專利名稱：一種葡萄糖淀粉酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡萄糖淀粉酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄糖淀粉酶(1，4_α-D-glucan glucohydrolases, EC 3. 2. 1. 3)，又稱淀粉葡萄 糖苷酶(glucoamylase)或Y -淀粉酶(Y-amylase)，簡稱糖化酶。葡萄糖淀粉酶可以從寡 糖或多糖碳鏈的非還原端逐個水解α-1，4_糖苷鍵，生成β-D-葡萄糖。葡萄糖淀粉酶處 于淀粉降解的最后一步，在食品加工、生物乙醇生產(chǎn)和制酒業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值。工業(yè)上從淀粉制備葡萄糖分為液化和糖化兩個連續(xù)的步驟，其中用到兩種主要的 酶細菌來源的嗜熱α淀粉酶和黑曲霉(Aspergillus niger)來源的葡萄糖淀粉酶(AMG)。 在第一步液化的過程中，淀粉在PH6和100°C左右的條件下被嗜熱α淀粉酶液化成麥芽糊 精；隨后的糖化步驟中，麥芽糊精被真菌來源的葡萄糖淀粉酶在ΡΗ4. 5和60°C下的條件下 進一步糖化生成葡萄糖。雖然黑曲霉來源的葡萄糖淀粉酶(AMG)的酶活力較高，但是其最 適反應(yīng)溫度遠遠低于細菌來源的嗜熱α淀粉酶，因而導(dǎo)致在實際生產(chǎn)中降溫步驟的成本 較高；另外黑曲霉來源的葡萄糖淀粉酶(AMG)的熱穩(wěn)定性不夠好，高溫下很快失活，使AMG 的催化效率降低，這些都導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的增加。因此，迫切需要尋找一種在酸性PH和 80-90°C的高溫條件下具有高活力的葡萄糖淀粉酶。近年來，來源于嗜熱微生物的酶引起了人們極大的興趣。這些酶能在高溫條件下 發(fā)揮最大的活力，比中溫酶更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要。因此，向嗜熱微生物索取耐高溫酶資 源，已成為工業(yè)生產(chǎn)中解決高溫催化的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖淀粉酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的葡萄糖淀粉酶，來源于騰沖嗜熱厭氧菌(菌種保藏號AS 1. 2430τ =JCM 11007τ)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有葡萄糖淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。為了便于葡萄糖淀粉酶的純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有葡萄糖淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-4)中任一 所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-2046位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白 的DNA分子；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pET載體的多克 隆位點間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組載體；所述pET載體優(yōu)選為載體pET42b 或載體pET28a。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求5所述 的重組載體導(dǎo)入到大腸桿菌 BL21 (DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21_Gold (DE3) pLysS 或 BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL 中得到的重組菌。
7.擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任一片段的引物對。
8.一種制備葡萄糖淀粉酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的重組菌，得到葡萄糖 淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄糖淀粉酶及其編碼基因。該蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有葡萄糖淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，從騰沖嗜熱厭氧菌(菌種保藏號AS 1.2430T＝JCM 11007T)中擴增得到葡萄糖淀粉酶編碼基因，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的葡萄糖淀粉酶具有較高的最適反應(yīng)溫度，比黑曲霉來源的葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)溫度高10℃，且熱穩(wěn)定性好，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/34GK101993863SQ200910091269
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者薛燕芬, 鄭迎迎, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所