專利名稱：牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗及生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥技術(shù)或生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫 苗產(chǎn)品及制備方法。
背景技術(shù)：
牛病毒性腹瀉病毒呈世界性分布，易感動(dòng)物較多，如鹿、牛、豬、羊等，且它們間可 相互傳染。該病毒引起的疾病全年均可發(fā)生。牛病毒性腹瀉病毒可導(dǎo)致動(dòng)物的病毒性腹瀉、 粘膜病、流產(chǎn)、死胎、弱胎、畸形胎、持續(xù)性感染、免疫耐受、血小板減少和出血性綜合癥等多 種臨床癥狀，還可導(dǎo)致非典型性豬瘟，給鹿業(yè)和奶牛業(yè)及養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害；尤其是在 人用的疫苗中發(fā)現(xiàn)了該病毒，這對(duì)人類(lèi)是一個(gè)潛在的威脅。牛病毒性腹瀉病是全球性傳染 病，具有較高的感染率，流行的范圍在不斷擴(kuò)大，陽(yáng)性率在逐年增高。該病的發(fā)生和流行給 養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。由于滅活苗，核酸疫苗，亞單位疫苗免疫原性差、保護(hù)力低， 而活毒疫苗不安全等原因，至今尚無(wú)很好的疫苗可供使用，亦無(wú)治療的特效藥，因此急需研 制有效的疫苗和治療的特效藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗，用于動(dòng)物牛病毒性 腹瀉病防治，克服現(xiàn)有的滅活苗，核酸疫苗免疫原性差、保護(hù)力低，活毒疫苗使用不安全的 缺點(diǎn)。本發(fā)明是將牛病毒性腹瀉病毒保護(hù)性抗原基因在可食性的抗病毒的藥用植物黃 芪宿主中表達(dá)得到的疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明的牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗是先以牛病毒性腹瀉病毒RNA為模 板用反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得Etl基因，再構(gòu)建牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表 達(dá)載體，然后采用花粉管通道法，將牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體溶液滴注 在處于半開(kāi)放的黃芪花的柱頭上，待黃芪種子成熟時(shí)收獲種子，種植所收獲的種子得到再 生苗，對(duì)再生苗分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法鑒定及蛋白質(zhì) 電泳法鑒定，得到牛病毒性腹瀉病毒Etl基因轉(zhuǎn)化黃芪，再通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸 附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉(zhuǎn)化的黃芪，所得到的疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明藥用植物疫苗的表達(dá)宿主還可以選用人參、魚(yú)腥草、莪術(shù)、防風(fēng)、刺五加。本發(fā)明疫苗的制備方法包括以下步驟1、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl基因的獲得以提取RNA常規(guī)方法提取的牛病毒性腹瀉病毒基因組RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄-聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增Etl基因。擴(kuò)增所用的引物序列如下上游5‘ -CCGGATCCACCATGGAAAA CATAACACAGTGG-3‘；下游5' -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3‘。反轉(zhuǎn)錄-聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，按維特潔DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，回收目的基 因E0
2、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體構(gòu)建分別用DNA限制性內(nèi)切酶雙酶切經(jīng)凝膠純化的目的基因Etl及植物表達(dá)載體DNA， 用T4 DNA連接酶16°C條件下連接16h，取5μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌工程菌，挑取 轉(zhuǎn)化菌單菌落抽提質(zhì)粒，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和DNA限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定及序列分 析篩選牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組工程菌，3、牛病毒性腹瀉病毒基因Etl花粉管通道法轉(zhuǎn)化黃芪大量培養(yǎng)重組工程菌，用堿裂解法大量制備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表 達(dá)載體。選取花多、大而整齊的黃芪，用注射器將l-2ng/y 1牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重 組植物表達(dá)載體溶液滴注于半開(kāi)放的、顏色鮮艷的花的柱頭之上，去除已經(jīng)開(kāi)放、花色暗淡 的花朵以及還未開(kāi)放的花朵，待種子成熟時(shí)收獲種子，室溫保存。對(duì)收獲種子種植制備再生 苗，對(duì)再生苗分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法鑒定及蛋白質(zhì)電 泳法鑒定，篩選出牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉(zhuǎn)化的黃芪。4、牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗的篩選對(duì)牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法篩選具有 免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉(zhuǎn)化的黃芪，得本發(fā)明疫苗產(chǎn)品，見(jiàn)表1。將牛病毒性 腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗，移植大田進(jìn)行擴(kuò)繁，九月份收獲轉(zhuǎn)基因黃芪。表1酶聯(lián)免疫吸附法篩選牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗
組別牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn) 基因黃芪牛病毒性腹瀉病 毒對(duì)照黃芪對(duì)照OD值0. 42±0. 0210. 43±0. 0240. 22±0. 018※不同字母間表示差異顯著(P <0.05)，相同字母間表示差異不顯著(P> 0. 05)。本發(fā)明是基于1、黃芪，為豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根。始載于《神農(nóng)本草 經(jīng)》，味甘性溫，入脾、肺二經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒排膿、利水消腫和生肌等功效。含 有多種皂苷類(lèi)、多糖、黃酮、氨基酸、微量元素等化學(xué)物質(zhì)，具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、 抗衰老、抗氧化、抗輻射和抗應(yīng)激藥理作用。黃芪可提高體液免疫功能，慢性感染性疾病患 者注射黃芪20d后，血液中免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的含量明顯升高，還可使肝炎患者的 總補(bǔ)體CH50和分補(bǔ)體C3明顯升高。黃芪可提高細(xì)胞免疫功能，黃芪多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞體和 B淋巴細(xì)胞體外增殖均有有明顯的促進(jìn)作用，黃芪多糖還有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高 自然殺傷細(xì)胞NK的活性。本發(fā)明充分運(yùn)用了黃芪抗病毒和免疫增強(qiáng)佐劑的特性。2、牛病毒性腹瀉病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Etl和E2均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)，但E2蛋白 保守性較低，抗原性變異較大，是導(dǎo)致病毒逃逸率高、疫苗保護(hù)率低和持續(xù)性感染的主要原 因，而Etl蛋白保守性較高，又具有抗原性，更適合研制基因工程苗。3、植物易于轉(zhuǎn)化并能提供廉價(jià)的蛋白質(zhì)源，并且具有使用安全、生產(chǎn)簡(jiǎn)單、可直接 口服等優(yōu)點(diǎn)，因此植物疫苗在動(dòng)物疾病防控方面將有極大的發(fā)展空間?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ膬?yōu) 點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)而人工再生植株，操作簡(jiǎn)單，單胚珠和多胚珠的單雙子葉植物均可應(yīng)
4用，育種時(shí)間短，基因純合速度快，可直接獲得轉(zhuǎn)基因植株，導(dǎo)入的DNA分子整合效率較高， 可直接運(yùn)用到常規(guī)育種。本發(fā)明的有益效果是將牛病毒性腹瀉病毒Etl基因在黃芪中表達(dá)，既產(chǎn)生保護(hù)性 抗原又產(chǎn)生增強(qiáng)免疫作用佐劑物質(zhì)，提高了黃芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。本發(fā)明 為疫苗和藥用植物聯(lián)合應(yīng)用，為研制新型基因疫苗打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和提供新的研究思 路。與牛病毒性腹瀉病毒活毒疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗相比，本發(fā)明的牛病毒性腹瀉病 毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗還具有容易生產(chǎn)、使用方便、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全，沒(méi)有負(fù)作用的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明 對(duì)更有效地控制牛病毒性腹瀉病的傳播和流行，繁榮畜牧業(yè)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià) 值。本發(fā)明的疫苗的用法和用量1、預(yù)防用法與用量使用對(duì)象為鹿、牛、豬，飼喂時(shí)添加牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗(鹿20克/ 日.只，牛30克/日.只，豬10克/日.只)，連喂3天，隔10天后再同法飼喂3天。2、治療用法與用量使用對(duì)象為鹿、牛、豬，飼喂時(shí)添加牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗(鹿40克/ 日.只，牛60克/日.只，豬20克/日.只)，連喂3天。


圖1牛病毒性腹瀉病毒Etl基因反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)電泳圖。圖2牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)電泳圖。圖3牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體的酶切鑒定電泳圖。圖4牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定電泳5牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪的反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定電泳6牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)圖7牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)1、本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)例1，牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗對(duì)鹿的免疫作用1、牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗對(duì)鹿的免疫選24頭1月齡健康仔鹿隨機(jī)分成三組，每組8只，第1組為牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn) 基因黃芪疫苗免疫組，飼喂時(shí)添加牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗20克/日.只。第2 組為黃芪黃芪對(duì)照組，飼喂時(shí)添加黃芪20克/日.只。第3組為玉米秸粉對(duì)照組，飼喂時(shí) 添加20克/日.只。連喂3天，隔10天后加強(qiáng)免疫一次，分別再飼喂3天。于初次免疫前 當(dāng)日和末次飼喂后第4周經(jīng)頸靜脈取血，分離血清和淋巴細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)鹿的 特異性體液免疫應(yīng)答，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平。2、牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗對(duì)鹿的體液特異性免疫應(yīng)答將純化牛病毒性腹瀉病毒可溶性全病毒抗原，用pH8. 0包被液稀釋，每孔加入 ΙΟΟμΙ，包被酶標(biāo)板4°C過(guò)夜。棄去液體，用緩沖液3X3洗滌。用含10%馬血清37°C封閉 2h。緩沖液洗滌同上。加入200倍稀釋的待檢鹿血清100μ 1，37°C感作lh。緩沖液洗滌同 上。加入5000倍稀釋的兔抗鹿酶標(biāo)二抗感作lh。緩沖液洗滌同上，加入底物37°C顯色反應(yīng)15min。每孔加50μ1 2Μ H2SO4，終止反應(yīng)，測(cè)定OD49tl值。結(jié)果用光密度(OD)的比率來(lái) 表示，即一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的OD49tl和0天樣品OD49tl間的比率。OD比值> 2時(shí)顯示為陽(yáng)性。OD 比值在1. 5-1. 9之間的樣品被記為弱陽(yáng)性。OD比值< 1. 5時(shí)為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，初次 飼喂前當(dāng)日，各組均為牛病毒性腹瀉病毒抗體陰性。牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗組 在末次免疫4周后產(chǎn)生顯著的IgG應(yīng)答，而飼喂黃芪組和對(duì)照組沒(méi)有檢察到牛病毒性腹瀉 病毒抗體效價(jià)。見(jiàn)表2。表2牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗誘導(dǎo)鹿體液特異性免疫(0D值)
權(quán)利要求
牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗，其特征是將牛病毒性腹瀉病毒保護(hù)性抗原基因在可食性的抗病毒的藥用植物黃芪宿主中表達(dá)得到的疫苗產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗，其特征是先以牛病毒 性腹瀉病毒RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得Etl基因，再構(gòu)建牛病毒性腹瀉病 毒基因Etl重組植物表達(dá)載體，然后采用花粉管通道法，將牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植 物表達(dá)載體溶液滴注在處于半開(kāi)放的黃芪花的柱頭上，待黃芪種子成熟時(shí)收獲種子，種植 所收獲的種子得到再生苗，對(duì)再生苗分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)法鑒定及蛋白質(zhì)電泳法鑒定，得到牛病毒性腹瀉病毒Etl基因轉(zhuǎn)化黃芪，再通過(guò)蛋白質(zhì) 印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉(zhuǎn)化的黃芪，所得 到的的疫苗產(chǎn)品。
3.牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是包括以下步驟(1)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl基因的獲得以提取RNA常規(guī)方法提取的牛病毒性腹瀉病毒基因組RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄_聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增Etl基因，擴(kuò)增所用的引物序列如下上游5 ‘ -CCGGATCCACCATGGAAAACATA ACACAGTGG-3 ‘；下游5 ‘ -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3 ‘，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈 式反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，按維特潔DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，回收得到Etl基因；(2)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體構(gòu)建將步驟⑴得到的目的基因分別用DNA限制性內(nèi)切酶雙酶切經(jīng)凝膠純化的目的基因產(chǎn) 物及植物表達(dá)載體DNA，用T4 DNA連接酶在16°C條件下連接16h，取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌工程菌，挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落抽提質(zhì)粒，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和DNA限制性 內(nèi)切酶雙酶切鑒定后，進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體序列分析，篩選得 到含牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的工程菌，大量培養(yǎng)重組菌株，用堿 裂解法大量制備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體，用緩沖液將其稀釋成濃度為 l-2ng/yl的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體；(3)牛病毒性腹瀉病毒基因Etl花粉管通道法轉(zhuǎn)化黃芪大量培養(yǎng)重組工程菌，用堿裂解法大量制備牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá) 載體，7月中旬期間，選取花多、大而整齊的兩年生膜莢黃芪，用注射器將步驟(2)得到的 l-2ng/y 1的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl重組植物表達(dá)載體溶液滴注于半開(kāi)放的、顏色鮮艷 的花的柱頭之上，去除已經(jīng)開(kāi)放、花色暗淡的花朵以及還未開(kāi)放的花朵，待種子成熟時(shí)收獲 種子，室溫保存，對(duì)收獲種子種植得再生苗，對(duì)再生苗分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定和反轉(zhuǎn) 錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法鑒定及蛋白質(zhì)電泳法鑒定，篩選出牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪；(4)牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗的篩選對(duì)牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因藥用植物，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法篩選具有 免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因Etl轉(zhuǎn)化的黃芪，得本發(fā)明疫苗產(chǎn)品。
全文摘要
牛病毒性腹瀉病毒轉(zhuǎn)基因黃芪疫苗及生產(chǎn)方法，用于動(dòng)物牛病毒性腹瀉病防治，克服現(xiàn)有的滅活苗，核酸疫苗免疫原性差、保護(hù)力低，活毒疫苗使用不安全的缺點(diǎn)。本發(fā)明是以牛病毒性腹瀉病毒RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得其E0基因，再構(gòu)建其基因E0重組植物表達(dá)載體，然后采用花粉管通道法，得到牛病毒性腹瀉病毒E0基因轉(zhuǎn)化黃芪。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法篩選具有免疫源性的牛病毒性腹瀉病毒基因E0轉(zhuǎn)化的黃芪，得疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果是將牛病毒性腹瀉病毒E0基因在黃芪中表達(dá)，既產(chǎn)生保護(hù)性抗原又產(chǎn)生增強(qiáng)免疫作用的佐劑物質(zhì)，提高了黃芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。還有易生產(chǎn)、使用方便、穩(wěn)定性強(qiáng)、無(wú)負(fù)作用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/83GK101934073SQ201010120759
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月6日
發(fā)明者于文影, 劉佳佳, 張連學(xué), 李然, 李璠瑛, 杜銳, 王亞興, 王全凱, 王南, 臧埔, 郜玉鋼 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)