分別吸取上述4種濃度的土壤 稀釋液100 yL加到高氏一號培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂布器涂勻，在超凈工作臺上放置 lh后，將培養(yǎng)皿倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d，觀察放線菌單菌落的生成；所述的高氏一 號培養(yǎng)基的配方如下按重量比計(jì)算20的可溶性淀粉，1的硝酸鉀，0. 5的氯化鈉，0. 5的 磷酸氫二鉀，0. 5的硫酸鎂，0. 01的硫酸鐵，加水定容至lOOOmL，該培養(yǎng)基的pH為7. 2-7. 4 ；(2)具有抑菌功能的單菌落的篩選挑取上述初步確定的放線菌單菌落，用無菌水進(jìn)行稀釋得到稀釋液，將稀釋液在 高氏一號培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，得到純化的菌株；將純化后的菌株接種到高氏一號斜面 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14d后，4°C保存?zhèn)溆茫灰择R鈴薯晚疫病菌為靶標(biāo)菌，利用常規(guī)的平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗作用的初篩， 初篩步驟是將保存的馬鈴薯晚疫病菌菌株經(jīng)黑麥培養(yǎng)基(RSA)20°C活化培養(yǎng)10d后，取 直徑1cm的馬鈴薯晚疫病菌菌餅接于黑麥培養(yǎng)基平板中央，挑取經(jīng)高氏一號培養(yǎng)基平板 28°C活化培養(yǎng)5-7d的放線菌菌落接種于馬鈴薯晚疫病菌菌餅兩側(cè)，20°C對峙培養(yǎng)，觀察測 定馬鈴薯晚疫病菌菌落直徑，以在馬鈴薯晚疫病菌另外兩側(cè)放置空白瓊脂塊的為對照，計(jì) 算抑菌率，抑菌率(％ )=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落半徑X 100 ；每個(gè)處 理重復(fù)5次；馬鈴薯晚疫病菌菌落直徑小，抑菌率高的表明接種的放線菌菌株抑菌效果好；對經(jīng)過初篩得到的有拮抗作用的放線菌菌株進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過 濾器除菌后得到無菌體發(fā)酵濾液；進(jìn)一步以濾紙片法測試該無菌體發(fā)酵濾液對馬鈴薯晚疫 病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用和溫室防病作用，最終篩選出了性狀優(yōu)良的抑菌單菌 落菌株MC-15 ；(三)具有抑菌功能的單菌落的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏(1)單菌落的純化培養(yǎng)
將篩選出的單菌落菌株在高氏一號培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)純化培養(yǎng)3次以上，確保菌 落形態(tài)一致，將純化的單菌落菌株接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14d后，4°C保存， 并定期進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化活性測定；(2)對篩選出的純化的菌株進(jìn)行菌種鑒定根據(jù)MC-15菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16SrDNA基因序列 等多項(xiàng)指標(biāo)的分析結(jié)果，將分離到的功能放線菌菌株MC-15初步鑒定為白色鏈霉菌 (Streptomyces albus) MC-15 菌株。本發(fā)明的白色鏈霉菌MC-15菌株已于2010年3月5日在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3652。本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述白色鏈霉菌MC-15菌株制備發(fā)酵液的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案達(dá)到的一種由上述所述白色鏈霉菌MC-15菌株制備發(fā)酵液的方法，其步驟如下(1)菌株活化培養(yǎng)將保存在高氏一號斜面培養(yǎng)基上的MC-15菌株轉(zhuǎn)接在高氏一 號培養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)10-15d，得到活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落；(2)種子液培養(yǎng)挑取活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落，接種于50mL液體高氏一 號培養(yǎng)基中，經(jīng)28 °C、150rpm培養(yǎng)3_6d，得種子液；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)取種子液lmL接種于裝有100mL液體高氏一號培養(yǎng)基的250mL三 角瓶中，經(jīng)28°C、150rpm培養(yǎng)8_12d，得擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液；(4)過濾除菌獲得發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液經(jīng)在4°C、15000rpm下離心15min、 用瓶頂過濾裝置過濾除菌后獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液冷凍干燥后得到發(fā)酵產(chǎn)物，備用，使用 時(shí)，根據(jù)需要將發(fā)酵產(chǎn)物配成不同濃度的發(fā)酵液。有益效果本發(fā)明的白色鏈霉菌MC-15菌株通過發(fā)酵培養(yǎng)可以產(chǎn)生促進(jìn)馬鈴薯生長、抵抗晚 疫病并增加產(chǎn)量的活性代謝產(chǎn)物。MC-15菌株的抑菌作用最強(qiáng)，活體和發(fā)酵液的抑菌率分別 為94. 12%和92. 22%。用MC-15拮抗菌株的發(fā)酵液浸泡或涂抹馬鈴薯種薯切片和離體葉 片后，未發(fā)現(xiàn)拮抗菌發(fā)酵液對離體組織有不良影響，種薯可正常萌芽、幼芽可正常生長，且 接種馬鈴薯晚疫病菌后的結(jié)果表明，發(fā)酵液處理后對馬鈴薯晚疫病菌所致病害的預(yù)防作用 十分明顯，相對保護(hù)率達(dá)到90%以上；在田間試驗(yàn)中，MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯后，對種 薯出苗、幼苗早期生長、植株抗晚疫病及產(chǎn)量均有不同程度的促進(jìn)作用，與對照組相比，出 苗早2-4天、株高平均高出3. 1cm、分枝數(shù)多1. 6個(gè)、葉片數(shù)多2. 1個(gè)，平均增產(chǎn)30%左右。 總之，該發(fā)酵液不僅表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的作用，且在促進(jìn)馬鈴薯 種薯萌發(fā)、幼苗生長、植株生長、抗晚疫病及增加產(chǎn)量方面，效果顯著。本發(fā)明放線菌MC-15菌株發(fā)酵液與實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的其它放線菌菌株發(fā)酵液對馬鈴 薯晚疫病菌的抑制作用比較顯示，本發(fā)明對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，見表1表1 菌株抑菌率/%菌株抑菌率/%MC-1591.22XS1246.34BYD1380.34HSM546.22ZD1278.21HSM844.55GBD277.45GYM343.21QY1473.87QY841.65LY1069.24GYC1139.78MC1165.66GYC637.52BYD861.14HSG335.11QHD1159.21GYM1331.15BD257.54GYC330.33GYD553.3

圖1為MC-15菌株發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制作用的圖片說明，左 為被MC-15菌株發(fā)酵液處理，右為對照；圖2為MC-15菌株發(fā)酵液浸泡處理對馬鈴薯種薯幼芽生長的影響的圖片說明，(黑 暗保濕放置20d)，左為MC-15菌株發(fā)酵液處理，右為對照；圖3為MC-15菌株發(fā)酵液在馬鈴薯塊莖切片上的防病效果的圖片說明，1為對照 I (未處理)，2為對照II (清水處理)，3為MC-15發(fā)酵液處理；圖4為MC-15菌株發(fā)酵液在馬鈴薯離體葉片上的防病效果的圖片說明，A為對照 (清水處理)，B為MC-15發(fā)酵液處理；圖5為MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯后對出苗的影響的圖片說明，左為對照，右為 MC-15發(fā)酵液處理；圖6為MC-15發(fā)酵液處理對幼苗生長的影響的圖片說明，左為對照；右為MC-15發(fā) 酵液處理；圖7為MC-15發(fā)酵液處理對馬鈴薯植株抗晚疫病的影響的圖片說明，A和B為對 照(發(fā)病)；C為MC-15發(fā)酵液處理；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。一、一種白色鏈霉菌(Str印tomyces albus)MC_15菌株的獲得方法如下(一)樣品的采集在河北省保定市滿城縣東馬村番茄地中按常規(guī)方法采集土樣，鏟去表層土，用取 樣器取10-15cm深度處的土樣50g裝入無菌牛皮紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干后采用土壤稀釋 法進(jìn)行分離；( 二 )樣品的梯度稀釋與特定功能菌株的分離篩選(1)單一菌落式分離培養(yǎng)稱取陰干后的土樣10g置于內(nèi)裝90mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于lOOrpm搖 床上振蕩30min后，靜止lOmin得到土壤懸浮液，取其中0. 5mL加入4. 5mL無菌水中，再依 次稀釋成不同濃度的土壤稀釋液10_2、10_3、10_4、10_5 ；用移液器分別吸取上述4種濃度的土
6壤稀釋液100 PL加到高氏一號培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂布器涂勻，在超凈工作臺上放 置lh后，將培養(yǎng)皿倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d，觀察放線菌單菌落的生成；所述的高氏 一號培養(yǎng)基的配方如下20g的可溶性淀粉，lg的硝酸鉀，0. 5g的氯化鈉，0. 5g的磷酸氫二 鉀，0. 5g的硫酸鎂，0. Olg的硫酸鐵，加水定容至1000mL，該培養(yǎng)基的pH為7. 2-7. 4 ；(2)具有抑菌功能的單菌落的篩選挑取上述初步確定的放線菌單菌落，用無菌水進(jìn)行稀釋得到稀釋液，將稀釋液在 高氏一號培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，得到純化的菌株；將純化后的菌株接種到高氏一號斜面 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14d后，4°C保存?zhèn)溆?；以馬鈴薯晚疫病菌為靶標(biāo)菌，利用常規(guī)的平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗作用的初篩， 初篩步驟是將保存的馬鈴薯晚疫病菌菌株經(jīng)黑麥培養(yǎng)基(RSA)20°C活化培養(yǎng)10d后，取直 徑1cm的馬鈴薯晚疫病菌菌餅接于黑麥培養(yǎng)基平板中央，挑取經(jīng)高氏一號培養(yǎng)基平板28°C 活化培養(yǎng)5-7d的放線菌菌落接種于馬鈴薯晚疫病菌菌餅兩側(cè)，20°C對峙培養(yǎng)，觀察測定馬 鈴薯晚疫病菌菌落直徑，以在馬鈴薯晚疫病菌另外兩側(cè)放置空白瓊脂塊的為對照，計(jì)算抑 菌率，抑菌率(％ )=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落半徑X 100 ；每個(gè)處理重 復(fù)5次；馬鈴薯晚疫病菌菌落直徑小，抑菌率高的表明接種的放線菌菌株抑菌效果好；對經(jīng)過初篩得到的有拮抗作用的放線菌菌株進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過 濾器除菌后得到無菌體發(fā)酵濾液；進(jìn)一步以濾紙片法測試該無菌體發(fā)酵濾液對馬鈴薯晚疫 病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用和溫室防病作用，最終篩選出了性狀優(yōu)良的抑菌單菌 落菌株MC-15 ；(三)具有抑菌功能的單菌落的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏(1)單菌落的純化培養(yǎng)將篩選出的單菌落菌株在高氏一號培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)純化培養(yǎng)3次以上，確保菌 落形態(tài)一致，將純化的單菌落菌株接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14d后，4°C保存， 并定期進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化活性測定；(2)對篩選出的純化的菌株進(jìn)行菌種鑒定根據(jù)MC-15菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16SrDNA基因序列 等多項(xiàng)指標(biāo)的分析結(jié)果，將分離到的功能放線菌菌株MC-15初步鑒定為白色鏈霉菌 (Streptomyces albus)菌株。本發(fā)明的白色鏈霉菌MC-15菌株已于2010年3月5日在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3652。二、由上述所述白色鏈霉菌MC-15菌株制備發(fā)酵液的方法，其步驟如下(1)菌株活化培養(yǎng)將保存在高氏一號斜面培養(yǎng)基上的MC-15菌株轉(zhuǎn)接在高氏一 號培養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)15d，得到活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落；(2)種子液培養(yǎng)挑取活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落，接種于50mL液體高氏一 號培養(yǎng)基中，經(jīng)28°C、150rpm培養(yǎng)5d，得種子液；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)取種子液lmL接種于裝有100mL液體高氏一號培養(yǎng)基的250mL三 角瓶中，經(jīng)28°C、150rpm培養(yǎng)10d，得擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液；(4)過濾除菌獲得發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液經(jīng)在4°C、15000rpm下離心15min、 用瓶頂過濾裝置過濾除菌后獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液冷凍干燥后得到發(fā)酵產(chǎn)物，備用，使用時(shí)，根據(jù)需要將發(fā)酵產(chǎn)物配成不同濃度的發(fā)酵液。三、白色鏈霉菌MC-15菌株制備的發(fā)酵液的應(yīng)用實(shí)例實(shí)施例1 白色鏈霉菌MC-15菌株制備的發(fā)酵液在平板對峙培養(yǎng)中的抑菌作用。采用濾紙片法測定MC-15菌株與其供試菌株發(fā)酵液的抑菌活性，將在黑麥培養(yǎng)基 上活化培養(yǎng)5d的馬鈴薯晚疫病菌菌餅= 10mm)置于黑麥培養(yǎng)基平板= 90mm)中 央，在菌餅上下或左右對稱兩側(cè)各相距25mm處放置1張無菌濾紙片，取經(jīng)上述方法獲得的 MC-15菌株和其它菌株的發(fā)酵液原液20 y L滴加于無菌濾紙片上，以滴加無菌水為對照。 20°C下暗培養(yǎng)，每24h觀察記錄菌落直徑，直到對照菌落長滿整個(gè)平板，每種發(fā)酵液重復(fù)5 個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，在所有供試菌株中，MC-15菌株的發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫 病菌菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率可達(dá)到91. 22%。如圖1所示。實(shí)施例2 :MC-15菌株發(fā)酵液最適抑菌濃度的確定。將MC-15菌株的發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥后，用無菌水配制成10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、 4mg/mL、2mg/mL等不同梯度的溶液，以無菌水為對照進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，方法同實(shí)施例1對發(fā)酵 液的抑菌活性的測定，每種濃度的發(fā)酵液重復(fù)5個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明以4-6mg/ mL濃度的發(fā)酵液最為合適，如表2所示。表2 MC-15菌株最適抑菌濃度的確定
發(fā)酵液濃度(mg/mL)108642抑菌率(％ )79.45a85. 22a91. 56a90. 14a56.23b 表中不同字母表示彼此之間達(dá)到顯著性差異(p = 0. 05)實(shí)施例3 :MC-15菌株發(fā)酵液對馬鈴薯種薯切片的影響。將健康完整的馬鈴薯種薯清水洗凈，在1 %的NaCIO中浸泡5-lOmin，無菌水沖洗 3-5遍，以無菌濾紙吸去表面水分，用滅菌刀將馬鈴薯種薯分別切成2cmX lcmX lcm的薄片 和適于田間播種用的切塊(以每個(gè)切塊有兩個(gè)健康完整的芽眼為標(biāo)準(zhǔn))，取上述制備好的 2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL濃度的MC-15菌株發(fā)酵液100 u L均勻涂抹于馬 鈴薯薄片上，用10mg/mL濃度的MC-15菌株發(fā)酵液浸泡處理種薯切塊不同時(shí)間，以同體積無 菌水涂抹切片和浸泡切塊為對照，置于20°C保濕暗培養(yǎng)，逐日觀察塊莖切片和切塊的變化。 結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的MC-15菌株發(fā)酵液處理和10mg/mL濃度的MC-15菌株發(fā)酵液處理 不同時(shí)間后，馬鈴薯塊莖切片和切塊均無明顯變色、腐爛或其它病變的跡象，均與無菌水處 理的對照一致，表明MC-15菌株的發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖切片均無明顯不良影響，可以用于 處理馬鈴薯塊莖切片和種薯切塊。實(shí)施例4 :MC-15菌株發(fā)酵液對馬鈴薯種薯萌芽及幼芽生長的影響。健康完整的馬鈴薯種薯在的NaCIO中浸泡5-lOmin，無菌水沖洗3_5遍，以無 菌濾紙吸去表面水分，用滅菌刀將其切成適于田間播種用的切塊，浸泡于上述制備好的濃 度為4mg/mL的MC-15菌株發(fā)酵液中30min，以切塊完全淹沒為準(zhǔn)，以淹沒于同體積的無菌水 中為對照。一部分切塊置于20°C保濕暗培養(yǎng)，逐日觀察切塊萌芽及形成幼苗的環(huán)節(jié)，待出芽 之后給予光照(每日光照16h以上)；另一部分切塊種植于室內(nèi)自然土中，觀察切塊出苗及 苗期生長。結(jié)果顯示，帶有芽眼的馬鈴薯種薯切塊經(jīng)濃度為4mg/mL的MC-15菌株發(fā)酵液浸泡30min、2(TC黑暗保濕放置20d后，切塊的發(fā)芽時(shí)間普遍比未經(jīng)發(fā)酵液處理的對照切塊要早 l-2d，嫩芽的長勢也比對照要好。表明MC-15菌株發(fā)酵液對于馬鈴薯種薯萌芽不但沒有不 良影響，且有一定的促進(jìn)作用，適合于進(jìn)行浸種處理；進(jìn)一步將在室內(nèi)條件下已經(jīng)萌芽的 種薯用MC-15菌株發(fā)酵液浸泡處理后，幼芽的長勢也明顯優(yōu)于對照，如圖2所示。實(shí)施例5 :MC-15菌株發(fā)酵液在馬鈴薯離體組織上的防病作用。馬鈴薯種薯切片的預(yù)處理與上述實(shí)施例3相同，在經(jīng)過預(yù)處理的切片上的防病試 驗(yàn)以3種處理方式進(jìn)行1)預(yù)先將濃度為4mg/mL的100 u L MC-15菌株發(fā)酵液均勻涂抹于 種薯切片上，以涂抹同體積無菌水為對照，2d后接種活化培養(yǎng)的直徑為0. 7cm的馬鈴薯晚 疫病菌菌餅，置于20°C保濕暗培養(yǎng)，逐日觀察并記錄種薯切片上病菌菌體的生長變化；2) 先在種薯切片表面接種活化培養(yǎng)的直徑為0. 7cm的馬鈴薯晚疫病菌菌餅，20°C保濕暗培養(yǎng) 2d后在種薯切片表面的馬鈴薯晚疫病菌菌餅四周滴加濃度為4mg/mL的100 u LMC-15菌株 發(fā)酵液，以滴加相同體積無菌水為對照，逐日觀察并記錄菌餅中種薯切片上病菌菌體的生 長變化；3)在種薯切片表面接種馬鈴薯晚疫病菌菌餅后，隨即滴加濃度為4mg/mL的100 u L MC-15菌株發(fā)酵液，以滴加同體積無菌水為對照，20°C保濕暗培養(yǎng)，逐日觀察并記錄種薯切 片表面病菌菌體生長以及種薯切片自身的變化情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。病情指數(shù)=[E (病級數(shù)X該病級的種薯切片數(shù))/(調(diào)查總數(shù)X最高病級 數(shù))]X100馬鈴薯離體葉片的預(yù)處理方法與實(shí)施例3相同，其防病作用的測定也與上述馬鈴 薯種薯切片的方法相同，區(qū)別僅僅在于處理后的馬鈴薯種薯切片暗培養(yǎng)即可，離體葉片則 需要光照培養(yǎng)(每日光照時(shí)間16h)。結(jié)果顯示，在預(yù)處理過的馬鈴薯塊莖切片和離體葉片上先滴加MC-15發(fā)酵液，2d 后接入馬鈴薯晚疫病菌菌餅，8d后所得保護(hù)效果最好，對照組中種薯切片上病菌菌絲生長 旺盛，菌餅周圍的種薯切片組織變?yōu)楹稚?，葉片則大面積變成褐色(褐色面積超過90% )、 并開始腐爛，而經(jīng)MC-15菌株發(fā)酵液處理的種薯切片上菌絲較少，切片組織幾乎不變色，葉 片也只是輕微變黃但沒有腐爛現(xiàn)象。經(jīng)MC-15菌株發(fā)酵液處理的種薯切片和離體葉片上的 病情指數(shù)均在10%以下，而對照的病情指數(shù)均在83%以上，相對保護(hù)率達(dá)到72%以上。相 比之下，先接種馬鈴薯晚疫病菌后滴加MC-15菌株發(fā)酵液、或同時(shí)接種馬鈴薯晚疫病菌和 滴加MC-15菌株發(fā)酵液雖然也均有一定的治療作用，但效果均不及預(yù)防作用。如圖3、圖4 和表3所示。表3不同菌株發(fā)酵液處理后對病害的預(yù)防效果* *表中括號里的數(shù)據(jù)為相對保護(hù)率(％ )。
9
實(shí)施例6 :MC-15菌株發(fā)酵液對馬鈴薯種薯出苗、生長、抗病及產(chǎn)量的影響健康完整的馬鈴薯種薯在的NaCIO中浸泡5-lOmin，無菌水沖洗3_5遍，以無 菌濾紙吸去表面水分，用滅菌刀將其切成適于田間播種用的切塊(以每個(gè)切塊有兩個(gè)健康 完整的芽眼為標(biāo)準(zhǔn))，切塊完全浸泡于上述制備好的濃度為4mg/mL的MC-15菌株發(fā)酵液中 30min,以淹沒于同體積的無菌水中為對照。切塊種植于張家口及承德不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)地 中，觀察出苗、苗期生長、人工接種馬鈴薯晚疫病菌后植株對馬鈴薯晚疫病菌的抗性及最終 產(chǎn)量等性狀。對出苗的影響經(jīng)過MC-15菌株發(fā)酵液處理的種薯，播種后出苗時(shí)間與未經(jīng)處理 的對照以及經(jīng)清水處理的對照相比，要早2-4d，但在出苗率方面無顯著差異，如圖5、表4和 表5所示。表4 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯田間出苗的影響(2008年度廣 *對照I為未處理，對照II為清水處理，表中數(shù)據(jù)為播種后30d的調(diào)查結(jié)果，出苗 時(shí)間以出苗率達(dá)到90 %為標(biāo)準(zhǔn)。A-張家口壩上涸源縣平頂堡鎮(zhèn)河?xùn)|村；B-張家口市宣化 區(qū)河子西鄉(xiāng)肖家房村；C-承德市圍場縣銀窩溝鄉(xiāng)石匣村三組。表5 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯田間出苗的影響(2009年度廣 * 同表 4。對幼苗生長的影響經(jīng)MC-15菌株發(fā)酵液處理的種薯，出苗后45d后的生長勢 調(diào)查表明，在株高、分枝數(shù)和葉片數(shù)等方面均明顯優(yōu)于對照。發(fā)酵液處理后的平均株高為 25. 2-27. 4cm,分枝數(shù)為7. 1-8. 5，葉片數(shù)為9. 8-11. 3，而對照平均株高為17. 5-21. 5cm,分 枝數(shù)為5. 3-7. 6，葉片數(shù)為8. 4-9. 8。如圖6、表6和表7所示。表6 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對幼苗生長的影響(2008年度廣 *播種后45d的調(diào)查結(jié)果。其余同表4。表7 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對幼苗生長的影響(2009年度廣 * 同表 6。對馬鈴薯植株抗病的影響用MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯后，田間馬鈴薯植株對 人工接種馬鈴薯晚疫病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，對照組的病情指數(shù)均在76以上，而發(fā)酵液處 理后的病情指數(shù)則均在28以下，平均保護(hù)率達(dá)到66-80%。如圖7、表8和表9所示。表8 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯植株田間抗晚疫病的影響(2008年度廣 *播種后第52d，人工接種馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸浮液于植株自下而上第4張葉 片，每種處理共接種30個(gè)植株，接種后及時(shí)灌水以保持田間濕度，接種后第5-7d調(diào)查病情 指數(shù)，表中數(shù)據(jù)為30個(gè)植株的平均值。其余同表4。表9 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯植株田間抗晚疫病的影響(2009年度廣 * 同表 8。對經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響采用MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯后，對馬鈴薯經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量 有明顯的增加作用，對照組的平均單株重為607g-738g，而發(fā)酵液處理的平均單株重為 968g-1123g，平均增產(chǎn)率為29% -44%。(表10和表11)。表10 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響(2008年度廣
試驗(yàn)地經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量(g)對照I對照II對照平均MC-15相對增產(chǎn)率(％)A694738716101129B705663684103233C614626620112344*生長后至自然成熟收獲產(chǎn)量，表中數(shù)據(jù)為單株重。其余同表4。表11 MC-15菌株發(fā)酵液處理種薯對馬鈴薯經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響(2009年度廣
11
* 同表 10。
權(quán)利要求
一種白色鏈霉菌(Streptomyces albus)MC 15菌株，保藏號為CGMCC No.3652。
2.一種由權(quán)利要求1所述的白色鏈霉菌(Sti^ptomyces albus)MC-15菌株制備發(fā)酵液 的方法，其步驟如下(1)菌株活化培養(yǎng)將保存在高氏一號斜面培養(yǎng)基上的MC-15菌株轉(zhuǎn)接在高氏一號培 養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)10-15d，得到活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落；(2)種子液培養(yǎng)挑取活化培養(yǎng)好的MC-15菌株單菌落，接種于50mL液體高氏一號培 養(yǎng)基中，經(jīng)28°C、150rpm培養(yǎng)3_6d，得種子液；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)取種子液ImL接種于裝有IOOmL液體高氏一號培養(yǎng)基的250mL三角瓶 中，經(jīng)28°C、150rpm培養(yǎng)8_12d，得擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液；(4)過濾除菌獲得發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液經(jīng)在4°C、15000rpm下離心15min、用瓶 頂過濾裝置過濾除菌后獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液冷凍干燥后得到發(fā)酵產(chǎn)物，備用，使用時(shí)，根 據(jù)需要將發(fā)酵產(chǎn)物配成不同濃度的發(fā)酵液。
3.權(quán)利要求1所述的白色鏈霉菌(Sti^ptomycesalbus)MC-15菌株制備的發(fā)酵液在抑 制馬鈴薯晚疫病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白色鏈霉菌MC-15菌株及其該菌株制備發(fā)酵液的方法和應(yīng)用。白色鏈霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株，保藏號為CGMCC No.3652。將保存在高氏一號斜面培養(yǎng)基上的菌株轉(zhuǎn)接在高氏一號培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)后，再接種于50mL液體高氏一號培養(yǎng)基中進(jìn)行種子液培養(yǎng)后，再接種于裝有100mL液體高氏一號培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再過濾除菌獲得發(fā)酵液。該發(fā)酵液不僅表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的作用，且在促進(jìn)馬鈴薯種薯萌發(fā)、幼苗生長、植株生長、抗晚疫病及增加產(chǎn)量方面，效果顯著。
文檔編號C12N1/20GK101928685SQ20101012163
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者王家琛 申請人:王家琛