專利名稱：一種利用原核表達系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種利用原核表達系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，可應用 于生物工程和生物技術(shù)研究等領域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)研究是生命科學中重要組成部分，其中蛋白質(zhì)分子量標準可作為蛋白質(zhì) 定性甚至定量研究的重要的工具，可用于蛋白質(zhì)電泳，蛋白質(zhì)定量及蛋白免疫印記等實 驗，目前，蛋白質(zhì)分子量標準來源較窄，眾多的蛋白質(zhì)分子量標準多是已知的天然蛋 白，分離純化復雜，分子量數(shù)值相差大，且由于天然蛋白質(zhì)修飾的復雜性，經(jīng)常出現(xiàn)不 同來源的同一蛋白電泳遷移率的差異，出現(xiàn)指示不明確的問題。同時這些標準分子量蛋 白在western雜交中常常使用預染的方式，染料與蛋白質(zhì)分子量標準的結(jié)合牢固度以及結(jié) 合量的差異影響到電泳的遷移率及指示效果，同時價格昂貴。隨著蛋白質(zhì)異源重組表達 技術(shù)的成熟，為了使重組蛋白質(zhì)的純化更為便利，越來越多的重組表達蛋白末端攜帶有 利于親和純化的標簽如his-teg等，這些蛋白的電泳檢測常常依賴于SDS-PAGE和western 雜交技術(shù)，在分析過程中使用的蛋白分子量標準往往存在上述諸多問題，同時蛋白分子 量標準不能在目標蛋白檢測過程中同步被顯示，造成操作過程繁雜等實際問題，因此開 發(fā)與目標蛋白同步顯示的蛋白質(zhì)分子量標準具有重要的價值。
本發(fā)明提供了高效生產(chǎn)攜帶特定標簽蛋白質(zhì)分子量標準系列的技術(shù)，標簽賦予 標準分子量蛋白易于檢測指示的特征。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用原核表達系 統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，包括以下步驟
(1)選擇常用低分子量標準為起始蛋白質(zhì)分子量標準A，中間蛋白分子量按 A+15，A+30, A+45, A+60, A+75,終點蛋白按A+105分子量標準設定；
(2)選擇在大腸桿菌系統(tǒng)中無或少量稀有密碼子的基因序列為模板設計引物依 次獲取不同目的片段，通過Expasy tools在線軟件分析獲取截短基因的序列，目的序列與 pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設定分子量，最適等電點在4_9之間；
(3)將目的片段按照一定的酶切位點分別插入表達載體pET^Sa，篩選的陽性克 隆分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21Star(DE3)進行誘導表達；
(4)將構(gòu)建好的分別表達多個分子量的工程菌分別進行誘導時間和誘導劑終濃度 的優(yōu)化；
(5)對不同蛋白進行表達形式的鑒定；
(6)根據(jù)目標蛋白的表達形式的不同分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標準；
所述的利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟(1)設定的蛋白 質(zhì)分子量標準從起始蛋白按15或30千道爾頓梯度遞增，間隔均勻，其中低分子量間遞增 的梯度為15kD，高分子量間遞增的梯度為30kD。
所述的利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟( 通過分別設 計引物并PCR擴增的方法得到目的基因片段；同時利用載體的ATG，最終表達的蛋白N 端帶有his標簽。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟C3)還包括將步驟(2) 獲取的不同的目的基因按照一定的酶切位點插入表達載體pET48a+后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)-star,得到一系列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工程菌。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟(4)還包括將所述 的一系列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工程菌分別接種于含50μ g/ml卡納霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴大培養(yǎng)勸后加入異丙 基-3"0-半乳糖苷到終濃度為1.011111101九，分別于誘導池，5h，7h，9h及Ilh后取同體 積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸，沸水煮 5-10min離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最優(yōu)誘導時間。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟(4)還包括將的一系 列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工程菌分別接種于含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中 220rpm/min, 37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴大培養(yǎng)勸后加入異丙基-β-D-半 乳糖苷到終濃度分別為0.2，0.5，0.8，l.lmmol/L,同時于誘導證后取同體積樣、 12000rmp/min,離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸，沸水煮 5-10min離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最適誘導劑終濃度。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟( 將所述的最優(yōu)誘 導時間及最適誘導劑終濃度，應用于工程菌的最優(yōu)誘導，收集菌體沉淀用磷酸緩沖液和TritonX-IOO重懸，冰浴，超聲破菌lOmin，高速冷凍離心并分別收集上清和沉淀，小 量進行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白的表達形式。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，步驟(6)將所述得到的鑒 定為可溶形式的蛋白上清結(jié)合鎳柱，先用PBS洗滌雜蛋白，再用濃度為含150mmOl/L咪 唑的PBS洗脫并收集目的蛋白；鑒定為包涵體形式的蛋白其沉淀先用NaCl溶液洗滌兩 次，接著用磷酸緩沖液PBS和1 % TritonX-IOO重懸超聲破菌2min，再用包涵體洗滌液洗 滌兩次，然后用包涵體洗滌液超聲破菌2min，最后用包涵體洗滌液洗滌三次，得到目的 蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標準。
所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，利用原核表達系統(tǒng)表達的 重組蛋白標簽包括His-teg、GST teg、MBP teg、Strep tag以及金黃色葡萄球菌蛋白A的抗體結(jié)合區(qū)，對應產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子量標準可與帶同種標簽的待檢測蛋白同時在檢測過 程顯示，即可指示待檢測蛋白的分子量及含量。
本發(fā)明選取了于大腸桿菌系統(tǒng)中無或少量稀有密碼子的基因序列為模板設計引 物獲取目的片段與pET-28a(+)片段連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌系統(tǒng)，表達過程中克服了因稀有密 碼子多從而造成表達中斷或表達量少的缺點，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子量標準的快速而高效的表達，同時表達中利用載體的ATG，使每個蛋白的N端都帶有6*his，研制出了即可指示 蛋白聚丙烯酰胺電泳，標示目的蛋白分子量，又可指示其他同標簽蛋白的蛋白質(zhì)分子量 標準，為蛋白質(zhì)研究提供了一個重要試劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用原核表達系統(tǒng)生長繁殖快，操作簡單，價格低 廉、外源基因表達產(chǎn)物的水平高及融合表達等優(yōu)點，人為設定常用蛋白質(zhì)分子量標準， 利用原核表達系統(tǒng)高效制備間隔均勻、有特殊標簽的蛋白質(zhì)分子量標準，形成的標準分 子量蛋白具有便于檢測指示的顯著特征。


圖1是目的基因PCR擴增圖2是重組質(zhì)粒雙酶切圖3目的蛋白誘導表達圖4是目的蛋白純化后檢測his標簽圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明，所述實驗例旨在以舉 例方式具體闡明本發(fā)明。標簽的選擇、模板基因，試劑，溫度，和其他變量的值及載體 和宿主的選擇只是舉例說明本發(fā)明的應用，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，以下說明不用于 限制本發(fā)明的范圍。
1分子量標準的選定
根據(jù)應用廣泛性的原則，選擇15kD為起始蛋白分子量標準，中斷蛋白依次 為30kD，45kD, 60kD, 75kD, 90kD,及終點蛋白120kD，低分子量間遞增的梯度為 15kD,高分子量間遞增的梯度為30kD。
2引物的設計
根據(jù)大麥CesA全長基因和大腸桿菌IacZ和DNAligase基因序列為模板，應用軟 件primer 5設計引物，且在上下游引物的5 ‘端引入酶切位點，確保最后總編碼序列的表 達產(chǎn)物是以上設計的標準分子量
權(quán)利要求
1.一種利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在于包括以下步驟(1)選擇常用低分子量標準為起始蛋白質(zhì)分子量標準A，中間蛋白分子量按A+15， A+30，A+45, A+60, A+75,終點蛋白按A+105分子量標準設定；(2)選擇稀有密碼子含量低或者無稀有密碼子的基因序列為模板，通過Expasytools 軟件分析截短基因編碼蛋白質(zhì)的序列特征，并設計引物依次獲取不同的目的片段，使目 的序列與pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設定分子量，最適等電點在4-9 之間；(3)將目的片段按照一定的酶切位點分別插入表達載體pET28a，篩選的陽性克隆分 別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21—Star(DE3)進行誘導表達；(4)將構(gòu)建好的分別表達多個分子量的工程菌分別進行誘導時間和誘導劑終濃度的優(yōu) 化，并對不同蛋白進行表達形式的鑒定；(5)根據(jù)目標蛋白的表達形式的不同分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目 的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標準。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在 于，步驟(1)設定的蛋白質(zhì)分子量標準從起始蛋白按15或30千道爾頓梯度遞增，間隔均 勻，其中低分子量間遞增的梯度為5-15kD，高分子量間遞增的梯度為30kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在 于，步驟(2)通過分別設計引物并PCR擴增的方法得到目的基因片段；同時利用載體的 ATG,最終表達的蛋白N端帶有his標簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在 于，步驟(3)還包括將步驟(2)獲取的不同的目的基因按照一定的酶切位點插入表達載體 pET-28a(+)后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)-star，得到一系列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工 程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在于， 步驟(4)還包括將所述的一系列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工程菌分別接種于含50ug/ml卡 納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴大培養(yǎng) 3h后加入異丙基-0"0-半乳糖苷到終濃度為1.011111101/1^，分別于誘導3h，5h，7h，9h及 Ilh后取同體積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液 重懸，沸水煮5-lOmin離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最優(yōu)誘導時間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在于， 步驟⑷還包括將的一系列表達蛋白質(zhì)分子量標準的工程菌分別接種于含50ug/ml卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴大培養(yǎng)3h后加 入異丙基-β-D-半乳糖苷到終濃度分別為0.2，0.5，0.8，l.lmmol/L,同時于誘導5h后 取同體積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸， 沸水煮5-lOmin離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最適誘導劑終濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在 于，步驟(5)將所述的最優(yōu)誘導時間及最適誘導劑終濃度，應用于工程菌的最優(yōu)誘導， 收集菌體沉淀用磷酸緩沖液和TritonX-IOO重懸，冰浴，超聲破菌lOmin，高速冷凍離心并分別收集上清和沉淀，小量進行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白的表達形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在于， 步驟(6)將所述得到的鑒定為可溶形式的蛋白上清結(jié)合鈷柱Talon resin，先用PBS洗滌雜 蛋白，再用含150mmOl/L咪唑的PBS洗脫并收集目的蛋白；鑒定為包涵體形式的蛋白其 沉淀先用NaCl溶液洗滌兩次，接著用磷酸緩沖液PBS和1 % TritonX-IOO重懸超聲破菌 2min,再用包涵體洗滌液洗滌兩次，然后用包涵體洗滌液超聲破菌2min，最后用包涵體 洗滌液洗滌三次，得到目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標準。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，其特征在于， 原核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白標簽包括His-tag、GST tag、MBP tag、Strep tag以及金黃 色葡萄球菌蛋白A的抗體結(jié)合區(qū)，對應產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子量標準可與帶同種標簽的待檢 測蛋白同時在western雜交檢測過程顯示，既可指示待檢測蛋白的分子量及含量，同時也 可以檢測雜交程序是否正確。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用原核表達系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標準的方法，包括以下步驟(1)選擇常用低分子量標準為起始蛋白質(zhì)分子量標準A；(2)選擇稀有密碼子含量低或者無稀有密碼子的基因序列為模板，并設計引物依次獲取不同的目的片段，使目的序列與pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設定分子量，最適等電點在4-9之間；(3)將目的片段按照一定的酶切位點分別插入表達載體pET28a-(+)，篩選的陽性克隆分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21_star(DE3)進行誘導表達；(4)對不同蛋白進行表達形式的鑒定；(5)分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標準。
文檔編號C12P21/02GK102021195SQ20101051735
公開日2011年4月20日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者李新宇, 李玉紅, 陳鵬 申請人:西北農(nóng)林科技大學