一種利用cho細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的真核表達(dá)載體及系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的基因表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體包括GS表達(dá)單元，所述GS表達(dá)單元包括5’至3’方向依次排列的TK啟動(dòng)子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40polyA基因序列；本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)包括真核表達(dá)載體及CHO細(xì)胞，該表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在CHO細(xì)胞基因組中的整合和高效表達(dá)，在蛋白制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的真核表達(dá)載體及系統(tǒng)【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的基因表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)載體?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]基因工程領(lǐng)域所用基因表達(dá)系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化修飾，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)也日漸成熟和完善。因此，通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)制備治療性重組蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)成為當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域的主流技術(shù)。目前已經(jīng)上市和正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的蛋白質(zhì)藥物中，主要來(lái)自于哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 而這其中中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)是最常用基因工程宿主細(xì)胞。[0003]為了獲得高效的外源基因表達(dá)，基因工程CHO細(xì)胞中常使用二氫葉酸還原酶 (Dihydrofolatereductase, DHFR)和谷氨酸胺合成酶(Glutaminesynthetase, GS)進(jìn)行基因擴(kuò)增和篩選。谷氨酰胺合成酶表達(dá)系統(tǒng)(GS表達(dá)系統(tǒng))往往只需一輪加壓篩選，所需篩選時(shí)間短；另外由于攜帶有GS基因的細(xì)胞株在放大培養(yǎng)過(guò)程中不需要添加谷氨酰胺，因此， 受代謝副產(chǎn)物NH3毒的影響較小，有利于工藝優(yōu)化及放大培養(yǎng)。[0004]利用GS、DHFR基因擴(kuò)增和篩選系統(tǒng)的表達(dá)載體多由美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)發(fā)，其專(zhuān)利保護(hù)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓壁壘極大地限制了我國(guó)生物制藥技術(shù)及工業(yè)的發(fā)展，因此現(xiàn)在急需一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的表達(dá)系統(tǒng)，以促進(jìn)相關(guān)蛋白藥物的開(kāi)發(fā)和我國(guó)生物制藥工業(yè)的進(jìn)步。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種自主開(kāi)發(fā)、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效表達(dá)載體pHLXlOl，以及一種CHO細(xì)胞基因整合表達(dá)系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)目的基因的篩選和高效表達(dá)。[0006]本發(fā)明第一方面公開(kāi)了一種pHLXlOl真核表達(dá)載體,包括GS表達(dá)單兀,所述GS表達(dá)單元的序列包括5’至3’方向依次排列的TK啟動(dòng)子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)以及SV40polyA基因序列。[0007]所述TK啟動(dòng)子基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如 SEQ ID NO:2所示；所述SV40poly A基因序列如SEQ ID NO:3所示。[0008]較優(yōu)的,所述GS表達(dá) 單元基因序列如SEQ ID N0:4所示。[0009]較優(yōu)的，所述GS表達(dá)單元的序列還可以包括酶切位點(diǎn)序列。所述GS表達(dá)單元的序列包括5’至3’方向依次排列的酶切位點(diǎn)序列、TK啟動(dòng)子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)、SV40 polyA基因序列以及酶切位點(diǎn)序列。[0010]更優(yōu)的，所述酶切位 點(diǎn)序列選自HindIII酶、NotI酶、SmaI酶或SalI酶中的一種或多種。[0011]最優(yōu)的，所述含有酶切位點(diǎn)的GS表達(dá)單元序列可以如SEQ ID NO:7所示。[0012]較優(yōu)的，所述pHLXlOl真核表達(dá)載體是由pUC19質(zhì)粒改造獲得。[0013]更優(yōu)的，所述pHLXlOl真核表達(dá)載體是在pUC19質(zhì)粒的SmaI酶切位點(diǎn)和HindIII 酶切位點(diǎn)之間，插入所述GS表達(dá)單元構(gòu)成的。[0014]本發(fā)明pHLXlOl真核表達(dá)載體的制備方法為:通過(guò)PCR的方法在GS表達(dá)單元的兩端添加酶切位點(diǎn)序列，采用酶切、連接的方法將GS表達(dá)單元插入表達(dá)載體，篩選、鑒定連接正確的連接產(chǎn)物為本發(fā)明的pHLXlOl真核表達(dá)載體。[0015]具體方法為:[0016]I)插入序列的制備:利用引物 GS-TK5 (SEQ ID N0:5)和 GS-PA3 (SEQ ID NO:6)， 通過(guò)PCR的方法獲得含有GS表達(dá)單元的插入序列(SEQ ID NO:7)；[0017]2)酶切:將pUC19質(zhì)粒用SmaI和HindIII酶雙酶切，將含有GS表達(dá)單元的插入序列用HindIII酶酶切，分別獲得質(zhì)粒片段和GS表達(dá)單元片段；[0018]3)連接:連接酶連接質(zhì)粒片段和GS表達(dá)單元片段，獲得連接產(chǎn)物；[0019]4)鑒定:連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，鑒定序列正確的連接產(chǎn)物為本發(fā)明的PHLX101真核表達(dá)載體。[0020]較優(yōu)的，所述pHLXlOl真核表達(dá)載體適用于CHO細(xì)胞。[0021]更優(yōu)的，所述pHLXlOl真核表達(dá)載體適用于CH0-K1細(xì)胞。[0022]本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種PHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)，包括本發(fā)明所述的 PHLX101真核表達(dá)載體以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。[0023]較優(yōu)的，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞為CH0-K1細(xì)胞。[0024]本發(fā)明第三方面公開(kāi)了利用前述pHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白的方法，步驟如下:[0025]I)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:將表達(dá)重組蛋白的外源基因表達(dá)單元插入pHLXlOl真核表達(dá)載體中，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒；[0026]2 )表達(dá)系統(tǒng)的篩選:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株作為 pHLXlO 1-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)；[0027]3)采用上一步篩選的PHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。[0028]較優(yōu)的，步驟I)中所述外源基因表達(dá)單元的序列包括5’至3’方向依次排列的啟動(dòng)子序列、外源基因序列以及終止信號(hào)和PoIyA加尾信號(hào)序列。[0029]更優(yōu)的，步驟I)所述外源基因表達(dá)單元的序列還包括兩端的酶切位點(diǎn)序列。[0030]更優(yōu)的，步驟I)所述外源基因表達(dá)單元插入到pHLXlOl真核表達(dá)載體的限制性酶切位點(diǎn)之間。[0031]最優(yōu)的，步驟I)所述 外源基因表達(dá)單元插入到pHLXlOl真核表達(dá)載體的EcoRV酶和Not I酶的限制性酶切位點(diǎn)之間，或者插入到SmaI酶和XmaI酶的限制性酶切位點(diǎn)之間。[0032]較優(yōu)的，步驟I)具體為:將外源基因表達(dá)單元通過(guò)酶切、連接的方法插入pHLXlOl 真核表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒[0033]所述篩選為采用添加有Amp的LB培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞， 挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物電泳分析或者測(cè)序分析。[0034]較優(yōu)的，步驟2)具體為:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞后，通過(guò)MSX進(jìn)行加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。[0035]較優(yōu)的，所述MSX加壓篩選的終濃度為10~100 μ mol。[0036]最后，本發(fā)明還公開(kāi)了 pHLXlOl真核表達(dá)載體、pHLX101_CH0真核表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。[0037]本發(fā)明公開(kāi)了一種在CHO細(xì)胞中利用pHLXlOl真核表達(dá)載體生產(chǎn)重組蛋白的基因表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在CHO細(xì)胞基因組中的整合和高效表達(dá)。該系統(tǒng)的制備方法主要包括:構(gòu)建真核表達(dá)載體，適合于目的基因在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá),并適合于目的基因高表達(dá)細(xì)胞株篩選。利用本發(fā)明的CHO表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白、單克隆抗體等在CHO細(xì)胞中的整合和表達(dá)，具有廣闊的應(yīng)用前景?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0038]圖1:PCR法從pBSK-TK-GS-SV質(zhì)粒擴(kuò)增含GS表達(dá)單元基因片段的電泳結(jié)果(M: DNA marker LI:PCR 擴(kuò)增片段)[0039]圖2:GS表達(dá)單元及pUC19質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果(M、L5:DNA marker L1-L4: SmaI和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切pUC19質(zhì)粒后的片段L6-L7 =Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切 PCR產(chǎn)物后的片段)[0040]圖3:菌落PCR結(jié)果電泳圖譜(M:DNA marker L1-L24:不同克隆的PCR產(chǎn)物)[0041]圖4:pHLX101真核表達(dá)載體的酶切鑒定電泳圖譜(M:DNA marker L1、L2:限制性?xún)?nèi)切酶Sal I和限制性?xún)?nèi)切酶EcoRV.酶切pHLXlOl質(zhì)粒后的片段)[0042]圖5:pHLX101真核表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜[0043]圖6:2009-HLX01-HC 和 2009-HLX01-LC 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果[0044]圖7:pHLX101-HLX01-LC 的酶切鑒定結(jié)果及 pHLX101-HLX01-HC 的菌落 PCR 結(jié)果[0045]圖 8:pHLX101-HLX01-HC HindIII 酶切鑒定[0046]圖9:pHLX101-HLX01-LC 重組質(zhì)粒圖譜[0047]圖10:pHLX101-HLX01-HC 重組質(zhì)粒圖譜[0048]圖11:谷氨酰胺合成酶活性比較[0049]圖12:pHLX101-eGFP重組質(zhì)粒圖譜[0050]圖13:加壓篩選后的細(xì)胞株熒光顯微鏡檢圖【具體實(shí)施方式】[0051]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指`出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。[0052]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。[0053]除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)SambiOOk 等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987 and periodic updates ； the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol.304, Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), Academic Press, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119， Chromatin Protocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。[0054]下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案。[0055]實(shí)施例1 pHLXlOl真核表達(dá)載體的構(gòu)建[0056]1.標(biāo)記基因表達(dá)單元的合成[0057]從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了鼠源的谷氨酰胺合成酶基因序列(GS，Genebank登錄號(hào): NM 008131.3，ABC015086.1，X16314.1)、TK 啟動(dòng)子基因序列(TK promoter，Genebank 登錄號(hào) JN420340.1，AF104248.2，AF362551.1)以及 SV40polyA 基因序列(Genebank 登錄號(hào): JQ302818.1,HQ388295.LEF437954.1 )，基于這些序列，設(shè)計(jì)了利于GS基因在CHO細(xì)胞中整合及表達(dá)的GS表達(dá)單元(SEQ ID NO:4)，將設(shè)計(jì)的表達(dá)單元送交基因合成公司合成了該序列，合成的表達(dá)單元插入在PBSK載體中，獲得TK-GS-SV-pBSK載體。[0058]13.真核表達(dá)載體pHLXlOl的構(gòu)建[0059]2.1含有GS表達(dá)單元的基因片段的制備[0060]利用表1所示GS-TK5和GSPA3引物從TK-GS-SV-pBSK載體中通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增出含有GS表達(dá)單元的基因片段，并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。[0061]表1 PCR引物序列[0062]引物名稱(chēng)I 5' 序列引入內(nèi)切酶位點(diǎn)GS-TK5 Gggagtcgactataca gacatgataagatac (SEQ ID NO:5)Sma1-SalIGS-PA3 gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatattt (SEQ ID NO:6) HindII1-NotI[0063]PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 950C 3min ;變性 94°C 30s,退火 53°C 30s,延伸 72°C 2min, 31 循環(huán)；延伸:72°C IOmin0[0064]PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見(jiàn)圖1，含有GS表達(dá)單元的PCR產(chǎn)物的基因序列如下:[0065]gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatatttgcatgtctttagttctatgatgacac aaaccccgcccagcgtcttgtcattggcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcgcggtccgaggtccact tcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcggacttccaccatggccacctcagcaagt tcccacttgaacaaaggcatcaagcaaatgtacatgtccctgccccagggtgagaaagtccaagccatgtatatctg
【權(quán)利要求】
1.一種PHLX101真核表達(dá)載體，包括GS表達(dá)單元，所述GS表達(dá)單元的序列包括5’至 3’方向依次排列的TK啟動(dòng)子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40 poly A基因序列。
2.如權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述GS表達(dá)單元的基因序列如SEQ ID NO:4 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述pHLXlOl真核表達(dá)載體是由 PUC19質(zhì)粒改造獲得。
4.如權(quán)利要求3所述的真核表達(dá)載體,其特征在于,所述pHLXlOl真核表達(dá)載體是在 PUC19質(zhì)粒的SmaI酶切位點(diǎn)和Hind III酶切位點(diǎn)之間，插入所述GS表達(dá)單元構(gòu)建獲得。
5.一種pHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)，包括權(quán)利要求1_4任一權(quán)利要求所述的pHLXlOl 真核表達(dá)載體以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的真核表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞為CHO-Kl 細(xì)胞。
7.利用權(quán)利要求5或6任一權(quán)利要求所述pHLXlO1-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白的方法，步驟如下:O重組質(zhì)粒的構(gòu)建:將表達(dá)重組蛋白的外源基因表達(dá)單元插入pHLXlOl真核表達(dá)載體，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒；2)表達(dá)系統(tǒng)的篩選:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株作為pHLXlO1-CH0 真核表達(dá)系統(tǒng)；3)采用上一步篩選的pHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟I)具體為:將表達(dá)重組蛋白的外源基因表達(dá)單元通過(guò)酶切、連接的方法插入pHLXlOl真核表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞， 篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟I)所述外源基因表達(dá)單元的序列包括 5’至3’方向依次排列的啟動(dòng)子序列、外源基因序列以及終止信號(hào)和polyA加尾信號(hào)序列。
10.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)具體為:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞后，通過(guò)MSX進(jìn)行加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述MSX加壓篩選的終濃度為10~ 100 μ molο
12.權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述pHLXlOl真核表達(dá)載體和/或權(quán)利要求5_6任一權(quán)利要求所述PHLX101-CH0真核表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103509823SQ201210211812
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月25日
【發(fā)明者】姜偉東, 郎國(guó)竣, 王彥玲, 陳瑩, 劉世高, 郭新軍, 馬辰, 張二輝 申請(qǐng)人:上海復(fù)宏漢霖生物技術(shù)有限公司