專利名稱：一種以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的制備方法，具體的說是涉及以水稻為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)人溶 菌酶蛋白的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用水稻胚乳特異表達(dá)、蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)存和目的基因密碼子優(yōu)化等技術(shù)， 在水稻胚乳特異性高效表達(dá)重組人溶菌酶，通過提純方式獲得高純度的重組人溶菌酶的原 料，該原料可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥產(chǎn)品、生物制藥、飼料添加劑、食品防腐劑等。
背景技術(shù)：
人溶菌酶(human lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N_乙酰胞壁質(zhì)聚糖 水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。 主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的0 -1，4糖苷鍵，使細(xì)胞 壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。人溶菌酶 還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。主 要功用是水解細(xì)菌細(xì)胞壁，在細(xì)胞內(nèi)，則對(duì)吞噬后的病原菌起破壞作用.該酶對(duì)革蘭氏陽 性菌中的枯草桿菌、耐輻射微球菌有分解作用。對(duì)大腸桿菌、普通變形菌和副溶血性弧菌等 革蘭氏陰性菌也有一定程度的溶解作用，其最有效濃度為0. 05%。人溶菌酶廣泛存在于人體多種組織中，在每升母乳中含有50 250mg溶菌酶蛋 白。人溶菌酶由130個(gè)氨基酸殘基組成，有4個(gè)對(duì)二硫鍵，分子量為14600道爾頓，其溶菌 活性比雞蛋清人溶菌酶高3倍，而且沒有過敏原。人溶菌酶是很穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，有較強(qiáng)的抗 熱性和耐酸堿環(huán)境，而且不會(huì)因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的處理而失活，當(dāng)轉(zhuǎn)移到水溶液中時(shí)，人溶菌酶 的活力可全部恢復(fù)；人溶菌酶作為天然防腐劑安全性高。人溶菌酶是一個(gè)多功能蛋白，在各個(gè)領(lǐng)域均有極其廣泛的應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)上可作為 一種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復(fù) 功能和促進(jìn)和增強(qiáng)免疫能力等作用。臨床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶 狀皰疹和扁平疣等。也可與抗菌藥物合用治療各種細(xì)菌和病毒感染。1992年，F(xiàn)A0/WT0的食品添加劑協(xié)會(huì)認(rèn)定人溶菌酶在食品中的應(yīng)用是安全的，可 加入到嬰兒乳制品，增加?jì)雰旱拿庖吣芰?；還可作為天然食品防腐劑，可提高其防腐效果。 同時(shí)利用水稻表達(dá)人溶菌酶的稻米添加到動(dòng)物飼料，可作為替代抗生素的效果。雖然人溶菌酶具有獨(dú)特的優(yōu)越性和多種多樣的藥理作用效果，在臨床上具有多種 重要的應(yīng)用價(jià)值，但天然人溶菌酶來源極其困難。人溶菌酶在母乳中含量較高，但其來源極 其有限。利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)是解決這一難題的有效途徑。在上世紀(jì)50年代，利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品主要是以細(xì)菌作為生物反應(yīng) 器。但由于細(xì)菌屬于原核生物，不具備真核生物的蛋白質(zhì)合成與加工系統(tǒng)，而一些蛋白質(zhì)的 生物活性是依靠蛋白質(zhì)的修飾來達(dá)到的，所以，它的應(yīng)用受到了限制。酵母作為第二代生物 反應(yīng)器，在上世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)，但由于產(chǎn)量低，其體內(nèi)修飾和加工系 統(tǒng)不完善，也限制了它的廣泛應(yīng)用。第三代生物反應(yīng)器是利用高等植物、動(dòng)物細(xì)胞作為生物
3反應(yīng)器。目前，真核生物反應(yīng)器可分為動(dòng)物和植物反應(yīng)器兩大類，動(dòng)物生物反應(yīng)器有細(xì)胞培 養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物兩種，目前一些主要的醫(yī)用抗體使用動(dòng)物CH0細(xì)胞系(或小鼠)細(xì)胞培養(yǎng) 來生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究方面主要是在轉(zhuǎn)基因乳牛的乳腺細(xì)胞表達(dá)重組蛋白以及在雞蛋蛋 清中表達(dá)重組蛋白質(zhì)。目前市場(chǎng)上的溶菌酶即主要通過雞蛋清生產(chǎn)。然而，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物無法克服動(dòng)物病原菌污染等問題。例如，通過雞蛋清生產(chǎn)的溶菌酶含有過敏 原，并且其活性比人溶菌酶低3. 5倍，因此蛋清來源的溶菌酶不能用于食品添加劑，更不能 用于嬰兒食品。另外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的成本極高，大規(guī)模生產(chǎn)需要巨大的投資，有人估計(jì)，全 世界目前只有1000公斤的生產(chǎn)單克隆抗體的能力；據(jù)計(jì)算，每擴(kuò)大1000公斤的生產(chǎn)能力， 需要投資40億美元，并要花10年的時(shí)間來建成投產(chǎn)，這些數(shù)據(jù)說明目前的重組蛋白的生產(chǎn) 能力大大地小于市場(chǎng)需求。在醫(yī)藥應(yīng)用方面沒有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，使得在醫(yī)藥上的應(yīng)用也受到限 制。目前的應(yīng)用是沒有選擇的選擇。因而急需一個(gè)高效、安全的表達(dá)系統(tǒng)來滿足巨大的市 場(chǎng)需求?；诒磉_(dá)水平高、生產(chǎn)成本低以及加工簡(jiǎn)單等顯著優(yōu)勢(shì)，種子表達(dá)體系是目前規(guī) ?；a(chǎn)較為成熟的表達(dá)體系之一。種子能夠提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，使重組蛋白表 達(dá)積累到一個(gè)較高水平；同時(shí)，種子是最佳的“天然容器”，重組蛋白在常溫下儲(chǔ)藏2-3年而 不喪失生物活性，并且由于重組蛋白貯藏在一個(gè)很小的空間，產(chǎn)品運(yùn)輸十分便利。一種較好的種子表達(dá)體系是利用水稻進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。水稻是我國(guó)乃至亞洲的主 要糧食作物，亞洲種植面積占全球的92% ；在我國(guó)具有5000多年的栽培歷史，我國(guó)種植面 積為4. 4億畝，產(chǎn)量占世界水稻產(chǎn)量的31%，水稻學(xué)名為Oryza sativa L. sp，俗名為水稻， 水稻屬于禾本科、稻屬，兩個(gè)為栽培種即亞洲栽培稻Oryza. sativa和非洲栽培稻Oryza. glaberrima，普通栽培稻(Oryza sativa)可以種植。在栽培稻種又分為秈稻和粳稻兩個(gè)亞 種。臺(tái)北309是我國(guó)臺(tái)灣育成的品種，在轉(zhuǎn)基因研究上有廣泛的應(yīng)用。美國(guó)Ventria Bioscience公司曾利用基因槍轉(zhuǎn)化獲得了表達(dá)人溶菌酶和人鐵乳 蛋白以及人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻，在1998年已得到美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)的種植批準(zhǔn)。 2008年美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)的環(huán)境署通過對(duì)這三種轉(zhuǎn)基因水稻的安全評(píng)估，認(rèn)為它們是安 全的。但是，美國(guó)Ventria Bioscience公司是采用大腸桿菌作為遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化載體，有 很多缺點(diǎn)如大腸桿菌作為遺傳物質(zhì)的受體，會(huì)有多拷貝、多位點(diǎn)的克隆，得到的表達(dá)體系 不穩(wěn)定，編輯序列也不能很好地進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)大腸桿菌作為宿主具有可能的病原污染， 存在著明顯的安全隱患，而且以大腸桿菌構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因水稻所得的鹽溶儲(chǔ)藏蛋白溶解性較差。本發(fā)明采用水稻儲(chǔ)藏醇溶谷蛋白Gtl3a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，與 Ventria Bioscience公司生產(chǎn)重組人溶菌酶使用的Gtl相比，更有效地提高了水稻胚乳細(xì) 胞蛋白的表達(dá)量，可以提高40%以上，從而比Ventria Bioscience公司的轉(zhuǎn)基因水稻具有 更高的表達(dá)并生產(chǎn)重組人溶菌酶的能力，縮短生產(chǎn)周期，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，使生產(chǎn)成 本大大降低。另外，本發(fā)明采用農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)基因載體，使轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)體系中插入的基 因片段容易檢測(cè)和控制，同時(shí)比以大腸桿菌為載體采用基因槍方法得到的轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá) 體系更穩(wěn)定，同時(shí)表達(dá)的儲(chǔ)藏蛋白水溶性更好，更利于下游純化工藝，有效提高了重組人溶 菌酶的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的利用雞蛋清生產(chǎn)溶菌酶的方法，采用粳稻品種臺(tái)北309種子成 熟的胚乳為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用雙農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將載體導(dǎo)入水稻中，獲 得可以大量生產(chǎn)人溶菌酶蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明所得的重組人溶菌酶具有表達(dá)體系穩(wěn) 定、表達(dá)效率高、成本低，規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高、無病原菌污染等優(yōu)點(diǎn)。可以大規(guī)模 生產(chǎn)來滿足市場(chǎng)需求。本發(fā)明獲得了經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因的目的基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，同時(shí)其表達(dá)的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；并獲 得了包含目的基因的農(nóng)桿菌載體(限制酶切圖譜見圖1)和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌載體 (限制酶切圖譜見圖2)。本發(fā)明提供一種以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，將水稻的 種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將人 溶菌酶基因?qū)胨局?，基因重組后的水稻能表達(dá)重組人溶菌酶蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的水稻品種為粳稻品種臺(tái)北309。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的載體為農(nóng)桿菌，優(yōu)選為JH2600、LBA4404、EHA103、 105 ；其中JH2600的轉(zhuǎn)染效果最好。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用兩種農(nóng)桿菌載體(本說明書中稱為“雙農(nóng)桿菌”)，分 別為包含目的基因的農(nóng)桿菌載體和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌載體。目的基因優(yōu)選為經(jīng)水稻密 碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。標(biāo)記基因優(yōu)選為 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。包含目的基因的農(nóng)桿菌載體優(yōu)選為p0sPMP105，包含標(biāo)記基因的農(nóng) 桿菌載體優(yōu)選為p0sPMP5。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的重組人溶菌酶蛋白在生命科學(xué)研究、醫(yī)藥 新產(chǎn)品、生物制藥、飼料添加劑以及食品防腐劑領(lǐng)域的應(yīng)用。


圖1顯示帶有密碼子優(yōu)化目的基因的農(nóng)桿菌載體p0sPMP105的限制性內(nèi)切酶圖 譜；圖2顯示帶有標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌載體p0sPMP5的限制性內(nèi)切酶圖譜；圖3顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度及其引物相對(duì)于載體的位置；圖4顯示供試轉(zhuǎn)基因品系PCR鑒定結(jié)果的圖譜；圖5顯示溶菌酶活性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6顯示Gtl3a啟動(dòng)子介導(dǎo)的重組人溶菌酶在水稻胚乳中表達(dá)的結(jié)果；圖7顯示重組人溶菌酶的細(xì)胞裂解活性的檢測(cè)；圖8顯示構(gòu)建的水稻胚乳特異性表達(dá)載體p0sPMP2 (Gtl3aSp-Stuff-Nos)的限制 性內(nèi)切酶圖譜；圖9人溶菌酶脂質(zhì)體混懸液兔鼻腔給藥的血漿藥物濃度_時(shí)間曲線(n = 6)。序列1 (SEQ ID NO. 1)水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因核苷酸序列；序列2(SEQ ID NO. 2)水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因核苷酸序列所對(duì)應(yīng)的氨基
5酸序列
序列3 (SEQIDNO.3)水稻谷蛋白基因Gtl3a的啟動(dòng)子序列；
序列4 (SEQIDNO.4)水稻胚乳特異性表達(dá)的基本載體的核苷酸序列
序列5 (SEQIDNO.5)水稻CP啟動(dòng)子的PCR正向引物；
序列6 (SEQIDNO.6)水稻CP啟動(dòng)子的PCR反向引物；
序列7 (SEQIDNO.7)抗潮霉素基因的PCR的正向引物；
序列8 (SEQIDNO.8)抗潮霉素基因的PCR的反向引物。
具體實(shí)施例方式水稻特異性的啟動(dòng)子和信號(hào)肽的獲得為了獲得較強(qiáng)的水稻胚乳特異性表達(dá)的啟 動(dòng)子和信號(hào)肽，根據(jù)生物信息學(xué)分析，采用水稻儲(chǔ)藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家族中的一個(gè) 成員Gtl3a用于PCR擴(kuò)增。為了便于基因克隆，在正向引物的5'端加了一個(gè)平末端的酶切 位點(diǎn)。從水稻品種臺(tái)北309葉片中提取基因組DNA，以此DNA片段為模板，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR 程序，用上述引物擴(kuò)增出了一個(gè)1284堿基的DNA片段。經(jīng)DNA序列分析，此DNA片段具有 明顯的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，得到了一種可介導(dǎo)重組蛋白在谷物胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，其 具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)PCR獲得Gtl3a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的序 列后，PCR產(chǎn)物經(jīng)粘性末端和平末端內(nèi)切酶消化后，將這個(gè)片段與粘性末端和平末端內(nèi)切 酶消化的PBI221片段連接，然后導(dǎo)入大腸桿菌均系DH10B中，形成了含有Gtl3a啟動(dòng)子、 Gtl3a信號(hào)肽和Nos終止子的水稻胚乳特異性表達(dá)的基本載體，并將這個(gè)載體質(zhì)粒命名為 p0sPMP2，見圖8，其具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。水稻特異性表達(dá)目的基因的農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建首先，密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基 因(具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列)通過PCR的方 法擴(kuò)增，克隆到經(jīng)限制性內(nèi)切酶MscI和Xhol消化的p0sPMP2質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌JH2600， 產(chǎn)生一個(gè)中間質(zhì)粒p0sPMP105。包含目的基因的農(nóng)桿菌插入序列大小(包括T-DNA Border)為2. 9kb左右，主要 包含有T-DNA Border序列，Gtl3a啟動(dòng)子，信號(hào)肽，密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因和Nos終止 子；目的基因是經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；目的基因的啟動(dòng)子為水稻來 源的儲(chǔ)藏谷蛋白基因Gtl3a的啟動(dòng)子，大小為1. 2kb，是一個(gè)胚乳特異性非常強(qiáng)的啟動(dòng)子； 終止子是來源于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的N0S終止子，大小為0. 3kb，是一種真核生物的終止子。選擇性標(biāo)記基因載體的構(gòu)建為了使選擇性標(biāo)記基因在水稻愈傷組織內(nèi)高效表達(dá) 而提高轉(zhuǎn)基因的選擇效果，采用水稻半胱氨酸蛋白酶0基因(Cysteine proteinase^ , CP)的啟動(dòng)子介導(dǎo)選擇性標(biāo)記基因(抗潮霉素基因-潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)在愈傷組織中的 特異表達(dá)。首先，合成了一對(duì)PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 6所示， 在PCR引物的兩端添加了 Hindlll和Smal位點(diǎn)；以水稻品種臺(tái)北309的基因組DNA為模板， 采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一個(gè)長(zhǎng)度為1103堿基、含有啟動(dòng)子的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hindlll 和Smal消化后，該P(yáng)CR片段與克隆載體PBI221(美國(guó)的克隆技術(shù)有限公司)連接，然后轉(zhuǎn) 化大腸桿菌均系DH10B，產(chǎn)生了中間質(zhì)粒p0sPMP4。選擇性標(biāo)記基因采用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hygromycin ^ Phosphotransferase, Hpt)，該基因從質(zhì)粒 pCAMBIA 1301 (澳大利亞的 哥倫比亞公司)擴(kuò)增。在正向引物(其核苷酸序列如SEQ IDN0.7所示)的5'末端加上 了一個(gè)平末端限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Smal，在反向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示) 的5'末端加上了一個(gè)粘性末端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Xhol，以Pcambia 1301質(zhì)粒為模板， 采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段。PCR產(chǎn)物用Smal和Xhol消化， p0sPMP4DNA用Nael和Xhol消化，然后將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段與具有CP (Cysteine proteinase β，CP)啟動(dòng)子的p0sPMP4質(zhì)粒經(jīng)Nael和Xhol消化的DNA片段連接，插入農(nóng) 桿菌雙元載體JH2600中，最終產(chǎn)生了水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體，命名為 p0sPMP5o包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌本發(fā)明的標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶(Hpt)基因，編 碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，可使除草劑潮霉素B中活性成份磷酸化而失去活性，從而達(dá)到篩選 轉(zhuǎn)基因愈傷組織的目的。全基因大小為2833bp (含啟動(dòng)子和終止子)，插入到農(nóng)桿菌雙元 載體JH2600中，其限制性內(nèi)切酶圖譜見圖2。Hpt基因的表達(dá)由克隆的水稻來源的愈傷組 織特異性表達(dá)的水稻半胱氨酸蛋白酶0基因(Cysteine Proteinase^基因)的啟動(dòng)子引 導(dǎo)，只在愈傷組織表達(dá)，終止子采用根瘤農(nóng)桿菌來源的Nos終止子。種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織水稻品種臺(tái)北309種子，脫去谷殼后，經(jīng)20%次氯酸 鈉消毒20分鐘，經(jīng)無菌水漂洗3次，每次10分鐘，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20-30 天的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0. 5微克的質(zhì)粒p0sPMP105和0. 5微克具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒 p0sPMP5的DNA放入愈傷組織中，在室溫(20-25°C )下反應(yīng)30分鐘，用酒精洗三次，然后采 用雙農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，目的基因和選擇性標(biāo)記基因載體隨機(jī)整合到臺(tái)北309愈傷組織的 細(xì)胞中。在含有50微克/毫升的潮霉素B的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45天的篩選，繼續(xù)生長(zhǎng)的愈傷 組織為抗潮霉素B的陽性愈傷組織。將潮霉素B抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光 照下經(jīng)20天左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基 上，經(jīng)15-20天的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室或試驗(yàn)田生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子。此 為T1種子。高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的篩選轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)過4個(gè)月左右的生長(zhǎng)和發(fā)育，抽穗開花 后，經(jīng)過一個(gè)月的時(shí)間，形成成熟的轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子，其中有50-60%的轉(zhuǎn)基因植株正 常結(jié)實(shí)。當(dāng)T1種子收獲后，從水稻成熟胚乳的粗提物，采用蛋白印跡法，篩選高效表達(dá)的轉(zhuǎn) 基因單株，利用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)的酶聯(lián)免疫技術(shù)(美國(guó)的R&D System公司產(chǎn)品)定量分析 表達(dá)量，從T1種子中篩選表達(dá)融合蛋白高的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，經(jīng)T1代的繼續(xù)選擇，形成穩(wěn)定表 達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因品系。供大面積生產(chǎn)融合蛋白之用。本發(fā)明利用水稻的胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)小分子多肽，克服了動(dòng)物、微生 物和其他植物表達(dá)體系存在的表達(dá)量低、生產(chǎn)成本高、可溶性差和安全性低等弊病。本發(fā)明利用DNA重組技術(shù)，通過水稻胚乳特異表達(dá)、蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)存和目的基因 密碼子優(yōu)化等技術(shù)，在水稻胚乳特異性高效表達(dá)重組人溶菌酶，并經(jīng)提純方式獲得高純度 的重組人溶菌酶的原料，是解決人溶菌酶規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。本發(fā)明所得的重組人溶 菌酶具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低、規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高和無病原菌污 染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用水稻儲(chǔ)藏醇溶谷蛋白Gtl3a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽， 與Ventria Bioscience公司生產(chǎn)重組人溶菌酶使用的Gtl比較，更有效地提高了水稻胚乳細(xì)胞蛋白的表達(dá)量，可以提高40%以上，從而比Ventria Bioscience公司的轉(zhuǎn)基因水稻具 有更大的生產(chǎn)重組人溶菌酶的能力，而且生產(chǎn)成本大大降低。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化 載體，使轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)體系中插入的基因片段容易檢測(cè)和控制，同時(shí)比以大腸桿菌為載 體采用基因槍方法得到的轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)體系更穩(wěn)定，表達(dá)的蛋白質(zhì)水溶性更強(qiáng)從而生物 活性更高，同時(shí)也會(huì)避免大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化載體的病原菌污染。本發(fā)明所得的重組人溶菌酶蛋白可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥產(chǎn)品、生 物制藥、飼料添加劑、食品防腐劑等，可以在醫(yī)藥臨床應(yīng)用上，通過藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery system, DDS)技術(shù)，運(yùn)用新劑型新技術(shù)，開發(fā)不同的人溶菌酶醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于醫(yī) 藥領(lǐng)域，如可做成鼻腔給藥制劑、脂質(zhì)體混懸液噴霧劑、口腔貼片、微球注射劑等等。實(shí)施例實(shí)施例1包含目的基因的農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建l、Gtl3a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的克隆為了從水稻基因組序列里克隆醇溶谷蛋白的Gtl3a基因的啟動(dòng)子與信號(hào)肽，利用 序列3的引物，采用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈(PCR)反應(yīng)，從臺(tái)北309品種的基因組DNA中擴(kuò)增到 了 1284堿基的DNA片段。擴(kuò)增的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nael和Xhol消化，克隆到載體質(zhì)粒 PBI221中，產(chǎn)生了水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)的表達(dá)載體p0sPMP2，見圖8。經(jīng)DNA序列分析， 這個(gè)DNA片段具有明顯的啟動(dòng)子特征和信號(hào)肽的序列(SEQ ID NO. 3)。2、人工合成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的目的基因從OTBC數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了目的基因人溶菌酶的氨基酸序列，使用DNA分析軟件馬克 載體(MacVector)將融合蛋白基因轉(zhuǎn)換成水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，其優(yōu)化后的目 的基因的遺傳密碼改變了 60%，但其氨基酸序列完全相同。此目的基因由美國(guó)的Blue HeronBiotechnology公司人工合成。在基因合成過程中加上了 Myll和Xhol酶切位點(diǎn)，克 隆到PUC18質(zhì)粒載體，產(chǎn)生了水稻密碼子優(yōu)化的溶菌酶基因(其核苷酸序列序列和氨基酸 序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQID NO. 2)，總共有390個(gè)核苷酸編碼130個(gè)氨基酸。3、構(gòu)建水稻特異性表達(dá)目的基因的農(nóng)桿菌載體首先，密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因通過PCR的方法擴(kuò)增，克隆到經(jīng)限制性內(nèi)切酶 MscI和Xhol消化的p0sPMP2質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌JH2600，產(chǎn)生一個(gè)中間質(zhì)粒p0sPMP105， 見圖1。以下表1顯示了目的基因表達(dá)載體序列以及組件的來源表1. p0sPMP105序列以及組件的來源
序列位置序列來源功能備注1-347農(nóng)桿菌T-DNA RBS348-1497水稻Gtl3a啟動(dòng)子1498-1570水稻信號(hào)肽
8
權(quán)利要求
一種以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，將水稻的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將人溶菌酶基因?qū)胨局校够蛑亟M后的水稻表達(dá)重組人溶菌酶蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，所采 用的水稻品種為粳稻品種臺(tái)北309。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，所采 用的載體為農(nóng)桿菌，優(yōu)選JH2600。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，所述 的農(nóng)桿菌載體包含兩種，分別為包含目的基因的農(nóng)桿菌和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，目的 基因是經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，標(biāo)記 基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，含有 目的基因的農(nóng)桿菌載體為p0sPMP105。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征為，含有 標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌載體為p0sPMP5。
9.用根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的重組人溶菌酶蛋白在生命科學(xué)研究、醫(yī)藥新產(chǎn) 品、生物制藥、飼料添加劑以及食品防腐劑領(lǐng)域的應(yīng)用。
10.一種包含目的基因的農(nóng)桿菌載體，其特征為，目的基因是經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的人溶 菌酶基因，該基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，所述農(nóng)桿菌載體優(yōu)選為p0sPMP105。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以水稻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人溶菌酶的方法。將水稻密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，采用雙農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入粳稻品種臺(tái)粳309的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，得到可以大量生產(chǎn)重組人溶菌酶蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻，實(shí)現(xiàn)了重組人溶菌酶融合基因在水稻中的高效表達(dá)。本發(fā)明的特點(diǎn)是重組人溶菌酶具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低，規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高和無病原菌污染；用這種方法生產(chǎn)的人溶菌酶融合蛋白，可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，醫(yī)藥新產(chǎn)品，生物制藥領(lǐng)域，飼料添加劑以及食品防腐劑等。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101979591SQ201010517358
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者楊代常, 竺濤 申請(qǐng)人:洋浦華氏禾元生物科技有限公司