專利名稱：一種檢測膜聯(lián)蛋白a3表達(dá)水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及化療藥物耐藥性領(lǐng)域，具體地，涉及如下方面一種檢測鉬類化 療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)表達(dá)水平的方法、一種調(diào)節(jié) 腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法、一種評估腫瘤患者對鉬類化療藥物耐藥性的方法、一 種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法、一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中 DNA與鉬結(jié)合的方法、以及一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始終徘徊在 15%-20%，腫瘤細(xì)胞對于鉬類化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成這一狀況的主要原因之一。鉬類 化療藥物包括順鉬、卡鉬、草酸鉬、奈達(dá)鉬、樂鉬等，是目前最常用的治療卵巢癌的一線化療 藥物，也是治療其它實體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管 癌等的常用藥物。鉬類化療藥物與DNA結(jié)合形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不能再復(fù)制，高濃度時 也能抑制RNA及蛋白質(zhì)的合成。但是，鉬類化療藥物在治療上述實體腫瘤時，均出現(xiàn)了耐藥 現(xiàn)象，即治療初期對于腫瘤控制良好而治療后期便出現(xiàn)復(fù)發(fā)或治療初期就無反應(yīng)。對于卵巢癌對鉬類化療藥物的耐藥，臨床上已有明確的認(rèn)識和定義。同時，對于順 鉬耐藥機(jī)制的研究也取得了一定的成果，如MDR-1，LRP-I, MRP-I, GST-pi等已成為眾所周 知的耐藥相關(guān)基因。但眾多的研究結(jié)果表明，多種耐藥相關(guān)基因在卵巢癌中的表達(dá)并不能良好地預(yù) 測腫瘤地耐藥和預(yù)后，mRNA的豐度與其相應(yīng)的蛋白水平具有不一致性可能是主要原因之 一。DNA是遺傳信息的承載者，蛋白質(zhì)才是功能的執(zhí)行者。本發(fā)明人通過比較蛋白質(zhì)組學(xué) 技術(shù)，對鉬類化療敏感細(xì)胞和其對應(yīng)的鉬類化療耐藥細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了比較，并 發(fā)現(xiàn)了 5種鉬類化療耐藥相關(guān)蛋白，它們分別是膜聯(lián)蛋白A3 (Armexin A3)、IDHc, cofilin 1、GST01-1、destrin，并通過RT-PCR和Western blot技術(shù)對鉬類化療耐藥和敏感細(xì)胞在 RNA 和蛋白質(zhì)水平分別進(jìn)行了驗證(Yan XD, Pan LY, et al. J Proteome Res. 2007,6(2) 772-780)。根據(jù)5種蛋白的差異程度，選擇差異最為明顯的膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行相關(guān)的鉬類耐 藥機(jī)制探討實驗，腫瘤細(xì)胞優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。膜聯(lián)蛋白A3是armexin超家族中的一員，具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能，它 還可以切斷 inositol 1,2-cyclic phosphate 形成 inositol 1-phosphate，在控制細(xì)胞增 殖方面發(fā)揮作用(Ross TS, etal. J Biol Chem. 1991，266 (14) :9086_9092.)。膜聯(lián)蛋白 A3 在一定Ca2+濃度下能夠結(jié)合到囊泡的磷脂酰絲氨酸上，介導(dǎo)吞噬體與溶酶體的融合和顆粒 消失等膜與膜之間的作用。做為鈣連接蛋白，膜聯(lián)蛋白A3具有一系列的胞內(nèi)外功能，包括 膜轉(zhuǎn)運(yùn)、淋巴細(xì)胞遷移、細(xì)胞運(yùn)動、鈣流出和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。高豐量的膜聯(lián)蛋白A3產(chǎn)生鈣依賴的 膨脹小泡結(jié)合陰性帶電膜磷脂是膜聯(lián)蛋白A3的重要功能之一(Gerke V,MossSE. Physiol. Rev. 2002,82 331-371)。
—系列的實驗表明，膜聯(lián)蛋白A3是卵巢癌鉬類化療藥物化療耐藥的機(jī)制之一。本 發(fā)明人通過實驗手段降低卵巢癌細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)，卵巢癌對鉬類化療藥物敏感 性增加；反之，如果提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)，卵巢癌對鉬類化療藥物敏感性 降低。這一實驗結(jié)果在人卵巢癌組織和動物實驗體內(nèi)都得到了有效的驗證(YanXD，Pan LY, et al.J Proteome Res.2007,6(2) :772_780 ；XuedongYan,Jie Yin,Huiyu Yao，Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. CancerRes，2010，70(4) :0F1_9.)。此外，在大約三分之二的結(jié)腸癌患者的癌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)高水平的膜聯(lián)蛋白A3集中 在膜結(jié)合區(qū)域(Madoz-Gurpide J, Lopez-Serra P, etal. Mol Cell Proteomics. 2006,5 1471-1483)。最近，在不同期別的前列腺癌患者的尿液中，用Western blot方法可以檢測 出變化含量的膜聯(lián)蛋白A3，并與現(xiàn)在臨床所用的特異性標(biāo)記物前列腺特異性抗原做比較， 發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3在早期提示前列腺癌更具優(yōu)勢。綜上所述，膜聯(lián)蛋白A3具有成為人類腫瘤標(biāo)志物的希望?；谀ぢ?lián)蛋白A3與鉬 類化療藥物耐藥的相關(guān)性，本發(fā)明意在通過人體液中膜聯(lián)蛋白A3的水平來臨床評估腫瘤 鉬類化療藥物敏感性，這在腫瘤化療耐藥領(lǐng)域尚屬首次。鑒于目前臨床上缺乏能夠提早預(yù)示腫瘤鉬類化療藥物的蛋白標(biāo)志物，為充分發(fā)揮 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)優(yōu)勢，本發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3這一鉬類化療藥物耐藥相關(guān)蛋白基礎(chǔ)之上，進(jìn) 一步通過實驗肯定了其鉬類化療藥物耐藥特異性標(biāo)志物的地位，并探討了其導(dǎo)致鉬類化療 藥物耐藥的分子機(jī)制。同時在發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞(例如卵巢癌細(xì)胞)分泌膜聯(lián)蛋白A3的現(xiàn)象 基礎(chǔ)之上進(jìn)一步探尋其外泌途徑，并通過構(gòu)建特異性檢測人類膜聯(lián)蛋白A3蛋白的酶聯(lián)免 疫吸附實驗方案，成功地在卵巢癌患者血清中檢測出膜聯(lián)蛋白A3的存在，并在此基礎(chǔ)上， 評估了卵巢癌鉬類化療藥物耐藥患者血清中膜聯(lián)蛋白A3水平和卵巢癌鉬類化療藥物敏感 患者血清中膜聯(lián)蛋白A3的水平差異。通過大量的臨床樣本證明，血清中高水平的膜聯(lián)蛋白 A3能夠準(zhǔn)確地預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的發(fā)生。及早地發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥，能夠及時地 改變腫瘤治療方案，提高5年生存率，改善預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供一種檢測膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法，所述方法使用 鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清作為被檢測的樣品。其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物為順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并且更優(yōu)選為DMEM ；優(yōu)選地，所述檢測優(yōu)選為免疫學(xué) 檢測，并且更優(yōu)選為Westernblot或ELISA檢測。在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)使用Western blot進(jìn)行檢測時，所述方法包括如 下步驟1)收集鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清和鉬類化療藥物敏感的同類型腫 瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清并分別進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)均為75 100倍，得到兩個濃縮液體；2)檢測所述兩個濃縮液體中armenxin A3表達(dá)水平；3)將所述兩個濃縮液體中armenxin A3表達(dá)水平相比較，對鉬類化療藥物耐藥腫 瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平進(jìn)行半定量。本發(fā)明的另一個方面是提供一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物 是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而提高腫 瘤細(xì)胞對鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高 細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所 述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá) 而降低腫瘤細(xì)胞對鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的 反義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)， 更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3的含量。本發(fā)明的又一個方面是提供一種評估腫瘤患者對鉬類化療藥物耐藥性的方法，包 括如下步驟1)檢測患者體液樣品中膜聯(lián)蛋白A3水平；2)若步驟1)中的膜聯(lián)蛋白A3水平高于1. 34ng/ml，判斷腫瘤患者對鉬類化療藥 物耐藥；其中，優(yōu)選地，所述體液為血清；優(yōu)選地，步驟1)中的檢測為ELISA檢測。所述癌 癥是能夠用鉬類化療藥物治療的癌癥，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、 黑色素瘤、食管癌等，優(yōu)選卵巢癌。在本發(fā)明的研究中，本發(fā)明人首次運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測并定量人血清中膜 聯(lián)蛋白A3的含量，同時通過比較鉬類化療藥物耐藥患者和鉬類化療藥物敏感患者血清中 膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平，獲得膜聯(lián)蛋白A3預(yù)示鉬類化療藥物耐藥最佳敏感性和特異性的表 達(dá)水平。建立臨床通過檢測血清膜聯(lián)蛋白A3水平提示鉬類化療耐藥的平臺。首先，通過進(jìn)一步的實驗證明膜聯(lián)蛋白A3是鉬類化療藥物耐藥特異性標(biāo)志蛋白， 并通過細(xì)胞內(nèi)鉬含量的檢測說明膜聯(lián)蛋白A3引起鉬類化療藥物耐藥的機(jī)制可能是通過細(xì) 胞內(nèi)鉬的釋放來實現(xiàn)的。在通過轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3上調(diào)細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平后 的鉬類化療藥物敏感腫瘤細(xì)胞對順鉬的耐藥性增強(qiáng)，但是對紫杉醇和表阿霉素的耐藥性并 改變，這說明膜聯(lián)蛋白A3是鉬類化療藥物耐藥的特異性相關(guān)蛋白，膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平 決定了腫瘤細(xì)胞對鉬類化療藥物的敏感性。一個理想的標(biāo)志物是能夠分泌到外周血或者人 體的其它體液中，便于檢測。本發(fā)明人收集鉬類化療藥物敏感和耐藥腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上 清，檢測腫瘤細(xì)胞是否能夠外分泌膜聯(lián)蛋白A3以及蛋白分泌量的調(diào)節(jié)方式。為避免高豐度 蛋白影響，培養(yǎng)基優(yōu)選無血清培養(yǎng)基。采用離心超濾技術(shù)，將培養(yǎng)基中的液體進(jìn)行濃縮，采 用免疫印記技術(shù)檢測濃縮液中膜聯(lián)蛋白A3含量并進(jìn)行半定量。發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥的 腫瘤細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞)外泌膜聯(lián)蛋白A3的能力明顯強(qiáng)于藥物敏感細(xì)胞。改變膜聯(lián)蛋白 A3外泌量，可以通過改變細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3含量實現(xiàn)。這說明外液中膜聯(lián)蛋白A3水平能 準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平，并且能夠判定細(xì)胞對鉬類化療藥物敏感性。其次，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并驗證了卵巢癌細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3的外泌現(xiàn)象和膜聯(lián)蛋白A3 外泌途徑，而一種好的預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的標(biāo)志物是能夠在人體外分泌的體液或者血 液中以便檢測到這種物質(zhì)，并且這種物質(zhì)在人體液體中的表達(dá)水平與鉬類化療藥物敏感性具有一定的相關(guān)性。使用人類膜聯(lián)蛋白A3酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(ANXA3 ELISAkit)成 功檢測并定量了人血清中膜聯(lián)蛋白A3的含量，正常婦女血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為 0. 859士0. 0744，卵巢癌患者血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為1. 6898士2. 6563，兩組進(jìn)行 Mann-Whitney檢驗，P < 0. 0001。將所有卵巢癌患者分為鉬類化療藥物耐藥組和鉬類化療 藥物敏感組，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為2. 1145 士 3. 3833，敏感組膜聯(lián)蛋白A3平均水 平為1.0528士0. 1178，兩組比較P = 0.0003 < 0.05。當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平大于1. 13ng/ml 時，該蛋白預(yù)測卵巢癌鉬類化療藥物耐藥的敏感性達(dá)到63%，特異性80%。卵巢癌患者血 清全部收集于化療前，未受化療影響，全部卵巢癌患者在術(shù)后都接受了鉬類化療藥物為主 的聯(lián)合化療。綜上，腫瘤患者血清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平能夠很好地預(yù)測卵巢癌患者對鉬 類化療藥物的敏感性。本發(fā)明的又一個方面是提供一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法， 所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療 藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明的又一個方面是提供一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié) 合的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述 鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明的又一個方面是提供以及一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù) 量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述 鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。為了更好地說明腫瘤細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞)能夠持久地外泌膜聯(lián)蛋白A3蛋白，本 發(fā)明申請人運(yùn)用電鏡技術(shù)觀察了膜聯(lián)蛋白A3的外泌途徑。以兩種順鉬耐藥卵巢癌細(xì)胞 SK0V3/Cis和A2780/Cis，兩種順鉬敏感卵巢癌細(xì)胞SK0V3和A2780，兩種轉(zhuǎn)染了膜聯(lián)蛋白 A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)的細(xì)胞SK0V3/Arm和A2780/Arm，兩種轉(zhuǎn) 染了膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)的細(xì)胞SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R為研究對象，運(yùn)用免疫熒光法和免疫電鏡法觀察膜聯(lián)蛋白A3蛋白在細(xì)胞亞微 結(jié)構(gòu)地分布，探討膜聯(lián)蛋白A3外泌途徑。透射電鏡下，觀察上述順鉬敏感和耐藥卵巢癌細(xì) 胞亞微結(jié)構(gòu)，與順鉬敏感細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多的囊泡樣結(jié)構(gòu)，該結(jié) 構(gòu)散在分布于胞漿內(nèi)，表面光滑，不同于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，囊泡內(nèi)也沒有類似線粒體 樣的脊，某些囊泡內(nèi)還存在某些不明的顆粒物質(zhì)，不同于溶酶體內(nèi)的均質(zhì)。延細(xì)胞膜觀察囊 泡，則能觀察到某些囊泡離胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些則已經(jīng)突破胞膜外。運(yùn)用 透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，發(fā)現(xiàn)在 敏感細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前相比胞漿內(nèi)也出現(xiàn)了很多類似順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)的囊泡結(jié)構(gòu)；相反， 轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi) 囊泡則大量減少了，以上說明細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3可以導(dǎo)致胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。運(yùn) 用免疫熒光技術(shù)，特異性的染色上述8種細(xì)胞胞核胞漿內(nèi)的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)卵巢癌 細(xì)胞種膜聯(lián)蛋白A3主要分布于胞漿，少數(shù)分布于胞核，主要還是一種胞漿蛋白。運(yùn)用免疫 電鏡技術(shù)，對膜聯(lián)蛋白A3細(xì)胞分布進(jìn)行亞細(xì)胞器定位，對上述8種細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行 免疫染色，采用膠體金顆粒標(biāo)記膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3大量分布于胞漿內(nèi)膜結(jié) 構(gòu)上，包括透射電鏡下發(fā)現(xiàn)的囊泡的膜表面，同時在個別囊泡，特別是靠近胞膜的囊泡內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3的存在，說明膜聯(lián)蛋白A3通過囊泡的形式外泌。上述的調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法、調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫 瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié)合的方法、以及調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法， 都包括改變腫瘤細(xì)胞中annenxinA3表達(dá)水平的步驟，該步驟可以通過下面的方法實現(xiàn)，例 如通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜 聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3 基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量；或者通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì) 胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞 中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體 來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于如下 癌癥的細(xì)胞，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的細(xì) 胞，優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述鉬類化療藥物包括但不限于 順鉬、卡鉬、草酸鉬、奈達(dá)鉬、樂鉬等，優(yōu)選的是順鉬。在本發(fā)明中，術(shù)語“耐藥細(xì)胞”是指相對于同類親本細(xì)胞，不易接受一些刺激而發(fā) 生相應(yīng)改變的細(xì)胞。本發(fā)明中對應(yīng)為不易接受鉬類化療藥物刺激發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“敏感細(xì)胞”是指容易接受一些刺激而發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。本 發(fā)明中對應(yīng)為易對鉬類化療藥物刺激發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“耐藥性”是指隨時間延長藥物效果降低，或者需加大劑量才能 保證藥效不減。本發(fā)明指細(xì)胞對鉬類化療藥物的耐藥性，通常用藥物半數(shù)致死量(IC50)和 耐藥指數(shù)(RI)來表示。在本發(fā)明中，對于術(shù)語“敏感性”，當(dāng)與特異性相提時或者作為統(tǒng)計學(xué)上的概念時， 是指化驗檢查結(jié)果為“真陽性”的百分率；其它情況則指與“耐藥性”相對的概念。在本發(fā)明中，術(shù)語“特異性”是指化驗檢查結(jié)果為“真陰性”的百分率。在本發(fā)明中，如果沒有特殊說明，SK0V3和A2780為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SK0V3和A2780， SK0V3/Cis是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系，A2780/Cis是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A2780順 鉬耐藥細(xì)胞亞系，上述空質(zhì)粒為pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒。發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次通過鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清實現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白A3表達(dá) 水平的檢測，并且首次給出了評估腫瘤患者對鉬類化療藥物敏感性的方法，使得能夠及早 地發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥，及時地改變腫瘤治療方案，提高5年生存率，并改善預(yù)后。


在下面的附圖中，SK0V3和A2780為轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的SK0V3和A2780 細(xì)胞；SK0V3/Cis是轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系，A2780/Cis是 轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的A2780順鉬耐藥細(xì)胞亞系；SK0V3/Ann和A2780/Ann細(xì)胞系分別是SK0V3和A2780轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆；SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R是SK0V3/Cis和A2780/Cis轉(zhuǎn)染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。圖1 八種卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的鉬濃度比較，< 0. 01，**P < 0. 001。圖 2 :SK0V3、SK0V3/Ann 細(xì)胞 Pt 排出率比較。圖3 八種卵巢癌細(xì)胞Pt-DNA濃度比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01。圖4 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3檢測。Parental代表親本細(xì)胞，即未 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞；Transfectant代表轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的腫瘤細(xì)胞。圖A :SK0V3和A2780均 轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒，胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平上調(diào)；圖B :SK0V3/Cis和A2780/Cis均轉(zhuǎn) 染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒，胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平下調(diào)；β -actin為肌動蛋白，為本實驗 內(nèi)參照。圖5 :A 順鉬敏感卵巢癌細(xì)胞(SK0V3和A2780)及其順鉬耐藥細(xì)胞(SK0V3/Cis和 A2780/Cis)透射電鏡下亞微結(jié)構(gòu)的改變(50，OOOx)。B 延細(xì)胞膜觀察胞漿內(nèi)增多的囊泡結(jié) 構(gòu)與細(xì)胞膜的關(guān)系(100，OOOx)。C:轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正、反義質(zhì)粒后，卵巢癌細(xì)胞胞漿內(nèi)囊 泡的變化。箭頭所示為胞漿內(nèi)異常囊泡結(jié)構(gòu)。圖6 免疫熒光技術(shù)檢測膜聯(lián)蛋白A3在卵巢癌細(xì)胞中的定位。圖7 免疫電鏡技術(shù)檢測膜聯(lián)蛋白A3亞細(xì)胞器定位(50，OOOx和100，OOOx對比觀 察)。A:對照(PBS代替膜聯(lián)蛋白A3抗體)；B、C、D顯示的是膜聯(lián)蛋白A3在囊泡表面及囊 泡內(nèi)的定位。胞漿內(nèi)的黑色顆粒為膠體金顆粒，每一個顆粒都代表膜聯(lián)蛋白A3蛋白；小箭 頭所指示的是膜聯(lián)蛋白A3蛋白所在的位置。大箭頭指示囊泡。100，OOOx圖為50，OOOx圖 內(nèi)方框的放大圖。圖8 膜聯(lián)蛋白A3在耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis培養(yǎng)上清中exosome (細(xì)胞內(nèi)囊泡釋放 到細(xì)胞外的一種存在形式)的表達(dá)。圖A 透射電鏡觀察exosome的形態(tài)，多為圓形或橢圓 形，直徑在40-100nm之間；圖B和C 免疫電鏡觀察膜聯(lián)蛋白A3在exosome中的表達(dá)；圖D DMEMl代表正常SK0V3/Cis培養(yǎng)上清濃縮液(濃縮倍數(shù)75x)，DMEM2代表去除了 exosome的 SK0V3/Cis培養(yǎng)上清濃縮液(濃縮倍數(shù)75x)，sucrose代表提取exosome過程中的exosome 上層蔗糖液，Hsp70為exosome內(nèi)參照(exosome多表達(dá)Hsp70)。圖9 圖A :30例化療耐藥卵巢癌患者、20例化療敏感卵巢癌患者和30例正常婦女 血清中膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平散點圖；圖B 將血清中膜聯(lián)蛋白A3的水平大于1. 13ng/ml 的卵巢癌患者列為A組，小于1. 13ng/ml的卵巢癌患者列為B組，繪制Kaplan Meier曲線， 兩組的無鉬間期(第一療程的含鉬類化療藥物的聯(lián)合化療結(jié)束后到卵巢癌復(fù)發(fā)的時間)長 度存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P = 0. 009 < 0. 05)。IQR 四分位間距數(shù)。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1 膜聯(lián)蛋白A3調(diào)節(jié)卵巢癌上皮細(xì)胞鉬類化療藥物耐藥機(jī)制體外研究1.實驗方法1)細(xì)胞系及其培養(yǎng)條件人上皮性卵巢癌細(xì)胞SK0V3細(xì)胞系購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心， SK0V3/Cis是本發(fā)明人誘導(dǎo)的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系(可參考閆雪冬，張明偉，潘凌 亞·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26 (7) :739-744)。本實驗還使用A2780及其順鉬耐藥細(xì)胞亞 系 A2780/Cis (可以參考 LuanYZ，Li L. et al. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2004，39 (6) 403-407.)。這些細(xì)胞均轉(zhuǎn)染有空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒。SK0V3/Ann和A2780/Ann細(xì)胞系 分別是SK0V3和A2780轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R是SK0V3/Cis和A2780/Cis轉(zhuǎn)染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克 隆(可參考 Xuedong Yan, Jie Yin, Huiyu Yao, Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. Cancer Res, 2010, 70 (4) :0F1_9.)，所有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆都經(jīng)過Western blot技術(shù)驗證過。同時采用 SK0V3 和 A2780 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞(可參考 Xuedong Yan，Jie Yin, Huiyu Yao, Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. Cancer Res, 2010, 70 (4) :0F1_9.)作為對照。上述所有細(xì)胞系都在含10%胎牛血清的DMEM(HG)的培養(yǎng)基中貼壁生長，置于 37°C,5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%密度時采用0. 25%胰酶消化傳代。2)藥物敏感實驗檢測細(xì)胞對順鉬(Cisplatin，CDDP)、卡鉬(Carboplatin，CBP)、紫杉醇(Taxol)和 表阿霉素(印irubicin)的敏感性。取指數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按2000/孔/100 μ L，每種藥物 每個濃度設(shè)6個平行孔，對照孔12個，不加藥物，其中6個孔為陰性對照(加入細(xì)胞、不加 藥物)，6個孔為空白對照(只加培養(yǎng)基)。37°C、5% CO2培養(yǎng)24小時后加入化療藥物，稀 釋成7個梯度，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，加入5mg/mL MTT20 yL,37°C>5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時，控 凈培養(yǎng)基，加100 μ L裂解液(含20% SDS, 50% N-N 二甲基甲酰胺，ρΗ 4. 7)，過夜，全自動 酶標(biāo)儀以540nm測定吸光值(0D值)，可求算每種藥物濃度吸光值的平均值，計算細(xì)胞存活 率及抑制率，根據(jù)藥物濃度和抑制率，使用SPSS11. 5軟件計算IC50(抑制50%細(xì)胞生長的 藥物濃度)及耐藥指數(shù)(RI)。抑制率(inhibitionrate) = [ (0D 對照-OD 實驗)/OD 對照]X 100%RI =耐藥細(xì)胞系的IC50/敏感細(xì)胞系的IC503)細(xì)胞內(nèi)鉬(Pt)濃度測定待各細(xì)胞長至對數(shù)生長期，消化、計數(shù)，以2X106細(xì)胞種至IOOmrn培養(yǎng)皿，24小時 后加入⑶DP至終濃度10 μ Μ, 37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(對照組不加藥 物)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，收集至Ep管中。使用50-100 μ L 70% 硝酸裂解細(xì)胞，置65°C水浴2小時(此時取出部分裂解產(chǎn)物利用BCA法檢測蛋白濃度)，向 裂解產(chǎn)物中加入蒸餾水，將其稀釋至5%的硝酸濃度。利用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測細(xì)胞 內(nèi)的鉬(Pt)含量。為檢測⑶DP排出情況，將細(xì)胞加入⑶DP至終濃度10 μ M，37°C、5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，棄去培養(yǎng)基，換成無藥培養(yǎng)基孵育2小時，如前步驟收集和 處理細(xì)胞，檢測Pt含量。Pt排出率=(1-無藥培養(yǎng)2小時細(xì)胞內(nèi)Pt濃度/加藥24小時細(xì) 胞內(nèi)Pt濃度)X 100%。
4) DNA結(jié)合Pt的檢測待各細(xì)胞長至對數(shù)生長期，消化、計數(shù)，以2X106細(xì)胞種至IOOmm培養(yǎng)皿，24小時 后加入⑶DP至終濃度10 μ Μ, 37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(對照組不加藥 物)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，收集至Ep管中。按照Qiagen DNA提 取試劑盒說明書提取DNA，將300 μ L Buffer FGl裂解細(xì)胞，吹打混勻，加入300 μ L Buffer re2/protease，顛倒混勻3次，置65°C水浴10分鐘，加入600 μ L異丙醇，顛倒混勻，直至出 現(xiàn)DNA線狀或塊狀的沉淀，IOOOOg離心3分鐘，棄上清，將Ep管倒置在濾紙上吸干水分，加 入600 μ 1 70%乙醇，渦旋5s，IOOOOg離心3分鐘，棄上清，將Ep管倒置在濾紙上吸干水分， 空氣風(fēng)干DNA沉淀直至液體揮發(fā)為止，加入50-100 μ L 70%硝酸裂解細(xì)胞，置65°C水浴2 小時(此時取出部分裂解產(chǎn)物利用分光光度計檢測DNA濃度)，向裂解產(chǎn)物中加入蒸餾水， 將其稀釋至5%的硝酸濃度。利用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測與DNA結(jié)合的Pt含量。5)統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)使用SPSSl 1. 5統(tǒng)計軟件處理，經(jīng)t檢驗和方差檢驗(Oneway Anova)進(jìn) 行統(tǒng)計分析。2.實驗結(jié)果1)細(xì)胞對順鉬、卡鉬、紫杉醇、表阿霉素的耐藥性檢測CDDP耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis和A2780/Cis，不僅對CDDP耐藥，而且對CBP也產(chǎn)生了 相同的耐藥性(表1)。另外檢測了各轉(zhuǎn)染細(xì)胞對紫杉醇和表阿霉素的敏感性。我們可以看 到，與敏感細(xì)胞SK0V3和A2780相比，耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis和A2780/Cis不僅對鉬類產(chǎn)生了 耐藥，而且對紫杉醇和表阿霉素出現(xiàn)了交叉耐藥，他們的RI分別顯示在表2中。而將膜聯(lián) 蛋白A3過表達(dá)或不表達(dá)的細(xì)胞與其對照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞)相比，對紫杉醇和表阿霉素 的敏感性無明顯改變(表2)。表1鉬類耐藥細(xì)胞對順鉬和卡鉬的耐藥性比較 *P < 0. 05，**P < 0. 01，與親本細(xì)胞相比表2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞及其對照細(xì)胞對紫杉醇、表阿霉素的耐藥性。 2) Pt濃度的測定各細(xì)胞經(jīng)10 μ M⑶DP作用24小時后，檢測細(xì)胞內(nèi)的Pt濃度。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的敏感 細(xì)胞(SK0V3、A2780)相比，在膜聯(lián)蛋白A3過度表達(dá)的細(xì)胞(SK0V3/Ann，A2780/Ann)中，Pt 濃度顯著降低(P < 0. 001，P = 0. 002)。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的耐藥細(xì)胞(SK0V3/Cis、A278/Cis) 相比，在膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞(SK0V3/Cis/R、A2780/Cis/R)中，Pt濃度明顯升高(P =0. 008，P = O. 009)(圖1)。在檢測Pt排出率的實驗中，SK0V3細(xì)胞為(31. 4士4. 0) %, SK0V3/Ann 細(xì)胞為(59. 2士2. 2) %，SK0V3/Ann 細(xì)胞中 Pt 排出明顯增加(P < 0. 001)(圖 2)。 另外，在檢測Pt-DNA結(jié)合的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)在SK0V3/Ann、A2780/Ann中，與DNA結(jié)合的Pt濃 度降低(P = 0. 007，P = 0. 011)。在 SK0V3/Cis/R、A2780/Cis/R 中，與 DNA 結(jié)合的 Pt 濃度 明顯升高(P = 0. 003，P = O. 026)(圖 3)。3.結(jié)論細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少是造成鉬類耐藥的重要機(jī)制之一，而膜聯(lián)蛋白A3的一個重 要功能是介導(dǎo)膜與膜之間的接觸，它可以通過磷脂酰絲氨酸結(jié)合到質(zhì)膜上，使細(xì)胞膜的通 透性發(fā)生改變，并且參與細(xì)胞的吞噬、分泌等活動。因此，我們檢測了膜聯(lián)蛋白A3過表達(dá) 和膜聯(lián)蛋白A3下調(diào)的細(xì)胞中是否存在鉬的蓄積改變。實驗結(jié)果表明，在膜聯(lián)蛋白A3過表 達(dá)細(xì)胞中，鉬濃度明顯減少，Pt-DNA結(jié)合明顯減少，而在膜聯(lián)蛋白A3下調(diào)的細(xì)胞中獲得了 與此相一致的結(jié)果，說明細(xì)胞內(nèi)鉬類藥物蓄積減少是膜聯(lián)蛋白A3導(dǎo)致鉬類耐藥的重要因 素。鉬類藥物通過與DNA形成加合物來損傷DNA，錯配修復(fù)系統(tǒng)識別加合物可以導(dǎo)致p53 活化，激活MAPK通路，誘導(dǎo)BAX表達(dá)，最終導(dǎo)致凋亡(Hartwell LH, et al. Science，1994， 266(5192) =1821-1828) ο本實驗也證實了這一點。與轉(zhuǎn)染了空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的親本 細(xì)胞相比較，在膜聯(lián)蛋白A3過表達(dá)細(xì)胞中，給予順鉬處理后，鉬濃度明顯減少，Pt-DNA結(jié)合 明顯減少，P53增加的程度小于親本細(xì)胞，因此凋亡減少，導(dǎo)致耐藥。由于臨床治療中CDDP 化療劑量的血漿峰值濃度為10 μ Μ,因此在這部分實驗中CDDP的作用濃度均采用此劑量。實施例2 上皮性卵巢癌細(xì)胞外泌膜聯(lián)蛋白A3的鑒定1.實驗方法1)細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)
同實施例1。2)上皮性卵巢癌細(xì)胞系培養(yǎng)基上清的收集和濃縮取2X IO5個細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁生長，生長至70%的時候更換無 血清DMEM，約每IX IO6細(xì)胞給予5ml培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后將此 無血清DMEM收集置IOml離心管內(nèi)，IOOOg離心10分鐘，以去除DMEM中的有形成分，離心后 小心收集上清，置于Amicon Ultra-15超濾管(美國Millipore公司)內(nèi)，3000g水平離心 15分鐘，收集濃縮后的液體于Ep管內(nèi)，-70°C保存。3) Western blot半定量檢測培養(yǎng)基內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的含量a.檢測樣品的準(zhǔn)備經(jīng)過濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)基上清和細(xì)胞內(nèi)總蛋白為本實驗待測樣品，培養(yǎng)基上清樣品 與Iaemmli上樣緩沖液(美國Bio-Rad公司)2 1混合制成上樣樣品，置于冰水浴中，體 積大約20微升為好。取對數(shù)生長期的非耐藥和耐藥細(xì)胞，胰酶消化，1500rpm離心5分鐘， 棄去上清，加入無菌PBS (pH 7. 4)重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，1500rpm離心5分鐘，棄上清，用冷 PBS洗細(xì)胞兩次，吸凈上清。約IO6個細(xì)胞加Iaemmli裂解液(美國Bio-Rad公司)，在裂解 細(xì)胞時，其它細(xì)胞處于冰水浴。加入裂解液后，99°C煮沸10分鐘，10000g、4°C離心10分鐘， 取出后冰水浴。取出測定蛋白濃度的樣品后，將剩余的樣品每100 μ 1加入2-ME (2-巰基乙 醇)5μ l，10000g、4°C離心 10 分鐘，-20°C保存。b. BCA法測細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度取BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce)A液、B液以50 1 (ν ν)混合，取上述樣品 加入500 μ 1 AB混合液中，混勻，空白對照為2 μ 1裂解液加入到500 μ 1 AB混合液，37°C水 浴 30 分鐘，以空白對照調(diào)零，在 Smartspec plus spectrophotometer (Bio-Rad)測 562nm 波長的OD值。使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算樣品濃度。c. SDS-PAGE 電泳制膠先制備10%分離膠5ml 去離子水1. 9ml，30 %丙烯酰胺1.7ml，1.5% Tris 1.3ml (pH 8. 8), 10% SDS 0. 05ml，10%過硫酸胺 0. 05ml，TEMED 0.002ml。待 30 分 鐘分離膠凝固后，再配制5%濃縮膠2ml 去離子水1. 4ml，30%丙烯酰胺0. 33ml, 1.0% TrisO. 25ml (pH 6. 8), 10% SDS 0. 02ml，10 % 過硫酸胺 0. 02ml，TEMED0. 002ml。加樣待 濃縮膠凝固后，取20 μ 1濃縮培養(yǎng)基上樣樣品、30 μ g細(xì)胞內(nèi)總蛋白加入樣品槽中。電 泳加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0. 1 % SDS)80-100v,電泳 2 小時。d.轉(zhuǎn)膜制備轉(zhuǎn)移緩沖液48mM Tris-HCl，39mM甘氨酸，0. 037% SDS，20%甲醇。剪好6張 與凝膠大小一致的濾紙和一張PVDF膜(美國Millipore公司)，濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸 泡15分鐘，PVDF膜用甲醇激活10秒后再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。濾紙、凝膠和PVDF膜按照 三層濾紙-PVDF膜-凝膠-三層濾紙的次序疊放，整個操作過程在轉(zhuǎn)移緩沖液中完成，注意 不能有氣泡。右下角標(biāo)記。270mA、冰水浴中電轉(zhuǎn)移1小時。e.免疫印跡取下轉(zhuǎn)上蛋白的PVDF膜，蛋白面朝上，TBST(200mM Tris-HCl, 1. 5mM NaCl,0. 05% Tween-20)搖洗3次，每次5分鐘后，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1小時后取出，加入封閉液配制的一抗(兔抗人膜聯(lián)蛋白A3特異性多克隆抗體)，4°C輕輕搖晃過夜。以TBST 搖洗3次，每次5分鐘，之后加入封閉也配制的HRP標(biāo)記的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山 羊抗兔IgG抗體)，室溫孵育1小時，TBST搖洗三次，將化學(xué)發(fā)光底物液ECL(美國Thermo 公司)A、B液按體積1 1混合，將PVDF膜作用5分鐘，暗示X光片曝光顯影。2.實驗結(jié)果腫瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基蛋白含量很低，上清經(jīng)過超濾管濃縮之后，體積可以由 15ml濃縮到500 μ 1，這樣大大提高了培養(yǎng)基中蛋白的含量，對通過Western blot方法檢測 出膜聯(lián)蛋白A3提供了基礎(chǔ)。運(yùn)用Western blot技術(shù)成功的在濃縮的培養(yǎng)基上清中檢測出 膜聯(lián)蛋白A3，并對上述8種卵巢癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行半定量。半定 量比較主要是比較免疫印跡膜聯(lián)蛋白A3蛋白條帶的粗細(xì)。在上述2種順鉬耐藥卵巢癌細(xì) 胞系培養(yǎng)基上清和細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平均高于其對應(yīng)的順鉬敏感細(xì)胞系，尤其是 上清中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平升高更為明顯。在轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥 細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平后(SK0V3/Cis/R和A2780/Cis/R細(xì)胞系)，細(xì)胞培養(yǎng)基中膜 聯(lián)蛋白A3水平則明顯下降。相反，在轉(zhuǎn)染了正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒的SK0V3/Arm和A2780/ Ann細(xì)胞的培養(yǎng)基中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4)。3.結(jié)論卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中含有一定量的膜聯(lián)蛋白A3，說明卵巢癌細(xì)胞具有分泌膜 聯(lián)蛋白A3的功能，通過半定量比較，說明卵巢癌細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的多少與細(xì)胞內(nèi)膜 聯(lián)蛋白A3的含量成正相關(guān)關(guān)系，培養(yǎng)基中高水平的膜聯(lián)蛋白A3能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)卵巢癌細(xì) 胞對順鉬的耐藥性?；谝陨?，膜聯(lián)蛋白A3具有成為有效的預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的生物 學(xué)標(biāo)志物的基礎(chǔ)。實施例3 膜聯(lián)蛋白A3在卵巢癌細(xì)胞中的外泌途徑1.實驗方法1)細(xì)胞系及培養(yǎng)本實驗所用細(xì)胞及其培養(yǎng)條件與“實施例二”完全一致，此不重復(fù)敘述。2)細(xì)胞免疫熒光及其激光共聚焦成像以2 X IO4細(xì)胞種至已鋪好玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5 % CO2飽和濕度培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗3次，0. 5% TritonX-IOO透膜20分鐘，PBS洗3次，2% BSA封閉30分鐘，1 50兔抗人膜聯(lián)蛋白A3多 克隆抗體(一抗)孵育，4°C過夜。PBS洗3次，山羊抗兔FITC 二抗孵育1小時，PBS洗3次 后1 1000含0. RNase的PI染色液室溫孵育20分鐘，PBS洗3次，利用含90%甘油 的PBS封片。在Radiance 2100激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。3)透射電鏡a.對數(shù)期生長的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)彡IX IO6)，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2此。b.加入PBS 10ml，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(北京海淀區(qū)太平路27號)儀器檢測中心 電鏡室制備細(xì)胞透射電鏡標(biāo)本。c.標(biāo)本制作過程如下細(xì)胞長至對數(shù)生長期，PBS洗兩遍，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮 下，IOOOg 離心 10 分鐘，3%戊二醛(1/15M PBS pH 7. 4)，4°C下固定 2 小時，4°C下 1/15M PBS+0. 19M蔗糖緩沖液漂洗15分鐘。乙醇4°C下梯度脫水(50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各10分鐘)，100%丙酮在室溫下脫水10分鐘。 100%丙酮包埋劑(1 1)室溫浸透30分鐘，純包埋劑浸透過夜。進(jìn)行包埋聚合時間為 35°C，12小時45°C，12小時；60°C，24小時。ULTRACUT E/S型切片機(jī)(美國RMC公司)進(jìn) 行超薄切片，醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸檬酸鉛染色10分鐘。d.電壓 75kV，EM400T 電鏡(荷蘭 Philips 公司)觀察，選擇 X8000、X 22000 電 鏡照相，觀察細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)。4)免疫電鏡a.對數(shù)期生長的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)彡IX IO6)，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。b.加入PBS 10ml，送中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院電鏡室制備細(xì)胞超薄切片(70-80nm厚)。過 程如下細(xì)胞長至對數(shù)生長期，PBS洗兩遍，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮下，IOOOg離心10分鐘，4%磷 酸多聚甲醛和0. 戊二醛1 1混合的固定液，4°C下固定4-6小時，經(jīng)乙醇梯度脫水后采 用特殊的白樹脂(美國Sigma公司)包埋細(xì)胞。待包埋劑凝聚后，ULTRA⑶T E/S型切片機(jī) (美國RMC公司)進(jìn)行超薄切片。c.免疫染色去離子水沖洗超薄切片三次，置于BSA的封閉液中封閉30分鐘， 1 200兔抗人膜聯(lián)蛋白A3多克隆抗體4°C濕盒中孵育過夜，0. IM PBS清洗3次，1 40 膠體金顆粒標(biāo)記的驢抗兔二抗室溫孵育1小時，去離子水清洗3次。d.染色觀察免疫染色后，細(xì)胞超薄切片再經(jīng)過醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸 檬酸鉛染色10分鐘。置電鏡下觀察膠體金顆粒標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，50000X電鏡下照 相。5)SK0V3/Cis細(xì)胞系培養(yǎng)上清中exosome提取、觀察以及膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)鑒定a.取約5父106個31(0￥3/(^8細(xì)胞平均接種于2個175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁 后，更換為無血清培養(yǎng)基(DMEM)，置5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。收集培養(yǎng)基上清 大約60ml。b.將收集來的培養(yǎng)基上清于lOOOXg，IOmin離心，去除細(xì)胞及碎片成分，收集 離心后取上清。再將上清置于 Centricon Plus_20filter capsule (Millipore, USA)中， 4000Xg離心30分鐘，最終將60ml上清濃縮為1. 5ml濃縮液，再將濃縮液以PBS稀釋至 15ml，置于 IOOkDa Amicon Ultra-15 (Milipore, USA)中，4000Xg 離心 30 分鐘，濃縮為 200 μ 1濃縮液。c.收集200 μ 1濃縮液，PBS稀釋至5ml，并轉(zhuǎn)移入5ml超離管中，同時以300 μ 1 30% sucrose/D20墊底，100，000X g，4°C離心40分鐘，收集350 μ 1底部葡萄糖墊，并以 PBS 稀釋至 15ml，再次用 IOOkDaAmicon Ultra-15 (Milipore, USA)濃縮至 200 μ 1 (此為含 exosome的液體)。同時收集上層350 μ 1低濃度葡萄糖液(后面用“ sucrose ”表示此樣本)， 作為無exosome的對照液體，_20°C保存，用于westernblot分析。將100 μ 1含exosome的 液體保存在_20°C冰箱中。低濃度葡萄糖液和含exosome液體在western blot分析時，先 將液體樣本按1 1比例于Iaemmli上樣緩沖液(美國Bio-Rad公司)混合，檢測sucrose 和exosome中膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)(western blot方法已在實施例2中詳細(xì)描述，此不重復(fù) 描述)Od.此200 μ 1濃縮液中含有大量exosome，將濃縮液滴至炭膜覆蓋的400目鎳網(wǎng) 上，自然晾干，此時exosome已吸附至鎳網(wǎng)上，1 %戊二醛固定exosome，再以醋酸雙氧鈾負(fù)染色，于透射電鏡下觀察exosome形態(tài)。e.免疫電鏡觀察時，先將exosome吸附至鎳網(wǎng)后，PBS反復(fù)沖洗3次，1 200兔 抗人膜聯(lián)蛋白A3多克隆抗體4°C濕盒中孵育過夜，0. IMPBS清洗3次，1 40膠體金顆粒標(biāo) 記的驢抗兔二抗室溫孵育1小時，其后再以戊二醛固定，透射電鏡下觀察。6)無exosome的細(xì)胞培養(yǎng)基上清收集a.將5X106個SK0V3/Cis細(xì)胞平均接種于2個T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后 更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)基上清約30ml。b.將收集來的培養(yǎng)基上清IOOOXg離心10分鐘，收集上清30ml。c.將收集的上清平分兩份，一份運(yùn)用 IOOkDa Amicon Ultra-15 (Millipore, USA) 在4000 Xg條件下離心30分鐘，收集下層非濃縮液體，體積大約15ml，再將15ml液體運(yùn)用 IOkDa AmiconUltra-15 (Millipore, USA)在同樣條件下離心30分鐘，收集上層約200 μ 1的 濃縮液，此濃縮液便是去除了 exosome的上清，該樣本命名為DMEM2。d.平分的另外一份上清運(yùn)用 IOkDa Amicon Ultra-15 (Millipore, USA)在 4000 Xg條件下離心30分鐘，收集上層大約200 μ 1的濃縮液體，此液體為含有exosome的 濃縮上清，該樣本命名為DMEMl。e.所有樣本保存在-20°C冰箱中，將其1 1與Iaemmli上樣緩沖液(美國 Bio-Rad公司)混合，運(yùn)用western blot方法檢測膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平(western blot 實驗步驟可以參考實施例2)。2.實驗結(jié)果透射電鏡下，觀察上述順鉬敏感和耐藥卵巢癌細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)，與順鉬敏感細(xì)胞相 比，發(fā)現(xiàn)順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多的囊泡樣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)散在分布于胞漿內(nèi)，表面光 滑，不同于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，囊泡內(nèi)也沒有類似線粒體樣的脊，某些囊泡內(nèi)還能看見 存在某些不明的顆粒物質(zhì)，不同于溶酶體內(nèi)的均質(zhì)。延細(xì)胞膜觀察囊泡，則能觀察到某些 囊泡離胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些則已經(jīng)突破胞膜外(圖5A B)。運(yùn)用透射電 鏡觀察轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，發(fā)現(xiàn)在敏感細(xì) 胞與轉(zhuǎn)染前相比胞漿內(nèi)也出現(xiàn)了很多類似順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)的囊泡結(jié)構(gòu)；相反，轉(zhuǎn)染膜 聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)囊泡則 大量減少了(圖5C)，以上說明細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3可以導(dǎo)致胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。 運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，特異性的染色上述8種細(xì)胞胞核胞漿內(nèi)的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)卵巢 癌細(xì)胞種膜聯(lián)蛋白A3主要分布于胞漿，少數(shù)分布于胞核，主要還是一種胞漿蛋白(圖6)。 運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)，對膜聯(lián)蛋白A3細(xì)胞分布進(jìn)行亞細(xì)胞器定位，對上述8種細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋 白A3進(jìn)行免疫染色，采用膠體金顆粒標(biāo)記膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3大量分布于 胞漿內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上，包括透射電鏡下發(fā)現(xiàn)的囊泡的膜表面，同時在個別囊泡，特別是靠近胞膜 的囊泡內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3的存在(圖7)，說明膜聯(lián)蛋白A3通過囊泡的形式外泌。運(yùn) 用western blot法，檢測DMEMl和DMEM2之間膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)含量差異，說明exosome攜 帶了大量膜聯(lián)蛋白A3蛋白。同時檢測exosome和sucrose之間膜聯(lián)蛋白A3水平，以說明 exosome的純化度(圖8)。3.結(jié)論膜聯(lián)蛋白A3存在于卵巢癌細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)，但主要存在于胞漿內(nèi)，是一種胞
15漿蛋白。上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3能夠在卵巢癌細(xì)胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生囊泡結(jié)構(gòu)，它既不像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也不 像高爾基體和溶酶體，免疫電鏡驗證了該囊泡表面和囊泡內(nèi)存在膜聯(lián)蛋白A3蛋白，沿細(xì)胞 膜觀察囊泡，可以發(fā)現(xiàn)囊泡有和細(xì)胞膜融合和突出細(xì)胞的趨勢，由此可以說明膜聯(lián)蛋白A3 通過此途徑外泌出細(xì)胞。該分泌機(jī)制為膜聯(lián)蛋白A3作為一種分泌蛋白成為臨床預(yù)示卵巢 癌鉬類化療藥物耐藥生物學(xué)標(biāo)志物，提供了更為堅實的理論基礎(chǔ)。實施例4 人外周血中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的檢測1.實驗方法1)臨床病例資料收集2007-2009年在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院接受體檢的健康婦 女(30例)和在婦產(chǎn)科治療卵巢癌患者(50例)術(shù)前(或術(shù)后化療前)均是本實驗的研究 對象。健康體檢婦女需滿足一下條件(1)處于育齡期、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期婦女；(2)未患有 任何慢性疾病、感染性疾病和良惡性腫瘤疾??；(3)近一周未服用任何藥物及保健品藥物。 健康婦女血清收集之后置于Ep管中，保存于-70°C，待檢測。入選本實驗的卵巢癌患者需滿 足(1)術(shù)后組織病理確診為原發(fā)性卵巢上皮性惡性腫瘤；(2)第一次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后， 所有患者均接受了正規(guī)的以鉬類化療藥物為主(順鉬或卡鉬)的單藥或聯(lián)合化療；(3)術(shù) 后和第一次化療結(jié)束后，所有患者均接受了正規(guī)隨訪，隨訪時間約第一次化療完成后6個 月到1年。患者術(shù)后第一年每月隨訪1次，第二年每3個月隨訪一次，第三年以后每6個月 隨訪一次。每次隨訪均檢測外周血CA125，婦科檢查，以及相應(yīng)的影像學(xué)檢查，必要時活檢。 根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)納入研究，收集患者的年齡、病理學(xué)分型、分期、分級，化療情況(表3)。鉬類 化療藥物耐藥定義為經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達(dá)到完全緩解(CR)，持續(xù)時 間< 6個月；化療期間腫瘤的最好療效為部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)或進(jìn)展(PD)者。鉬類 化療藥物敏感定義為經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達(dá)到臨床完全緩解(CR)，持 續(xù)時間> 6個月。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，50例卵巢癌患者經(jīng)過隨訪有30名患者符合耐藥標(biāo)準(zhǔn)，剩 余20名列為敏感組(表3)。表3 50例卵巢癌患者臨床病例資料統(tǒng)計。a和b 病理分期和臨床分期均根據(jù)國
際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。 2) ELISA (酶聯(lián)免疫吸附實驗)a.實驗標(biāo)本符合上述入組條件的健康婦女和卵巢癌患者的血清為本實驗的檢 測對象。采集血標(biāo)本于5毫升采集管內(nèi)，待血自然凝固后，3000g離心5分鐘，收集上清(血 清)，于Ep管內(nèi)，保存于-70°C。b.采用人膜聯(lián)蛋白A3 ELISA檢測試劑盒(美國Cusabio公司)定量檢測血清中膜 聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平。試劑盒內(nèi)含有酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、生物素標(biāo)記抗體稀釋液、 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶 液、洗滌液和終止液。具體按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，步驟如下(1)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。濃度依次為 0ng/ml、0. 4ng/ml、0. 8ng/ml、l. 6ng/ml、3. 2ng/ml、 6. 2ng/ml、12. 5ng/ml和25ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品在實驗前15分鐘配制；(2)加樣。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入已經(jīng)包埋 有armxin A3抗體的酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100微升，空白孔內(nèi)加入100微升標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每孔 均設(shè)復(fù)孔。加樣完畢將酶標(biāo)板覆膜，置于濕盒中，37°C反應(yīng)120分鐘；(3)標(biāo)記。棄去液體，甩干，不用洗滌，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100微升， 370C，60分鐘；再棄去液體，甩干，洗滌液洗板3次，每次2分鐘，每孔200微升，甩干，加入 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100微升，37°C，60分鐘；(4)顯色。溫育完畢，棄去液體，甩干，洗板5次，依次每孔加入底物溶液90微升， 避光37°C顯色30分鐘后，孔內(nèi)液體顏色部分變藍(lán)，每孔依次加入50微升終止液，此時液體 轉(zhuǎn)為黃色；(5)檢測。加入終止液后，15分鐘內(nèi)上酶標(biāo)儀檢測，吸收波長設(shè)為450nm，記錄每孔OD值。c.數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Excel以O(shè)D值為Y軸，濃度的Ig值為X軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得 趨勢線方程式，計算出每個樣本平均OD值后帶入公式便可得出每個樣本內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的 濃度值。3)統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5. 0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)按照正常組、卵巢癌組 (分鉬類化療藥物耐藥組和敏感組兩組)制作膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)散點圖，組間差異比較運(yùn)用 Mann-Whitney分析，當(dāng)P > 0. 05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.實驗結(jié)果運(yùn)用人類膜聯(lián)蛋白A3酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(ANXA3 ELISAkit)成功檢測并 定量了人血清中膜聯(lián)蛋白A3的含量，膜聯(lián)蛋白A3在人外周血中的表達(dá)水平比較低。正常 婦女血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為0. 8590士0. 0744，卵巢癌患者血清膜聯(lián)蛋白A3平 均表達(dá)水平為1.6898士2. 6563，兩組進(jìn)行Mann-Whitney檢驗，P < 0.0001。將所有卵巢 癌患者分為鉬類化療藥物耐藥組和鉬類化療藥物敏感組，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為 2. 1145士3. 3833，敏感組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為1.0528士0. 1178，兩組比較P = 0. 0003 < 0. 05(圖9)。當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平大于1. 13ng/ml時，該蛋白預(yù)測卵巢癌鉬類化療藥物耐 藥的敏感性達(dá)到63.3%，特異性80%。當(dāng)大于1.34ng/ml時，該蛋白預(yù)測卵巢癌鉬類化療 藥物的敏感性和特異性均達(dá)到100% (表4)。 4.結(jié)論膜聯(lián)蛋白A3作為一種鉬類化療藥物耐藥相關(guān)蛋白，經(jīng)體外實驗證實在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)具有外分泌的功能，并且運(yùn)用ELISA法成功在人外周血檢測出膜聯(lián)蛋白A3。并且將耐 藥組和敏感組膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平進(jìn)行比較，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平明顯高于敏感 組，當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平高于1. 13ng/ml，其預(yù)測鉬類化療藥物耐藥的敏感性和特異性均超 過50%，當(dāng)高于1. 34ng/ml時，其敏感性和特異性達(dá)到100%。本實驗選取人血清作為研究 對象，是基于其比較容易獲得且是臨床常用的檢測對象而考慮的，理論上也能夠采用腹水、 尿液、唾液、白帶等其它人體分泌物作為檢測對象。在本實驗中，出于質(zhì)量控制的考慮，全部 樣本檢測均有單人一次性操作完成，數(shù)據(jù)分析則采取雙盲法分析。 盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
一種檢測膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法，其特征在于，使用鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清作為被檢測的樣品，其中，優(yōu)選地，所述鉑類化療藥物為順鉑；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并且更優(yōu)選為DMEM；優(yōu)選地，所述檢測優(yōu)選為免疫學(xué)檢測，并且更優(yōu)選為Westernblot或ELISA檢測。
2. 一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中 annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而提高腫瘤細(xì) 胞對鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞 中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì) 胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而 降低腫瘤細(xì)胞對鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反 義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更 優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白 A3的含量。
5.一種評估腫瘤患者對鉬類化療藥物耐藥性的方法，包括如下步驟1)檢測患者體液樣品中膜聯(lián)蛋白A3水平；2)若步驟1)中的膜聯(lián)蛋白A3水平高于1.34ng/ml，判斷腫瘤患者對鉬類化療藥物耐藥；其中，優(yōu)選地，所述體液為血清；優(yōu)選地，步驟1)中的檢測為ELISA檢測。
6.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中 annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
7.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié)合的方法，所述方法包括改變腫 瘤細(xì)胞中annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
8.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì) 胞中annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的方法，所述方法通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3表達(dá)實現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白 A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的方法，所述方法通過減少和/或抑制腫瘤細(xì) 胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反義核酸和/ 或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過 使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及化療藥物耐藥性領(lǐng)域，具體地，涉及如下方面一種檢測鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法、一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法、一種評估腫瘤患者對鉑類化療藥物耐藥性的方法、一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉑的方法、一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉑結(jié)合的方法、以及一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法。
文檔編號C12N15/85GK101893630SQ201010121278
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者尹婕, 潘凌亞, 閆雪冬 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院