本發(fā)明屬于油菜育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速批量選育CMS恢復(fù)系的育種方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)幅員遼闊，自然條件復(fù)雜多樣，甘藍(lán)型油菜種植區(qū)域跨度很大。從播種時(shí)期分為春油菜區(qū)(春播區(qū))和冬油菜區(qū)(秋播區(qū))，而冬油菜區(qū)又根據(jù)氣候類型和特點(diǎn)分為4個(gè)大區(qū)，包括長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)。不同生態(tài)區(qū)光照、溫度、水分、土壤等條件差別很大，而甘藍(lán)型油菜對(duì)光照、溫度、水分等氣候條件較為敏感，同一品種在不同生態(tài)區(qū)的表現(xiàn)差別很大。

目前國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源保護(hù)手段有限，出于單位自身利益考量，各育種單位之間種質(zhì)資源交流、合作育種等很難進(jìn)行，加上長(zhǎng)期的自然進(jìn)化和人工選擇，不同單位所擁有的種質(zhì)資源，大多僅適于本生態(tài)區(qū)，導(dǎo)致跨區(qū)域品種選育難度大、效率低，限制了我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前為了跨區(qū)域品種選育，有實(shí)力的單位在目標(biāo)推廣區(qū)域建立育種基地，但這對(duì)人力、物力、財(cái)力要求較高，一般單位很難做到。另外，油菜自身的性狀遺傳具有一定的保守性，對(duì)一個(gè)育種單位而言，其所擁有的種質(zhì)資源，要適應(yīng)新的目標(biāo)生態(tài)區(qū)，即使在該區(qū)域建立育種基地，還需要一個(gè)漫長(zhǎng)的馴化和選育過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速批量選育CMS恢復(fù)系的育種方法，旨在解決目前國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源保護(hù)手段有限，出于單位自身利益考量，各育種單位之間種質(zhì)資源交流、合作育種等很難進(jìn)行，加上長(zhǎng)期的自然進(jìn)化和人工選擇，不同單位所擁有的種質(zhì)資源，大多僅適于本生態(tài)區(qū)，導(dǎo)致跨區(qū)域品種選育難度大、效率低，限制了我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)恢復(fù)系的快速、批量選育方法,包括如下步驟：

1)以長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)國(guó)審的18個(gè)甘藍(lán)型油菜CMS三系雜交品種等量混合做為聚合親本；

2)當(dāng)年秋播，把聚合親本按1:2行比種植在隔離網(wǎng)室，行比1的做父本，行比2的做母本；

3)在蕾苔期，利用化學(xué)雜交劑“SX-1”誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育；

4)在油菜花期，通過人工輔助授粉，使母本充分授粉結(jié)實(shí)，成熟時(shí)僅收取母本種子，做為下一個(gè)輪回的親本；

5)重復(fù)步驟2)到步驟4)，直至進(jìn)行4個(gè)世代的輪回；

6)把經(jīng)過4個(gè)世代輪回產(chǎn)生的聚合群體秋季播種，第2年花期，選用該群體正?？捎仓曛骰ㄐ蚝蜕喜糠种ι祥L(zhǎng)度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙堿加倍染色體48小時(shí)，通過小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體(DH)分離群體。

7)把該DH分離群體中正?？捎闹晗捣謩e種植在4個(gè)不同生態(tài)區(qū)，依據(jù)各生態(tài)區(qū)的育種目標(biāo)進(jìn)行表現(xiàn)型選擇，同時(shí)和CMS不育系測(cè)交進(jìn)行基因型鑒定，最終選育出一批分別適應(yīng)長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)的優(yōu)良CMS恢復(fù)系。

進(jìn)一步,所選擇的聚合親本來自于4個(gè)不同生態(tài)區(qū)域，均為國(guó)內(nèi)多個(gè)育種單位選育的優(yōu)良國(guó)審品種，囊括了不同生態(tài)區(qū)域、不同育種單位的眾多優(yōu)良性狀基因。

進(jìn)一步,18個(gè)CMS三系雜交種等量混合構(gòu)成的聚合親本，其基因型為S(R,r)，經(jīng)過4個(gè)世代聚合重組產(chǎn)生新的聚合群體；花期取聚合群體正常植株的花蕾經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的DH分離群體，不育株系直接淘汰；正常株系分別種植在4個(gè)生態(tài)區(qū)，依據(jù)各生態(tài)區(qū)育種目標(biāo)進(jìn)行表現(xiàn)型選擇符合育種目標(biāo)的優(yōu)良株系與CMS不育系進(jìn)行測(cè)交。。

進(jìn)一步,把獲得的DH分離群體分別放在4個(gè)不同生態(tài)區(qū)進(jìn)行表現(xiàn)型選擇，選育出的新的CMS恢復(fù)系，必然符合該生態(tài)區(qū)域的育種目標(biāo)。

進(jìn)一步,利用化學(xué)雜交劑“SX-1”誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育，其技術(shù)要求如下：

1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾長(zhǎng)2mm左右時(shí)，利用化學(xué)雜交劑“SX-1”涂抹油菜莖干，誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育。由于18個(gè)品種生育期進(jìn)程并不一致，所以在蕾苔期，對(duì)母本行滿足要求的植株逐個(gè)進(jìn)行涂莖處理。

2)涂莖誘導(dǎo)方法：吸取“SX-1”原液用食用油配成濃度為5.5-6.5mg/L的藥液，用毛筆涂抹在油菜莖干上，涂抹位置距離地面10cm左右，涂抹長(zhǎng)度5cm左右。

本發(fā)明方法所構(gòu)建的聚合親本，來自于冬油菜區(qū)4個(gè)不同生態(tài)區(qū)域，13個(gè)育種單位，且均為國(guó)審優(yōu)良品種，包含有眾多適于不同生態(tài)區(qū)域的優(yōu)良性狀基因。借助化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育技術(shù)，進(jìn)行4個(gè)世代的聚合重組，各優(yōu)良品種進(jìn)行了充分的互交，眾多優(yōu)良性狀基因進(jìn)行了充分的聚合重組，從而產(chǎn)生了一個(gè)擁有眾多新的優(yōu)良性狀基因的聚合群體。通過小孢子培養(yǎng)獲得的DH分離群體，放在4個(gè)不同生態(tài)區(qū)進(jìn)行性狀選擇和基因型鑒定，最終選育出一批分別適于各自生態(tài)區(qū)域的優(yōu)良CMS恢復(fù)系。

與傳統(tǒng)跨區(qū)育種方法相比，本發(fā)明方法具有以下優(yōu)勢(shì)：1)目標(biāo)針對(duì)性強(qiáng)、效率高，所構(gòu)建的聚合群體自身就包含有4個(gè)目標(biāo)生態(tài)區(qū)的優(yōu)良性狀基因，最終選育出的是一批適于各自生態(tài)區(qū)的優(yōu)良CMS恢復(fù)系，這對(duì)于加速跨生態(tài)區(qū)育種進(jìn)程、提高育種效率具有極其重要的意義。2)該方法中優(yōu)良性狀基因雖然來自于國(guó)內(nèi)多個(gè)育種單位，但均為公開發(fā)售的國(guó)審優(yōu)良品種，不存在資源交流和品種權(quán)糾紛問題，對(duì)選育的優(yōu)良CMS恢復(fù)系，本單位擁有完全知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的CMS恢復(fù)系選育圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明目的在于提供一種快速批量選育甘藍(lán)型油菜CMS恢復(fù)系的方法。與傳統(tǒng)跨區(qū)域品種選育相比，利用該方法選育甘藍(lán)型油菜CMS恢復(fù)系目標(biāo)性更強(qiáng)、效率更高，并且不存在資源交換和品種權(quán)糾紛問題。

如圖1所示，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種甘藍(lán)型油菜CMS恢復(fù)系的快速批量選育方法，包括如下步驟：

1)以長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)國(guó)審的18個(gè)甘藍(lán)型油菜CMS三系雜交品種(見附表)等量混合做為聚合親本；

2)當(dāng)年秋播，把聚合親本按1:2行比種植在隔離網(wǎng)室，行比1的做父本，行比2的做母本；

3)在蕾苔期，利用化學(xué)雜交劑“SX-1”誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育；

4)在油菜花期，通過人工輔助授粉，使母本充分授粉結(jié)實(shí)，成熟時(shí)僅收取母本種子，做為下一個(gè)輪回的親本；

5)重復(fù)步驟2)到步驟4)，直至進(jìn)行4個(gè)世代的輪回；

6)把經(jīng)過4個(gè)世代輪回產(chǎn)生的聚合群體秋季播種，第2年花期，選用該群體正常可育植株主花序和上部分枝上長(zhǎng)度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙堿加倍染色體48小時(shí)，通過小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體(DH)分離群體。

7)把該DH分離群體中正常可育的株系分別種植在4個(gè)不同生態(tài)區(qū)，依據(jù)該生態(tài)區(qū)的育種目標(biāo)進(jìn)行表現(xiàn)型選擇，同時(shí)和CMS不育系測(cè)交進(jìn)行基因型鑒定，最終選育出一批分別適應(yīng)長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)的優(yōu)良CMS恢復(fù)系。

18個(gè)CMS三系雜交種等量混合構(gòu)成的聚合親本，其基因型為S(R,r)，經(jīng)過4個(gè)世代聚合重組產(chǎn)生的新的聚合群體，理論上其不育植株S(r,r)占1/4，正常植株S(R,R)和S(R,r)共占3/4?；ㄆ谌【酆先后w正常植株花蕾經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的DH分離群體，理論上不育株系S(r,r)占DH群體總數(shù)的1/3，恢復(fù)株系S(R,R)占2/3。在油菜花期，不育株系直接淘汰；正?？捎晗捣謩e種植在長(zhǎng)江上、中、下游和黃淮區(qū)，依據(jù)各生態(tài)區(qū)育種目標(biāo)進(jìn)行表現(xiàn)性選擇；符合育種目標(biāo)的株系與CMS不育系進(jìn)行測(cè)交，能夠恢復(fù)CMS不育系育性的株系即為恢復(fù)系。

更具體的技術(shù)方案如下所述：

1、利用化學(xué)雜交劑“SX-1”誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育，其技術(shù)要求如下：

1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾長(zhǎng)2mm左右時(shí)，利用化學(xué)雜交劑“SX-1”涂抹油菜莖干，誘導(dǎo)母本產(chǎn)生雄性不育。由于18個(gè)品種生育期進(jìn)程并不一致，所以在蕾苔期，對(duì)母本行滿足要求的植株逐個(gè)進(jìn)行涂莖處理。

2)涂莖誘導(dǎo)方法：吸取“SX-1”原液用食用油配成濃度為5.5-6.5mg/L的藥液，用毛筆涂抹在油菜莖干上，涂抹位置距離地面10cm左右，涂抹長(zhǎng)度5cm左右。

2、油菜小孢子培養(yǎng)方法：

1)油菜小孢子的分離提取

在油菜初花一周內(nèi)，取輪回群體正?？捎仓曛骰ㄐ蚝蜕喜糠种ㄐ蛏祥L(zhǎng)度為3.5-4.0mm的花蕾(用生物顯微鏡抽檢小孢子發(fā)育是否處于單核晚期)用蒸餾水沖洗干凈；在超凈工作臺(tái)上先用70％酒精滅菌30s，再用20％次氯酸鈉滅菌15min，然后用無菌水沖洗3次；取滅菌好的花蕾放入B5培養(yǎng)基中研磨成勻漿；用300目雙層尼龍網(wǎng)過濾，10ml離心管收集濾液，經(jīng)800rpm離心5min，吸去上清液，加入液體B5培養(yǎng)基懸浮小孢子，再離心，重復(fù)3次，吸去上清液。

2)染色體加倍

在上述離心管中加入含有0.5mmol/L秋水仙堿的NLN-13培養(yǎng)基，懸浮小孢子，并分裝于150ml三角瓶中(每瓶40-45個(gè)花蕾，20-25ml培養(yǎng)液)，用滅菌的尼龍紙封口，32℃暗培養(yǎng)48h。

3)小孢子培養(yǎng)

將經(jīng)過上述處理的溶液1000rpm離心5min，吸取上清液，去除秋水仙堿，并加入無激素的NLN-13培養(yǎng)基懸浮洗劑和離心1次，最后加入含6-BA0.05mg/L、NAA0.5mg/L的NLN-13培養(yǎng)基懸浮小孢子，接著將小孢子溶液分裝于直徑為7.5cm的無菌培養(yǎng)皿中，每皿7.5ml(每皿約5-6個(gè)花蕾)，Parafilm封口，在32℃的水浴恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)移至25℃的水浴恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)肉眼可見胚時(shí)，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至搖床上，在25℃下40-60rpm暗培養(yǎng)7d。7d后改用較大的培養(yǎng)皿和含有ABA0.3mg/L的NLN-13培養(yǎng)基在25℃條件下40-60rpm搖床光照培養(yǎng)。以后用相同的培養(yǎng)條件每7d繼代1次，直到胚發(fā)育成熟，并長(zhǎng)出完整的子葉，分化成苗后將其轉(zhuǎn)移至含有6-BA0.5mg/L的B5固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代和增殖，適時(shí)移栽至大田。

附表：本發(fā)明輪回親本所用品種名錄

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。