專利名稱：甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs的分子標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于油菜分子育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘藍(lán)型油菜粒重有關(guān)QTL 的發(fā)現(xiàn)和分離，以及有關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.，以下簡稱油菜)是世界上最重要的油料作物之 一。油菜的種子不僅是油和蛋白質(zhì)的儲藏器官，同時(shí)也是植物生命周期延續(xù)的器官。 種子大小或重量是非常重要的經(jīng)濟(jì)性狀。首先粒重是構(gòu)成植物單株產(chǎn)量的三大因素之 一(單株有效角果數(shù)、每角果粒數(shù)、粒重)，因此也決定著產(chǎn)量(Clarke and Simpson， 1978 ； Butraille et al.，1999 ； Shietal.，2009)；其次，種子大小也與含油量和蛋白質(zhì)含 量有關(guān)系(Morgan et al., 1998 ； Lionneton et al.，2004)；再次，大種子通常在萌發(fā)過程 中有更好的適應(yīng)性。因此，弄清種子大小或重量形成的遺傳基礎(chǔ)，對油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的 改良十分重要。此外，從進(jìn)化的角度來看，弄清種子大小的變化也有著非常重要的意 義。
盡管油菜的種子大小非常重要，但目前對其遺傳控制仍缺乏深入的了解。和 其它產(chǎn)量相關(guān)性狀相比，粒重的遺傳力較高(Liuet al.，1987 ； Qi et al., 2004 ； Shiet al., 2009)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，目前也定位了一些油菜粒重的數(shù)量性狀位點(diǎn) (Quantitative Trait Loci, QTL)。Quijada et al. (2006)利用四個(gè)群體的二年二點(diǎn)試驗(yàn)定位 了三個(gè)和粒重有關(guān)的QTLs(位于N7，N17和N19)，但在不同群體間沒有相同的QTL存 在；Udall et aU2006)分別在Hua Double Haploid(DH)群體、SYN DH群體和測交群體等 三個(gè)不同群體間分別檢測到6個(gè)、4個(gè)和5個(gè)粒重有關(guān)的QTLs，只有一個(gè)位于N14上的 QTL能在不同群體和不同環(huán)境間穩(wěn)定檢測到；最近，Shi et al.(2009)利用油菜的二個(gè)群 體在10個(gè)不同環(huán)境下一共檢測到159個(gè)粒重QTLs，這些QTLs分布在除了 Cl以外的其 它所有染色體上。
利用模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)，在過去的十多年中利用突變體分 析等手段，對種子大小的分子調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。Alonson-Blanco et al.，(1999)定 位了 11個(gè)和種子大小有關(guān)的QTLs，第一次揭示了這個(gè)性狀在不同材料間的遺傳復(fù)雜 性。最近，對大量突變體的分析，進(jìn)一步闡明了許多決定種子大小的分子機(jī)理。例 如TTG2 (Transparent Testa Glabrous 2)基因突變體，影響種皮中的類黃酮素的積累，通 常會減少粒重(Debeaujon et al., 2000, 2003)。而 AP2 (APETELA2)或者 ARF2 (Auxin Response Factor 2)等轉(zhuǎn)錄因子的突變可使種子變大(Jofuku et al.，2005 ； Ohto et al., 2005 ； Schruffet al., 2005)。Luo et al. (2005)鑒定了二個(gè)小種子突變體 IKU2 (HAIKU2) 和MINI3 (MINISEED3)，并首次提出種子大小遺傳控制的可能代謝途徑。鑒于油菜和擬 南芥非常相近的同源關(guān)系，預(yù)期可以利用擬南芥的信息，從油菜基因組中獲得有關(guān)控制 種子大小的同源基因。
過去的幾年中，利用不同類型的標(biāo)記構(gòu)建了多張遺傳連鎖圖譜。但由于缺乏足夠的共線性標(biāo)記，圖譜的整合目前尚進(jìn)展緩慢。目前，多個(gè)從事蕓薹屬(Brassica)研究的 團(tuán)體在致力于微衛(wèi)星標(biāo)記MSRmarker)的開發(fā)。運(yùn)用SSR標(biāo)記可使遺傳連鎖圖的構(gòu)建更 加容易并增強(qiáng)可重復(fù)性(Loweet al.，2004 ； Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe等，2002; Chen等.，2009)。但是目前為止，由于SSR標(biāo)記的數(shù)目仍有限，使得QTL定位研究在 不同群體間的橫向?qū)Ρ冗€比較困難。
目前在油菜中未見能在不同遺傳背景下穩(wěn)定檢測到的粒重有關(guān)的主效QTLs的報(bào) 道，對粒重有關(guān)基因的克隆和分析的報(bào)道也非常少。鑒于粒重性狀的重要性，對油菜中 粒重有關(guān)的QTLs的鑒定，以及緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)對促進(jìn)油菜產(chǎn)量和品質(zhì)育種是十 分必要的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs及其緊密連鎖的分子標(biāo)記及用于 甘藍(lán)型油菜粒重性狀的選育。本發(fā)明為油菜粒重育種提供新手段，加速油菜粒重性狀改 良進(jìn)程，提高育種的準(zhǔn)確性和選擇效率。
本發(fā)明是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的。
a)用甘藍(lán)型油菜甲A254(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢 市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO : P200909)與甘 藍(lán)型油菜甲A177(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的 中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNO P200908)雜交，得到Fl ；
b)種植步驟a)的F1，從所述的Fl植株的花蕾中通過小孢子培養(yǎng)(余鳳群等， 1997)獲得分離的雙單倍體(DH)系群體；
C)對DH系群體的每一個(gè)株系進(jìn)行分子標(biāo)記分析，并對每個(gè)株系的基因型進(jìn)行 描述；具體方法分離DH群體每一個(gè)系的基因組DNA，采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物在6% (100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-雙丙烯酰 胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個(gè)株系基因型；
d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用步驟C)中得到的每個(gè)株系基因 型構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖，遺傳連鎖圖的構(gòu)建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.， 1992)軟件進(jìn)行；
e)測定DH群體每個(gè)系的成熟種子的千粒重?cái)?shù)值；
f)將DH群體每個(gè)株系的千粒重與甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖 和QTL分析，QTL檢測采用QTL Cartographer V2.0 (Wang et al., 2007)軟件中的復(fù)合區(qū) 間作圖法(CIM)進(jìn)行，以2.0為LOD閾值，大于2.0說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，從而確定 和粒重主效QTLs連鎖的SSR分子標(biāo)記BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID NO 5 和 SEQ IDNO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示；
g)對上述DH群體檢測到的粒重主效QTLs的驗(yàn)證利用和甲A254、甲A177不 同遺傳背景和來源的大粒材料甲7046和小粒材料甲7005雜交，得到Fl ；由雜種Fl套袋 自花授粉獲得F2代，獲得F2群體；利用和上述DH群體同樣方法檢測粒重QTL;發(fā)現(xiàn) 和在DH群體中檢測到的二個(gè)粒重主效QTLs在不同來源和遺傳背景下均能穩(wěn)定存在；
h)利用上述步驟f)的二個(gè)QTLs峰值最近的標(biāo)記即BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫(http://www.brassica_rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源區(qū)段，得到白菜A7上 的二個(gè) BAC KBrB084P16 和 KBrH001J06 ；利用在線軟件 Batchprimer3 設(shè)計(jì)二對 BAC 特異性SSR標(biāo)記；根據(jù)序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到能夠區(qū)分甘藍(lán)型油菜大粒種子與小粒種 子的共顯性SSR分子標(biāo)記，即10509和J0609，所述的分子標(biāo)記10509和J0609的核苷酸 序列分別如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2以及SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
i)利用分子標(biāo)記10509、J0609對DH系的基因型進(jìn)行分析，同時(shí)存在10509、 J0609標(biāo)記基因型和甲A2M帶紋一致的判定為大粒材料；同時(shí)存在10509、J0609標(biāo)記基 因型和甲A177帶紋一致的判定為小粒材料。
在上述方法中，所用分子標(biāo)記引物對的核苷酸序列如下所示
引物對(1)，編號為10509
正向引物5' -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3‘，
反向引物5' -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3‘。
引物對O)編號為J0609
正向弓丨物5' -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3‘，
反向引物5' -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3‘。
其中，引物對10509是序列表中SEQ IDNO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸 序列，引物對J0609是序列表中SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的積極效果
本發(fā)明的油菜粒重主效QTLs及其位點(diǎn)特異性標(biāo)記與現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的不同，運(yùn)用 這些標(biāo)記可鑒別甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs位點(diǎn)，從而可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進(jìn)行 選擇的缺點(diǎn)。利用本發(fā)明制備的分子標(biāo)記可進(jìn)行甘藍(lán)型油菜粒重性狀的分子標(biāo)記輔助選 擇，其中本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩對引物10509和J0609還可以用于甘藍(lán)型油菜粒重性狀的精細(xì)定 位和圖位克隆，可以明顯減少育種工作量，縮短育種年限，加快油菜育種的進(jìn)程。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如《具體實(shí)施方式
》所述。


圖1 本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2:利用引物對10509、J0609在甘藍(lán)型油菜甲A2M和甘藍(lán)型油菜甲A177及其 Fl的基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。10509和J0609引物對的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是在6% (IOOml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-雙丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠 上電泳分離的圖片。
圖3:不同群體間A7連鎖群上粒重QTL的定位結(jié)果。左圖為本發(fā)明涉及的DH 群體的A7遺傳連鎖圖和粒重QTL的定位結(jié)果；右圖為Shietal. ^)09)報(bào)道的TN群體上 A7遺傳連鎖群上的粒重QTL區(qū)間qSW.A7-2的定位結(jié)果。圖中帶下劃線的標(biāo)記為不同 群體間的共同標(biāo)記，虛線為不同群體間的共線性關(guān)系。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 甘藍(lán)型油菜中粒重主效QTLs位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記的獲得
(1)甘藍(lán)型油菜粒重定位群體甲A254/甲A177的DH群體的構(gòu)建及田間試驗(yàn)和 千粒重分析采用以甘藍(lán)型油菜甲A254(大粒純系)為母本，甘藍(lán)型油菜甲A177(小粒純 系)為父本進(jìn)行雜交得到Fl，種植F1，從Fl植株上取花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)得到雙單倍體 (DH)分離群體，共得到238個(gè)系的DH系，隨機(jī)選取190個(gè)系用于全基因組的遺傳連鎖 圖的構(gòu)建和粒重QTL的定位。
將上述得到的DH系和其親本甲A254/甲A177及F1，于2007-2008年度和 2008-2009年度種植到田間，田間試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，三次重復(fù)，每一個(gè)系種二 行，每行11-12個(gè)單株，株距平均Mcm左右，行間距30cm。所有材料種植于武漢華中 農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗(yàn)田，為冬油菜種植環(huán)境。田間管理按一般育種大田管理。
每年5月份從田間收割回成熟的試驗(yàn)材料，從自由授粉的單株上脫下種子，清 理掉雜質(zhì)和不飽滿的種子，至少放置4周以上，在空氣中自然干燥。每個(gè)單株隨機(jī)取500 粒飽滿種子，三次重復(fù)，單株內(nèi)誤差不超過O.lg，超過后放回混勻再取，然后算取平均 值折算成千粒重(1000粒種子的重量)數(shù)值，親本、Fl和DH每個(gè)系取10-15個(gè)單株， 算取平均值為其千粒重值(相關(guān)數(shù)據(jù)見表1)。
(2) DH群體的遺傳連鎖圖構(gòu)建和粒重QTL分析
選取在二個(gè)親本間具有擴(kuò)增多態(tài)性的SSR引物對190個(gè)DH系根據(jù)已有方法 (Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe et al.，2002 ； Lowe et al.，2004 ； Chen et al.，2009) 進(jìn)行分析，分離每個(gè)DH系的基因組DNA，采用上述篩選得到的有多態(tài)性的SSR引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6% (100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克 甲叉-雙丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個(gè)株系基 因型和群體的分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的群體基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖 圖。遺傳連鎖圖的構(gòu)建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.，1992)軟件進(jìn)行，連鎖群劃 分的參數(shù)設(shè)置為LOD值為9.0，最大距離為30cM，每一個(gè)連鎖群的確定利用order，try 和ripple等命令。作圖群體中連鎖群中的共同標(biāo)記和錨定標(biāo)記來自Parkin et al. (1995)， Lowe et al. (2004)，Piquemal et al. (2005)，Qiu et al. (2006) and Chen et al. (2009)等文章中 的信息，二個(gè)位點(diǎn)間的遺傳距離的計(jì)算采用“hsambi”參數(shù)(Lincoln等，1992 ； Lowe 等，2004 ； Chen 等，2009)。
將DH群體每個(gè)株系的千粒重?cái)?shù)據(jù)與甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連 鎖和QTL分析，QTL的檢測采用QTL Cartographer V2.0 (Wanget al.，2007)軟件中的復(fù)合 區(qū)間作圖法(CIM)進(jìn)行，QTL檢測前，其參數(shù)設(shè)定為選擇“forward-backward stepwise regression”模式，檢測間隔的窗口大小選擇10cM，參數(shù)設(shè)定為模式6 Pin = 0.05, Pout =0.05，檢測時(shí)，LOD值默認(rèn)為2.0，QTL的置信區(qū)間的確定以在峰值所在的LOD-I所 包含的峰值二端所對應(yīng)在遺傳連鎖圖上的位置。置信區(qū)間有重疊部分認(rèn)為是在不同的環(huán) 境和群體間有相似位置的QTL。
在二年的試驗(yàn)中，一共在6條染色體上(Al，A2，A5，A7，AlO和C4)檢 測到9個(gè)千粒重的QTLs，這些QTLs分別能解釋3.66-20.76 %的表型變異(表2)。特 別指出的是，在A7染色體上的TSW7a和TSW7b，在二年中都能檢測到，而且表現(xiàn)出最大的效應(yīng)，一共能解釋所有粒重變異的27.64-37.90%。TSW7a的QTL位點(diǎn)位于 BoGMS715-BnEMS858區(qū)間內(nèi)，在2007年能解釋千粒重性狀的17.14%,在2008年能 解釋18%左右。二年的QTL峰值有些微移動，但都共同的置信區(qū)間。在二年中來自甲 A254的等位基因能對千粒重增加0.14-0.17g。TSW7b位點(diǎn)同樣有相當(dāng)大的效應(yīng)，在2007 年能解釋20.76%的變異，2008年能解釋9.86%的變異，來自甲A254的等位基因能對千 粒重增加0.12-0.15g，在二年中此QTL的位點(diǎn)都穩(wěn)定的存在于IOUcM處。除此之外仍 然還有7個(gè)QTLs僅在其中的一年能檢測到，這些QTLs位點(diǎn)的效應(yīng)都非常的小，僅能解 釋表型變異的3.66%到8.86%。來自甲A254的等位基因?qū)SW5a，TSW5b, TSW5c, TSWlO和TSW14起正向作用，對TSWl和TSW2起負(fù)向作用。
(3)對DH群體中發(fā)現(xiàn)的粒重主效QTLs位點(diǎn)的驗(yàn)證
搜尋粒重定位有關(guān)的文獻(xiàn)和最近的文章(Shi et al.，2009)，有一些粒重QTLs定 位在A7染色體上，其中有一個(gè)在共同的標(biāo)記SR0282R上，和本研究中發(fā)現(xiàn)的TSW7b的 QTL位點(diǎn)吻合(見圖3)。
以上的結(jié)果說明在不同的遺傳背景下均能在A7染色體上檢測到千粒重的主效 QTLs,說明A7染色體上的千粒重位點(diǎn)是保守的，可以用來后續(xù)的粒重主效QTLs位點(diǎn)特 異性的標(biāo)記開發(fā)。
(4)粒重主效QTLs位點(diǎn)特異性標(biāo)記的獲得
為了開發(fā)A7連鎖群上離粒重主效QTLs位點(diǎn)連鎖更加緊密的標(biāo)記，利用離這 二個(gè)粒重主效QTLs峰值最近的二個(gè)標(biāo)記BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫 (http://www.brassica-rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源區(qū)段，位于白菜 A7 上的二個(gè) BAC KBrB084P16和KBrH001J06分別位于TSW7a和TSW7b 二個(gè)主效QTLs區(qū)段附近。因 此禾1J用在線軟件(http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)設(shè)計(jì)了 二對BAC特異性SSR標(biāo)記。來自KBrB084P16的10509和來自KBrHOO 1J06的J0609通 過按上述同樣的方法重新構(gòu)建遺傳連鎖圖和QTL掃描，發(fā)現(xiàn)這二個(gè)標(biāo)記分別定位在這二 個(gè)粒重主效QTLs位點(diǎn)峰值處。10509和J0609分別和這二個(gè)粒重主效QTLs位點(diǎn)緊密連 鎖；結(jié)果還顯示這二個(gè)標(biāo)記分別對TSW7a (從10.36增加到11.4 和TSW7b (從10.37增 加到11.13)的LOD值有所增加。
實(shí)施例2 甘藍(lán)型油菜中粒重主效QTLs位點(diǎn)特異性標(biāo)記的有效性驗(yàn)證
(1)甘藍(lán)型油菜中粒重主效QTLs位點(diǎn)特異性標(biāo)記的驗(yàn)證
為了檢測在表型變異上10509和J0609 二個(gè)標(biāo)記的主要效果，在DH群體中，每 一個(gè)系以這二個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分組，并進(jìn)行千粒重的平均值進(jìn)行計(jì)算。對于10509位 點(diǎn)，在AA基因型(來自于甲A254的等位基因位點(diǎn))組1在二年中包含來自于甲A254的 正向加性效應(yīng)的等位基因數(shù)目明顯比來自于甲A177的要高。對于J0609有同樣的趨勢(表 3)。從表中的結(jié)果可以看出，在甘藍(lán)型油菜中位于A7的二個(gè)位點(diǎn)是決定粒重的主要因子。
(2)甘藍(lán)型油菜中粒重QTLs位點(diǎn)的組合效應(yīng)驗(yàn)證
在DH群體中檢測粒重QTLs位點(diǎn)的組合效應(yīng)，DH群體的系以A5和A7上的 QTLs的基因型進(jìn)行分組并比較其粒重的變化(表4)。由于A5上的三個(gè)QTLs緊密的連 鎖在一起，在DH群體中很少獲得重組系，則將A5上的三個(gè)位點(diǎn)簡化為一個(gè)位點(diǎn)用于基 因型的分類。從而三個(gè)位點(diǎn)在DH群體中應(yīng)有8種基因型的組合(表4)。從表4的數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)三個(gè)正向加性等位基因同時(shí)存在時(shí)，粒重明顯高于當(dāng)僅有一個(gè)A7的主要位 點(diǎn)和A5位點(diǎn)存在與否時(shí)，非常清楚的說明二個(gè)A7位點(diǎn)的重要性和其效應(yīng)大小。通過表 4的數(shù)據(jù)可以看出，第一組的千粒重?cái)?shù)據(jù)(包含所有的三個(gè)正向加性等位基因)比其它所 有組的數(shù)值都要高。
利用10509、J0609對DH系的基因型進(jìn)行分析，同時(shí)存在10509、J0609標(biāo)記基因 型和甲A2M帶紋一致的為大粒材料；相反同時(shí)存在10509、J0609標(biāo)記基因型和甲Al77 帶紋一致的為小粒材料。
通過檢查DH群體所有千粒重QTLs位點(diǎn)的基因型，第75#系擁有所有正向效應(yīng) 的QTLs位點(diǎn)，其在二年的表型值中都具有最大的千粒重?cái)?shù)值(表5)。相反，第87#系 擁有所有反向效應(yīng)的QTLs位點(diǎn)，其在二年中都具有最小的千粒重?cái)?shù)值。
以上的結(jié)果說明可以利用這些標(biāo)記的信息用于粒重的分子標(biāo)記輔助選擇，并且 應(yīng)用這些標(biāo)記對粒重的基因型選擇也是非常準(zhǔn)確的。
表1 親本、Fl和分離群體的千粒重?cái)?shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種與甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在 于，它是通過如下方法獲得的用甘藍(lán)型油菜葉片分離的DNA，采用引物對 5 ‘ -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3 '禾Π 5 ‘ -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3 ‘； 5 ‘ -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3 '禾口 5 ‘ -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3 ‘分 別對甘藍(lán)型油菜甲Α2Μ和甲Α177進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上 電泳分離后，分別獲得分子標(biāo)記10509和J0609，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列分別如序 列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 所示。
2.用于擴(kuò)增與甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標(biāo)記10509和J0609的引物對 的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 1 和 SEQ IDNO 2、SEQ IDNO 3 禾口 SEQ IDNO 4所示。
3.—種與甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟a)用甘藍(lán)型油菜甲A254為母本與甲A177為父本雜交，得到Fl；b)種植步驟a)的F1，從所述的Fl植株的花蕾中通過小孢子培養(yǎng)獲得分離的雙單倍 體(DH)群體；c)對DH群體中的每一個(gè)株系進(jìn)行分子標(biāo)記分析，分離DH群體每一個(gè)株系的基因組 DNA,采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)銀 染、顯影后，獲得每個(gè)株系的基因型；d)用步驟c)中獲得基因型構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖；e)測定DH群體每個(gè)株系的成熟種子的千粒重?cái)?shù)值；f)將DH群體每個(gè)株系的千粒重與甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和 QTL分析，得到粒重主效QTLs連鎖的SSR分子標(biāo)記BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷 酸序列如序列表 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8所示；g)利用離步驟f)中的分子標(biāo)記BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫的同源區(qū) 段，找到白菜A7上的二個(gè)BAC，即KBrB084P16和KBrH001J06 ；h)利用在線軟件Batehprimed設(shè)計(jì)二對BAC特異性SSR引物，它的核苷酸序列分別 如序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示； 根據(jù)序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的 引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到能夠區(qū)分甘藍(lán)型油菜大粒種子與小粒種子的共顯性SSR 分子標(biāo)記，即10509和J0609，所述的分子標(biāo)記10509和J0609的核苷酸序列分別如序列表 SEQ IDNO 1 禾口 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ IDNO 4 所示。
4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜粒重性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的引物對在甘藍(lán)型油菜粒重性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中包括在甘藍(lán)型油菜粒重性狀的精細(xì)定位和圖位克隆中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于油菜分子育種和分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜粒重主效QTLs位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記的制備，該標(biāo)記可用于在甘藍(lán)型油菜粒重性狀改良中的分子標(biāo)記輔助選擇以及在粒重性狀位點(diǎn)精細(xì)定位和圖位克隆。本發(fā)明的特征是，以甘藍(lán)型油菜甲A254(大粒純系材料)為母本與甘藍(lán)型油菜甲A177(小粒純系材料)為父本雜交構(gòu)建雙單倍體(DH)，對該DH群體基因型和千粒重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得了與粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標(biāo)記，將其命名為I0509和J0609。對該分子標(biāo)記標(biāo)記進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證應(yīng)用。本發(fā)明為油菜粒重的分子育種提供了一種新的遺傳標(biāo)記，也為甘藍(lán)型油菜的千粒重性狀位點(diǎn)的精細(xì)定位和相關(guān)基因的圖位克隆提供了有用信息。
文檔編號C12N15/11GK102021235SQ20101012072
公開日2011年4月20日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者傅廷棟, 周永明, 范楚川, 蔡光勤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)