專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生抗寄生化合物的鏈霉菌屬菌株及其制備方法
阿凡曼菌素類(lèi)(avermectins)是具有抗寄生作用的有關(guān)試劑的一種復(fù)合物，已知可通過(guò)Streptomyces avermitilis菌株ATCC 31267、31271和31272需氧發(fā)酵而制備。如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US 4，310，519和4，429，042。上述后兩種菌株分別表示將S.avermitilis ATCC NO.31267經(jīng)紫外線照射而獲得的冷凍小瓶和凍干試管的培養(yǎng)物。
上述美國(guó)專(zhuān)利提到的S.avermitilis菌株可產(chǎn)生一組一般稱(chēng)為C-076的物質(zhì)(阿凡曼菌素類(lèi)，以下稱(chēng)式I)。該組物質(zhì)包括8種不同的但十分相關(guān)的化合物，稱(chēng)為阿凡曼菌素A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a、B2b?！癮”系列化合物指25位取代基為(S)-仲丁基的天然阿凡曼菌素，“b”系列是25位取代基為異丙基的天然阿凡曼菌素?！癆”和“B”分別指其中的5位取代基是甲氧基或羥基的阿凡曼菌素。數(shù)字“1”指22-23位存在雙鍵的阿凡曼菌素，數(shù)字“2”指的是其中在22位是氫而在23位上是羥基的阿凡曼菌素。
因此，阿凡曼菌素是式1的化合物
其中斷線表示單鍵或雙鍵;
R1是H或羥基，而當(dāng)所述斷線是單鍵時(shí)只能存在羥基;
R2是異丙基或仲丁基;
R3是甲氧基或羥基。
已知其它的S.avermitilis菌株可產(chǎn)生一種或多種已知的或“天然的”avermectins，其中的25位取代基或者是異丙基或者是(S)-仲丁基(1-甲丙基)，或“非天然的”avermectins，其中25位取代基不是異丙基或(S)-仲丁基。例如，公開(kāi)在US 4，378，353中的S.avermitilis ATCC 31780;公開(kāi)在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)(EP)276131中的ATCC 53567和ATCC 53568;EP 276103中的ATCC 53692;以及EP214731中所述的NCIB 12121。然而，這些S.avermitilis菌株中的每一個(gè)均是S.avermitilis ATCC 31267菌株的直接或間接的子代。因此，能產(chǎn)生一種或多種阿凡曼菌素化合物的上述S.avermitilis菌株只包括親株及其子代。
另一種S.avermitilis菌株，ATCC 53814，公開(kāi)在US 5，015，662中。該菌株可通過(guò)它具有生物轉(zhuǎn)化一系列milbemycin類(lèi)型化合物的能力，而不能產(chǎn)生大量的阿凡曼菌素來(lái)識(shí)別。
本發(fā)明提供了一種新的產(chǎn)生阿凡曼菌素菌株，S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。本發(fā)明還提供了使用S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005制備阿凡曼菌素的新方法。
本發(fā)明涉及微生物S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的生物純培養(yǎng)物，或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
本發(fā)明還涉及制備一種或多種阿凡曼菌素的方法，該方法包括在浸沒(méi)需氧條件下，在含有碳、氮和無(wú)機(jī)鹽的可同化源的水液培養(yǎng)基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產(chǎn)生一種或多種阿凡曼菌素并收集。


圖1示出了S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005(A58267.2)和其他S.avermitilis種的樹(shù)狀圖。
圖2為從脂肪酸分析得出的表明A58267.2和S.avermitilis種之間相互關(guān)系的主要組分區(qū)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是關(guān)于微生物S.avermitilis亞種黑色NRRL 21005(NRRL 21005菌株)的生物純培養(yǎng)物，或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
本發(fā)明的產(chǎn)生阿凡曼菌素的新的微生物為了方便也稱(chēng)作培養(yǎng)物A58267.2。它是培養(yǎng)物A58267.21的改進(jìn)的菌株，培養(yǎng)物A58267.21是培養(yǎng)物A58267的天然變異體。培養(yǎng)物A58267是從意大利收集的土壤試樣中分離出的。
按照布達(dá)佩斯條約，已將培養(yǎng)物A58267.2保藏，并已成為指定保藏號(hào)NRRL 21005的the Northern Regional Research Center，Agricultural Research Service，North Central Region，Unit-ed states Department of Agriculture，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604的原種培養(yǎng)物部分。任何這種專(zhuān)利申請(qǐng)授權(quán)的整個(gè)有效期限內(nèi)，可保證保藏在Northern Regional Research Center(在Peoria，Illinois)的該培養(yǎng)物的穩(wěn)定不變，而且公眾易于得到該培養(yǎng)物。在本申請(qǐng)待批期間內(nèi)，在37℃.F.R§1.14和35 U.S.C.§112條款條件下可以得到該培養(yǎng)物。一旦該專(zhuān)利被批準(zhǔn)，對(duì)公眾獲得培養(yǎng)物的所有限制則將最后被取消。
Frederrick P.Mertz(the Lilly Research Laboratories)進(jìn)行了A52867.2(NRRL 21005)的分類(lèi)學(xué)研究?；谶@些研究，該新微生物被分類(lèi)為該屬的新亞種(菌株)和S.avermitilis種，提議將它們命名為S.avermitilis黑色亞種。這種分類(lèi)基于公開(kāi)說(shuō)明的類(lèi)似物種的實(shí)驗(yàn)室直接分類(lèi)法和檢驗(yàn)法。
使用方法使用由the International Streptomyces Prjeet(ISP)推薦的用于鑒定鏈霉菌屬種的方法來(lái)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)研究[Shirling，E.B.and Gottlieb.D.，“鑒定鏈霉菌屬種的方法”，Int.J.Syst。Bacter-ial，16313-340(1966)]以及被推薦用于鑒定諾卡氏菌種的方法[Gordon R.E.，Barnett，D.A.，Handerhan，J.E.，and Pang，C.H.，“Nocardia Coeliaca，Nocardia antotrophica，and the Nocardin Strain”，Int，I.Syst.Bacteriol.，24(1)54-63(1974)]。
使用ISCC-NBS Centroid Color Charts，標(biāo)準(zhǔn)品No.2106(National Bureau of Standards，1958，U.S.Department of Commerce，Washington，D.C.)來(lái)命名顏色。
用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡(SEM)來(lái)進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。
用Becker等人[“Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper Chromatography of Whole-Cell Hydroly sates”，Appl.Microbiol，12421-423(1964)]和Lecheraliver等人[A University Laboratory Approach，Dietz and Thayer(eds.)，Society for Industrial Microbiology，Special Publication NO.6，Arlington，Virginia，PP.227-233]的色譜法證實(shí)全細(xì)胞水解物中的二氨基庚二酸(DAP)和碳水化合物的異構(gòu)體。
通過(guò)將抗生素敏感盤(pán)置于接種ISP NO.2瓊脂平板上而測(cè)量抗生素抗性。當(dāng)觀察到不存在抑制作用區(qū)時(shí)，則抗性記作(+)，當(dāng)觀察到存在抑制作用區(qū)時(shí)，則抗性記作(-)。
按照Kroppenstedt，R.M.[“Chemical Methods in Bacterial Systematics”，M.Goodfellow and D.E.Minnikin(eds)，PP.173-196(1985)]和Collins，M.D.[id.PP.267-285]的方法確定甲基萘醌類(lèi)組合物。
用HP5898A Microbial Identification System(Miller，L.等人，“Bacterial Identification by Gas Chromatography ofWhole-Cell Fatty Acids”，Hewlett Packard Application Note228-41，PP8(1985)]方法進(jìn)行脂肪酸分析。
脂肪酸甲酯由在相同條件下生長(zhǎng)的凍干的全細(xì)胞制得。
通過(guò)將NaCl加到ISP NO.2瓊脂中以達(dá)到所需濃度來(lái)測(cè)量NaCl耐性。
圖1中所示的樹(shù)狀圖是基于Euclidean距離，并且是由計(jì)算機(jī)作出的。
圖2所示的主要組分分析是二維的，也是由計(jì)算機(jī)作出的。
培養(yǎng)物特征培養(yǎng)物A58267.2在多數(shù)培養(yǎng)基上不能很好地生長(zhǎng)，并且在復(fù)合或限制培養(yǎng)基上不產(chǎn)生氣生菌絲。在Bennetts瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)除了產(chǎn)生特有的黑色色素外，反側(cè)的顏色是黃褐色。在ISP培養(yǎng)基2中產(chǎn)生淡亮褐色可溶顏料，在Bennetts瓊脂中產(chǎn)生帶淡紅褐色的可溶色素。表一表示了這些培養(yǎng)物的特征。
表1 A58267.2[1]的培養(yǎng)物特征培養(yǎng)基 生長(zhǎng) 反側(cè) 氣生 氣生 可溶性狀況 顏色 生長(zhǎng) 顏色 色素ISP培養(yǎng)基2 好 80.gy.yBr. 無(wú) 無(wú) 淡褐ISP培養(yǎng)基3 不好 78.d.yBr. 無(wú) 無(wú) 無(wú)ISP培養(yǎng)基4 一般 93.y.Gray 無(wú) 無(wú) 無(wú)ISP培養(yǎng)基5 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)ATCC培養(yǎng)基172 無(wú) 78.d.yBr 無(wú) 無(wú) 無(wú)
Bennetts瓊脂 豐富 65.br.Blk 無(wú) 無(wú) 淡紅-褐蘋(píng)果酸鈣 不好 90.gy.Y. 無(wú) 無(wú) 無(wú)棉籽瓊脂 一般 91.d.gy.Y 無(wú) 無(wú) 無(wú)察氏(Czapeks) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)培養(yǎng)基葡糖-天冬酰胺 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)甘油-甘氨酸 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)腐殖酸瓊脂 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)NPBM[2]豐富 78.d.yBr 無(wú)無(wú) 無(wú)營(yíng)養(yǎng)瓊脂 不好 91.d.gy.Y 無(wú) 無(wú) 無(wú)淀粉酪蛋白瓊脂 一般 91.d.gy.Y 無(wú) 無(wú) 無(wú)蕃茄漿燕麥粉 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)自來(lái)水瓊脂 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú)酵母-葡萄糖瓊脂 豐富 90.gy.Y. 無(wú) 無(wú) 淡紅-褐[1]在30℃培育18天。NPBM＝Nutrisoy粉5gm，花生粉5gm，黑舌葉糖蜜5gm，酒糟5gm，麥片5gm，甘油1gm，馬鈴薯糊精50gm，查貝克氏無(wú)機(jī)物混合物2ml，去離子水1升。
形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)物A58267.2不產(chǎn)生氣生菌絲。因此，不必進(jìn)行形態(tài)學(xué)和孢子表面的研究。沒(méi)有觀察到孢子囊、游動(dòng)細(xì)胞或鞏膜。培養(yǎng)物A58267.2在固體或液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)期間內(nèi)不分裂。
生理學(xué)特征培養(yǎng)物A58267.2利用下述的碳水化合物與ISP培養(yǎng)基9一起作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基D和L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、甘油、糖原、異-肌醇、菊粉、D-麥芽糖、D-甘露醇，D-甘露糖、蜜二糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、D-核糖、海藻糖、木糖醇和D-木糖。培養(yǎng)物A58267.2不能使用下述碳水化合物與ISP培養(yǎng)基9一起作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基阿東糖醇、纖維素、糊精、半乳糖醇、乙醇、異-赤蘚糖醇、D-乳糖、松三糖、a-甲基-D-葡萄糖苷、水楊苷、山梨醇、L-山梨糖和蔗糖。
A58267.2分解腺嘌呤、蘋(píng)果酸鈣、酪蛋白、淀粉和脲。
A58267.2產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、H2S和液化的明膠，并在50℃下能存活8小時(shí)。A58267.2對(duì)NaCl的耐性高達(dá)6%。
A58267.2能水解尿囊素、彈性蛋白、七葉苷、鳥(niǎo)嘌呤、馬尿酸鹽、次黃嘌呤、睪酮、L-酪氨酸、或黃嘌呤。它不產(chǎn)生類(lèi)黑素色素、還原硝酸鹽、或產(chǎn)生磷酸酶，并且在50mg/ml的濃度時(shí)對(duì)溶菌酶也不具有抗性。
培養(yǎng)物A58267.2對(duì)2μg(微克)林肯霉素、30μg萘啶酮酸、10單位青霉素G、300單位多粘菌素B、和5μg三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。A58267.2對(duì)10單位桿菌肽、30μg頭孢金素、30μg氯霉素、15μg紅霉素、10μg慶大霉素、30μg新霉素、30μg新生霉素、15μg夾竹桃霉素、5μg利福平、10μg鏈霉素、30μg四環(huán)素、10μg妥布霉素以及30μg萬(wàn)古霉素敏感。
培養(yǎng)物A58267.2在15-37℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。適宜的生長(zhǎng)溫度為約30℃。
細(xì)胞壁分析親株A58267.21的細(xì)胞壁分析表明水解的全細(xì)胞含有LL-二氨基庚二酸(DAP)。存在于全細(xì)胞萃取物中的糖是葡萄糖和核糖。脂肪酸類(lèi)型是2C，而主要的甲基萘醌類(lèi)是MK-9(H6)。該檢測(cè)表明是鏈霉菌屬的典型細(xì)胞壁類(lèi)型，并預(yù)期類(lèi)似于A58267.2菌株。
菌株A58267.2的特性認(rèn)為培養(yǎng)物A58267.2具有類(lèi)型I細(xì)胞壁，NC型全糖結(jié)構(gòu)，以及主要是MK-9(H6)的甲基萘醌類(lèi)組成。A58267.2的這些化學(xué)分類(lèi)學(xué)特性以及培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征支持了將該分離菌鑒定為鏈霉菌屬的觀點(diǎn)[見(jiàn)Lechevalier等人，“Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes，Int.J.Syst.Bacteriol.，20;435-443(1970)]。
盡管S.avermitilis的11個(gè)菌株已公開(kāi)在ATCC“Catalogue of Bacteria and Bacteriophages”(18 th edition(1992))中，通過(guò)該文獻(xiàn)，S.avermitilis ATCC 31267已被鑒定為11個(gè)菌株中的10個(gè)直接或間接的親株。當(dāng)ATCC 31267(A54508)不是直接親株時(shí)，則為第一代子代，ATCC 31272(A54508.3)，通常是直接親株。文獻(xiàn)中對(duì)ATCC 31267或31272的子代的描述說(shuō)明該子代通常具有親株的特征，但含有某些次要的區(qū)別特征(見(jiàn)例如在EP 276131中對(duì)ATCC 53567和53568的分類(lèi)學(xué)描述)。因此，選擇除一個(gè)已知的S.avermitilis菌株、ATCC 31267/A54508，以及一個(gè)其首次產(chǎn)生的子代(ATCC 31272/A54508.3)之外的全部的直接或間接親株作為與ATCC21005(A58267.2)菌株相比較的菌株。
在一種高確定性比較中，對(duì)A58267.2、A54508和A54508.3進(jìn)行脂肪酸分析。表2表明了在每種菌株中測(cè)得的特性脂肪酸百分?jǐn)?shù)比較結(jié)果。
表2 A58267.2與兩種S.avermitilis菌株的脂肪酸成分脂肪酸 A58267.2 A54508 A54508.314:0異(異豆蔻酸) 3.36 7.95 4.6715:0異 22.30 11.11 11.2415:0反異 19.29 21.41 22.9915:0(十五烷酸) 2.45 2.08 2.1716:1異H 4.23 4.68 1.9616:0異(異十六烷酸) 14.02 19.85 16.4316:1順9(棕櫚油酸) 3.93 3.31 2.8216:0(十六烷酸) 4.53 3.26 5.1417:1異下 7.57 6.07 6.2717:1反異C 3.42 3.56 3.0717:0異(I異十七烷酸) 5.51 5.12 7.8317:0反異 5.88 8.23 11.931.在28℃細(xì)胞于TSB(胰骯酶大豆肉湯)中生長(zhǎng)4天。
圖1示出了計(jì)算機(jī)作出的由脂肪酸外形構(gòu)成的樹(shù)狀圖。該樹(shù)狀圖表明了A58267.2與其他S.avermitilis菌株之間的相互關(guān)系，以Euclidean距離表示。相關(guān)度低于10.00的培養(yǎng)物被認(rèn)為是同類(lèi)，即同種。A58267.2以相關(guān)度高于10.00的水平與S.avermitilis相關(guān)。
主要組分的分析是多變量統(tǒng)計(jì)的部分，這涉及一系列變量間內(nèi)在的相互關(guān)系。在這種分析中，在原始數(shù)據(jù)或試驗(yàn)結(jié)果中最大的變量為主要的組分[Alderson，G.“The Application and Relevance of Nonhierarchic Methods in Bacterial Taxonomy”，in Comp-uterassisted Baeterial Systematics，Goodfellow，M.，et al.，(eds)，Academic Press，New York(1985)]。因此，可以繪制表示分布或變化的曲線。然后通過(guò)檢驗(yàn)這些變量即可評(píng)價(jià)相互關(guān)系，這樣，一種微生物種群被鑒定。繪制了基于脂肪酸的兩維的主要組分曲線，它表明了培養(yǎng)物A58267.2及其親株A58267.21與其它S.aver-mitilis種之間的相互關(guān)系。這些數(shù)據(jù)示于圖2中。
在樹(shù)狀圖和主要組分曲線兩者中，形成了兩種不同的叢群。A58267.2和A58267.21形成一群，而A54580和A5458.3形成另一群。這兩個(gè)群非常類(lèi)似，足以表明在該兩個(gè)群中的菌株是相關(guān)的，但也存在明顯的區(qū)別，表明無(wú)論從群或各個(gè)菌株都是不相同的。
A58267.2和A54840.3之間的差別的研究示于表3中。
表3 S.avermitilis菌株A58267.2和A54580.3之間的差別特征 A58267.2 A54580.3氣生孢子的產(chǎn)物 - -在蘋(píng)果酸鈣瓊脂上生長(zhǎng) - +在Bennetts瓊脂上反側(cè) 黑色 褐色色素的產(chǎn)生在酵母葡萄糖瓊脂上可溶 + -
性色素的產(chǎn)生抗生素抗性:
林肯霉素 + -多粘菌素B + -在7%NaCl中生長(zhǎng) - +分解:
七葉苷 - +馬尿酸鹽 - +次黃嘌呤 - +黃嘌呤 - +溶菌酶抗性50μg/ml - +類(lèi)黑素色素產(chǎn)生 - +硝酸鹽還原性 - +蜜三糖產(chǎn)生的酸產(chǎn)物 + -脂肪酸成分%:
15:0異 22.30 11.2415:0反異 19.29 22.9916:1異H 4.23 1.9616:0異 14.02 16.4317:0異 5.51 7.8317:0反異 5.88 11.93如前面所指出的，在S.avermitilis菌株A58267.2和A54508/A54508.3之間沒(méi)有足夠差別以將A58267.2確定為一單獨(dú)的種。但是，在這些菌株之間存在足夠的差別以將A58267.2確定為一種不同的和獨(dú)立的已知的S.avermitilis的亞種(菌株)。因此，將A58267.2確立為S.avermitilis的亞種，并分類(lèi)為S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。該亞種名稱(chēng)“黑色”指在Bennetts瓊脂上所呈現(xiàn)的特殊顏色。
此外，本發(fā)明提供了制備一種或多種阿凡曼菌素的方法，該方法包括在浸沒(méi)的需氧條件下在含有碳、氨和無(wú)機(jī)鹽的可同化源的水液培養(yǎng)基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其可產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產(chǎn)生一種或多種阿凡曼菌素，并收集。可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種分離和純化方法來(lái)收集所產(chǎn)生的阿凡曼菌素。
與其它微生物的情況相同，本發(fā)明中產(chǎn)生阿凡曼菌素的培養(yǎng)物，S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的特征也是易發(fā)生變化的。用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法可以得到該菌株的突變體，例如用各種物理的和化學(xué)的誘變劑如紫外線、X-射線、ㄚ-射線和化學(xué)物質(zhì)如n-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍進(jìn)行處理。用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法也可得到該菌株的天然的變異體，例如，篩選親株的培養(yǎng)物。保持產(chǎn)生阿凡曼菌素特征的S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的天然變異體和誘發(fā)突變體也是本發(fā)明的一部分。
用于生長(zhǎng)本發(fā)明S.avermitilis培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以是眾多培養(yǎng)基中的任何一種。因此，例如，在大規(guī)模發(fā)酵中優(yōu)選的碳水化合物源是葡萄糖、甘露糖以及特別是蕃茄糊精。但是，也可使用其他的碳水化合物，如核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露醇等。
優(yōu)選的氮源是大豆粉，盡管酶或酸水解的酪蛋白、酵母、肝粉、肉胨、魚(yú)粉等也是有用的。
可以摻入培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)的無(wú)機(jī)鹽包括能提供鋅離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、銨離子、鹽酸根離子、碳酸根離子、硫酸根離子、硝酸根離子等離子的常用的可溶性鹽。
在培養(yǎng)基中還應(yīng)有生物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的微量元素。這種微量元素通常以混雜物形式存在于培養(yǎng)基的其他組分中，其量足以滿(mǎn)足生物生長(zhǎng)所需。如果出現(xiàn)起泡問(wèn)題，需要時(shí)可在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基中加入少量(如0.2gm/L)泡沫抑制劑，如分子量約2000的聚丙二醇。
培養(yǎng)基組分的優(yōu)選濃度的例子示于下面的實(shí)施例1中。
制備大量的阿凡曼菌素，優(yōu)選在罐中進(jìn)行浸沒(méi)需氧發(fā)酵。少量的A58267.2培養(yǎng)物可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)得到。因?yàn)樵诎⒎猜刂苽溥^(guò)程中時(shí)間的延遲通常與在大罐中孢子形生物的接種有關(guān)，所以應(yīng)優(yōu)選地使用營(yíng)養(yǎng)種菌。通過(guò)在少量的培養(yǎng)基上接種孢子形成物或菌絲體的片段可以制得營(yíng)養(yǎng)種菌，得到新鮮的、有活性的該生長(zhǎng)培養(yǎng)物。然后將該營(yíng)養(yǎng)種菌轉(zhuǎn)移到較大容器中，開(kāi)始阿凡曼菌素的制備階段。該營(yíng)養(yǎng)種菌培養(yǎng)基可以與用于較大量發(fā)酵過(guò)程的相同，但其他的培養(yǎng)基也是適宜的。
本發(fā)明的制備中，由A58267.2生物制備阿凡曼菌素。在約15℃至37℃之間生長(zhǎng)。制備阿凡曼菌素最佳的溫度是約29℃至31℃。
如同通常的浸沒(méi)需氧培養(yǎng)方法，從容器的底部通入無(wú)菌的空氣，而同時(shí)該培養(yǎng)基用通用的葉輪攪拌機(jī)攪拌。在該條件下發(fā)酵過(guò)程中最大的氧吸收量至此不會(huì)超過(guò)約0.16mM/L/分鐘。在一全部擋板的115升發(fā)酵罐中含有約107升的液體培養(yǎng)基，通氣速度和攪拌速度在容器內(nèi)壓為5.0大氣壓下應(yīng)足以保持溶解的氧至少為45%的空氣飽和度。
在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)用各種方法(如HPLC)對(duì)液體培養(yǎng)基的試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照來(lái)進(jìn)行阿凡曼菌素的制備。
在浸沒(méi)需氧發(fā)酵條件下制備之后，用發(fā)酵技術(shù)中已知的方法從該發(fā)酵培養(yǎng)基中收集阿凡曼菌素。通常，在A58267.2培養(yǎng)物或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或異變體的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的阿凡曼菌素存在于過(guò)濾的液體培養(yǎng)基和特別是存在于菌絲體物質(zhì)中。因此，如果將avermectins直接喂給動(dòng)物，則可將全部發(fā)酵液體培養(yǎng)基干燥并與喂這種動(dòng)物的食物摻在一起。
更為優(yōu)選的是，將avermectins從全部發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離出來(lái)，分離的avermectin化合物的收集可用溶劑萃取并應(yīng)用色譜來(lái)進(jìn)行分級(jí)分離，這可使用各種色譜技術(shù)和溶劑體系。分離和收集阿凡曼菌素的技術(shù)在US 4，429，042，以及Miller，T.W.，等人的文章[Antimicrob，Agents Chemother.，15(3)368-371(1979)]中已有描述。優(yōu)選的用于這種分離和收集的技術(shù)在下面實(shí)施例中說(shuō)明。
制得并分離出的阿凡曼菌素特別適用于治療被寄生蟲(chóng)感染的動(dòng)物，并且特別適于用作驅(qū)腸蟲(chóng)劑、殺蟲(chóng)劑和殺螨劑。這種抗寄生蟲(chóng)的用途在動(dòng)物保健領(lǐng)域中是公知的并且有文獻(xiàn)記載(見(jiàn)US 4，429，042和4，310，519)。
另外，ivermectin，一種已知的還原的avermectin Bla和Blb結(jié)合體的衍生物，可任選地用Chabula等人在US 4，199，569中所述方法制得，該專(zhuān)利作為參考而引入本文。
為了更完整地說(shuō)明本發(fā)明的操作過(guò)程，提供了如下的實(shí)施例。但是，這些實(shí)施例在任何方面均不試圖并也不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
在下面實(shí)施例中，在氘化氯仿溶液中，阿凡曼菌素化合物A1a，A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b的13C核磁共振譜數(shù)據(jù)是由General Electric Model QE 300光譜儀(Fremont，CA)而得到的。每個(gè)樣品溶液的體積約為0.7ml。對(duì)于每種avermectin化合物相對(duì)氘化氯仿的化學(xué)位移以ppm給出(77 ppm)。用2ABII-SE分光計(jì)(VG Analgtical，Manchester，Engtand)得出FABMS數(shù)據(jù)。
實(shí)施例1A58267.2的發(fā)酵A、搖瓶使用保存在液氮中的培養(yǎng)物S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005接種于(0.5ml)具有下列成分的第一階段營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分 含量(g/l)胰酶鮮酪蛋白大豆液體培養(yǎng)基 30.0酵母萃取物 3.0MgSO4.7H2O 2.0葡萄糖 5.0麥芽糖 4.0去離子水加至到50ml未調(diào)節(jié)的pH＝7.0;在滅菌處理后不調(diào)節(jié)pH;
滅菌處理后的pH＝6.9。
該接種的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基在250ml廣口錐形瓶中于30℃培育約46小時(shí)，以250 rpm以2英寸(5.08cm)的圓周軌跡搖動(dòng)。該瓶用兩張生物保護(hù)濾紙防護(hù)，該振蕩器的置放板(board)角度為0°。
B、A58267.2的罐發(fā)酵為了提供更大體積的種菌，將上面A節(jié)中所制得的10ml已接種的第一階段培養(yǎng)基用于接種與第一階段培養(yǎng)基具有相同組成的400ml第二階段營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。該第二階段培養(yǎng)基在2L廣口錐形瓶中于30℃培育約48小時(shí)，以250 rpm以2英寸(約5.08cm)的圓周軌跡搖動(dòng)。該瓶也用兩張生物保護(hù)濾紙防護(hù)，該振蕩器的置放極角度為0°。
將該第二階段營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(400ml)用于接種具有下面組成的107L無(wú)菌制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基成分 含量(/L)大豆粉 5.0g蕃茄糊精 80.0g嫩燕麥粉 5.0g廢糖蜜 5.0gCaCO32.0g甘油 1.0mlCzapek′s Mineral Stock 2.0ml去離子水加到107L。
未調(diào)節(jié)的pH＝6.5，約用30 ml 5N NaOH將pH調(diào)到7.3，滅菌后PH＝7.0。
加入抑泡劑SAG 471，濃度為0.2mg/l(Union Carbide Sistersville，West Virginia)。
在30℃溫度下將制種的制備培養(yǎng)基在115L無(wú)菌發(fā)酵罐中發(fā)酵10天和11天之間。保持溶解的氧量為約45%空氣飽和度，在攪拌的容器中攪拌速度是低的(約137～約255rpm)。
實(shí)施例2阿凡曼菌素的一般分離用5N HCl將115L按類(lèi)似實(shí)施例1所述方法制得的全部發(fā)酵液體培養(yǎng)基調(diào)至pH6.5。將等體積的甲醇加到該溶液中，并經(jīng)過(guò)Membr-alox陶瓷過(guò)濾器(U.S.Filter/SCT，Bazet，F(xiàn)rance)過(guò)濾該溶液。然后將濾液經(jīng)過(guò)含10 L HP-20SS(Diaion)的柱(Mitsubishi Chemical Industries Ltd，Tokyo，Japan)。接著用線性梯度的50～100%甲醇水溶液洗脫該柱。用含Dynamax C18的4.6mm(直徑)×30cm的柱子(Rainin Company，Woburn，MA)通過(guò)HPLC來(lái)分析搜集的洗脫液。用常液梯度的MeOH∶CH3CN∶(0.2% HOAC，用NaOH調(diào)至pH 5.0)(44∶44∶12)洗脫該柱，流速為1.5ml/分鐘?；谠揌PLC分析將洗液合成兩份。在減壓下將每份濃縮至約500ml。用CHCl3將每份萃取，將萃取物蒸發(fā)，產(chǎn)出18.25g的油(份A)和6.48g的油(份B)。
實(shí)施例3份A的處理將由實(shí)施例2得到的份A(18.25g)溶于45ml甲醇中，并在5cm(直徑)×1.1m的含Sephadex LH-20的柱上(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)色譜分離。用甲醇洗脫該柱并用HPLC分析洗脫液。將含有阿凡曼菌素的那些洗脫液合并成兩份并蒸發(fā)則產(chǎn)出份C(10.96g)和份D(1.45g)。
實(shí)施例4份C的處理將份C(由實(shí)施例3得出，2g)物質(zhì)溶于4.5ml甲醇中并用41.4mm(直徑)×25cm的含有Dynamax-60AC18的柱(Rainin，Woburn，Massachusetts)作色譜分離。在100分鐘內(nèi)，用線性梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O(40∶40∶20至46∶46∶8)洗脫該柱，流速為15ml/分。基于HPLC制得4份份E(489 mg)，份F(624 mg)，份G(656 mg)，以及份H(177 mg)。
實(shí)施例5阿凡曼菌素Ala的分離將由實(shí)施例2得到的份B溶于30ml甲醇中并如實(shí)施例3中所述進(jìn)行色譜分離。用甲醇洗脫該柱并用HPLC分析該洗脫液。將含有阿凡曼菌素的那些洗脫液合并，蒸發(fā)得殘余物(658 mg)。將殘余物的一部分(200 mg)作色譜分析，用2.5cm(直徑)×30cm的含Chromegabond MC18的柱(ES Industries，Berlin，New Jersey)，使用梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O(40∶40∶20～42∶40∶16)以5ml/分流速洗脫90分鐘以上。該方法得出63mg的阿凡曼菌素Ala。MS∶FAB m/z＝909[AverAla+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ11.96，12.88，15.03，16.30，17.62，18.32，19.82，20.18，27.44，30.50，34.18，34.43，35.13，36.52，39.66，40.41，45.61，56.32，56.41，57.69，67.18，68.07，68.15，68.32，74.83，76.01，76.89，77.41，78.15，80.43，80.50，81.92，118.25，118.31，119.58，124.79，135.10，135.98，136.08，137.58，139.85，173.81，94.88，98.44，68.33，127.74.
實(shí)施例6阿凡曼菌素A2a和B1b的分離將由實(shí)施例4得到的份F物質(zhì)溶于2.5ml甲醇中并用實(shí)施例4中所述的柱色譜分離。使用MeOH∶H2O(85∶15)常液以15ml/分流速洗脫該柱，得出純的阿凡曼菌素A2a。
MSFAB m/z＝927[AverA2a+Na]+;13CNMR(75 MHz，CDCl3)δ173.4，139.83，137.48，135.79，135.60，124.80，119.65，118.43，117.47，99.56，98.41，94.78，81.67，80.50，80.36，79.24，78.15，77.50，76.80，75.90，70.67，69.79，68.25，68.12，68.06，67.55，67.18，57.60，56.38，45.54，41.06，40.70，39.62，36.27，35.61，35.04，34.41，34.26，34.07，27.18，20.20，19.86，18.31，17.65，15.06，13.72，12.37，11.75;and avermectin Blb(79mg)MSFAB m/z＝881［AverBlb+Na]；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ173.56，139.54，137.95，137.80，135.97，135.07，127.72，124.70，120.31，118.28，118.00，98.43，95.63，94.88，81.83，80.38，80.32，79.32，79.22，78.22，77.26，75.96，68.32，68.28，68.24，68.10，67.67，67.21，56.46，56.36，45.66，40.45，39.72，36.63，34.52，34.22，30.88，28.31，21.03，20.18，19.88，18.37，17.68，16.51，15.08，14.86.
實(shí)施例7阿凡曼菌素A1b和B1a的分離將由實(shí)施例4中得到的份G物質(zhì)溶于3ml CH3CN中并用含Chromegabond C18的2.5cm(直徑)×30cm的柱(ES Industries，Berlin，New Jersey)作色譜分離，以5ml/分鐘流速在三個(gè)分離的中用線性梯度的CH3CN∶H2O(73∶27至80∶20)洗脫100分鐘以上，則得出純的阿凡曼菌素。
MSFAB m/z＝895［AverA1b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.39，139.61，137.35，135.60，134.87，127.58，119.45，118.29，118.07，98.22，94.41，94.69，81.68，80.29，80.22，79.10，77.99，77.28，77.00，76.65，75.73，68.08，68.05，67.91，66.98，57.43，56.21，56.18，45.39，40.24，39.45，36.36，34.30，34.05，30.65，28.09，20.82，20.03，19.66，18.15，17.48，16.31，14.87，14.64，124.63;and avermectin Bla(245mg)MSFAB m/z＝895[AverBla+Na]；13c NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.40，139.53，137.84，137.70，136.08，135.08，127.74，124.69，120.23，118.23，117.94，98.42，95.69，94.87，81.69，80.23，80.15，79.13，78.05，75.69，74.61，68.12，68.03，67.93，67.46，67.01，56.26，56.17，45.43，40.28，39.51，36.33，34.93，34.23，34.05，30.32，27.25，19.99，19.66，18.14，17.50，16.15，14.85，12.74，11.81.
實(shí)施例8阿凡曼菌素A2b、B2a和B2B的分離將由實(shí)施例4得到的份E物質(zhì)溶1.9ml CH3CN中并在實(shí)施例7中所述的柱上進(jìn)行色譜分離。在100分鐘內(nèi)以5ml/分的流速用線性梯度的CH3CN∶H2O(65∶35至75∶25)洗脫該柱兩次，則得出純阿凡曼菌素MSFAB m/z＝913[AverA2b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.60，139.83，137.47，135.92，135.54，124.75，119.52，118.21，117.44，99.53，98.37，94.69，81.53，80.43，80.30，79.21，78.10，77.34，76.81，75.92，72.24，69.75，68.24，68.10，68.05，67.45，67.14，57.65，56.38，56.31，45.52，40.99，40.63，39.60，36.37，35.95，34.47，34.14，27.86，20.68，20.16，19.80，18.29，17.59，15.05，13.85，13.55;avermectic B2a(125mg);MSFAB m/z＝913[AverB2a+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.63，139.68，138.01，135.62，～135，124.72，120.34，117.92，117.54，99.63，98.47，94.77，81.55，80.35，79.31，79.08，78.17，76.07，72.35，69.86，68.43，68.32，68.10，67.68，67.51，67.25，～56.3，～56.3，45.67，41.11，40.72，39.75，36.55，36.07，34.57，34.24，34.17，34.17，27.96，20.80，20.21，19.97，18.41，17.68，15.17，13.95，13.67;and avermectin B2b(145mg);MSFAB M/Z＝899[AverB2b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.09，139.44，137.65，137.57，135.44，124.50，120.90，117.76，117.34，99.41，98.26，94.63，81.47，80.19，79.20，79.10，78.04，75.72，70.57，69.66，68.10，68.03，67.97，67.45，67.36，67.05，56.28，56.24，45.45，40.57，39.52，36.17，35.46，34.90，34.26, 34.09，33.91，27.04，20.00，19.69，18.16，17.51，14.91，13.56，12.33，11.59.
權(quán)利要求
1.一種生物純的微生物Streptomyces avermitilis黑色亞種NRRL 21005培養(yǎng)物，或者其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)物是Streptomyces avermitilis黑色亞種NRRL 21005。
3.一種制備至少一種阿凡曼菌素化合物的方法，該方法包括在浸沒(méi)需氧條件下，在含有碳、氮和無(wú)機(jī)鹽的可同化源的水液培養(yǎng)基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產(chǎn)生至少一種阿凡曼菌素化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的阿凡曼菌素化合物選自A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a和B2b。
5.權(quán)利要求3的方法，其中使用S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。
6.權(quán)利要求3的方法，它還包括另一個(gè)從所述培養(yǎng)基中收集所述的一種或多種阿凡曼菌素的步驟。
7.一種制備ivermectin的方法，該方法包括在浸沒(méi)需氧條件下，在含有碳、氮和無(wú)機(jī)鹽的可同化源的水液培養(yǎng)基中培育S.avermit-ilis黑色亞種NRRL 21005，或其產(chǎn)生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至阿凡曼菌素化合物B1a和B1b產(chǎn)生，并還原所述的B1a和B1b化合物。
全文摘要
提供了一種新的微生物，Streptomycesavermitilis黑色亞種NRRL 21005，以及使用該微生物制備已知的阿凡曼菌素和ivermectin的方法。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK1088983SQ9311529
公開(kāi)日1994年7月6日 申請(qǐng)日期1993年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月30日
發(fā)明者羅塞尼·邦茹克廉, 小奧迪斯·韋伯斯特·戈福雷, 蒂姆·阿蘭·斯密卡, 雷蒙德·姚 申請(qǐng)人:伊萊利利公司