專利名稱：一種人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及一種人工合 成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是我們國(guó)家近年來(lái)扶持力度增大 的生物制品的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)主要應(yīng)用于復(fù)雜，分子量巨大的蛋白表達(dá) 及基因治療藥物或疫苗的病毒生產(chǎn)和生物農(nóng)業(yè)等一系列產(chǎn)品生產(chǎn)。由于細(xì) 菌等巨核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄及修飾方面有缺陷，許多重要價(jià)值的蛋白質(zhì)， 特別是基因工程藥物，疫苗，抗體等糖基化的需要，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 系統(tǒng)有了一個(gè)更合適的工具。因此，哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)引起了大家 的重視，以哺乳類動(dòng)物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的生物制藥產(chǎn)業(yè)和生物農(nóng)業(yè) 產(chǎn)業(yè)在西方發(fā)達(dá)國(guó)家得到了迅速發(fā)展。
隨著功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究深入，后基因組 時(shí)代來(lái)臨后，各個(gè)研究機(jī)構(gòu)、生物制藥公司將要對(duì)成千上萬(wàn)的蛋白進(jìn)行功 能研究、篩選及生產(chǎn)，但這么多蛋白不可能在短時(shí)間內(nèi)由一個(gè)單位來(lái)完成， 所以生物制品(蛋白質(zhì)產(chǎn)品)市場(chǎng)將是非常巨大。而這一巨大市場(chǎng)的關(guān)鍵 和核心技術(shù)是細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器)，該技術(shù)涉及 諸多學(xué)科(細(xì)胞生物學(xué)、生化學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)酵技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng) 學(xué)、植物細(xì)胞學(xué)、機(jī)電學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、傳感技術(shù)等)，以細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 的形式表現(xiàn)出各種高新技術(shù)含量為機(jī)電一體化產(chǎn)品。
細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，摹擬體內(nèi)環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫 度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其在體外生長(zhǎng)繁殖、并維持其結(jié)構(gòu)、功 能、及生理特性的一種培養(yǎng)技術(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是否 能貼附于支持物上生長(zhǎng)的特征，可分為貼附型生長(zhǎng)和懸浮型生長(zhǎng)兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支技物表面生長(zhǎng)，懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮 生長(zhǎng)。要使得細(xì)胞反應(yīng)器能產(chǎn)出高效并具有自然細(xì)胞活性的產(chǎn)品，關(guān)鍵技 術(shù)要仿真培養(yǎng)細(xì)胞在體生活環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求比較嚴(yán)格，細(xì)胞的 生長(zhǎng)、繁殖、代謝等生理性質(zhì)在很大程度上受各種環(huán)境的影響。為了使細(xì) 胞處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇優(yōu)良環(huán)境是非常重要，除了氣體交換、培養(yǎng)
溫度、pH、滲透壓及其它等因素外，對(duì)于貼附型細(xì)胞來(lái)說(shuō)，特別重要的是
細(xì)胞生長(zhǎng)的支架物，這種細(xì)胞在體外環(huán)境下需在人工支持物上生長(zhǎng)(附著 于半固體或固體表面生長(zhǎng))。早期的實(shí)驗(yàn)中，用玻璃瓶來(lái)做支持物(實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)至今還在用)，后來(lái)用塑料制品、微載體、微囊、及膜載體等進(jìn)行大規(guī) 模細(xì)胞培養(yǎng)，其原理是模擬細(xì)胞在體的三維空間生活環(huán)境。
微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技 術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用 的材料支撐的顆粒(微載體)，使細(xì)胞在微載體表面附著和生長(zhǎng)，并通過(guò)不 斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。但其缺點(diǎn)是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷 細(xì)胞，接種密度高，微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。中空纖維 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用一種人工的"毛細(xì) 管"即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系 統(tǒng)。其缺點(diǎn)是中空纖維的污染和堵塞，觀察困難，細(xì)胞生長(zhǎng)或過(guò)量氣體產(chǎn)
生會(huì) 破壞纖維。微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點(diǎn)是在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、 生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放 入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。其缺點(diǎn)是①微囊制作復(fù)雜，成功率不高；②微 囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會(huì)污染正常產(chǎn)物；③收集產(chǎn)物必須破壁，不能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連 續(xù)化。目前采用微載體、微囊、中空纖維等支持物的培養(yǎng)方式，不能做到 真正的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，因此，培養(yǎng)細(xì)胞的制品產(chǎn)量和活性功能都 受一定影響；而且微載體等支持物每次都需要更換新的，成本高，且不容 易洗脫和分離，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，所以探索一些合成物來(lái)解決以上問(wèn)題是細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)所迫切需要的。
綜上所述，本發(fā)明的目的是提供一種人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 中作為支架物的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供一種人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng) 用，包括在大規(guī)模培養(yǎng)、中試規(guī)模的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)室研究中作為有貼壁 習(xí)性細(xì)胞生長(zhǎng)支架物，該支架物可改變傳統(tǒng)的二維生長(zhǎng)空間為三維生長(zhǎng)空 間，更接近在體活細(xì)胞的生活環(huán)境。
根據(jù)本發(fā)明所述的人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng) 用，優(yōu)選地是，所述的多肽是一種合成的人體氨基酸多肽，是由人體必需 氨基酸和非必需氨基酸組成的。多肽氨基酸是能被培養(yǎng)細(xì)胞吸收的特殊培 養(yǎng)劑，可作為細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣可供機(jī)體吸收。具體的說(shuō)， 所述的多肽是丙氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨 酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及組氦酸中的一 種或幾種。
根據(jù)本發(fā)明所述的人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng) 用，其中優(yōu)選地是，所述的多肽具有多層次螺旋狀結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)自組裝主 要依靠氫鍵靜電相互作用，靜電相互作用，疏水相互作用等次級(jí)鍵的作用， 形成各種不同的蛋白納米纖維結(jié)構(gòu)，具有多層次螺旋狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度和大小 由特定細(xì)胞的生長(zhǎng)特性決定。微蛋白質(zhì)片段的空間造型可以有多種類型， 螺旋狀結(jié)構(gòu)更適合有貼壁習(xí)性的細(xì)胞生長(zhǎng)，更能體現(xiàn)活細(xì)胞三維空間如同 在體細(xì)胞的生長(zhǎng)生活環(huán)境。本發(fā)明的多肽是微小蛋白片段，是現(xiàn)有細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)支架物微載體的1/1000，在體積上更接近細(xì)胞自我復(fù)制的細(xì)胞外基 質(zhì)，可直接或植入體內(nèi)而沒(méi)有副作用。在制備生物制品過(guò)程中，不需要將 該多肽濾去或分解。
根據(jù)本發(fā)明所述的人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng) 用，優(yōu)選地是，所述的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明所述的人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng) 用，更優(yōu)選地是，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自人或其他哺乳動(dòng)物的各類干細(xì) 胞、祖細(xì)胞、293HEK動(dòng)物細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤人細(xì)胞等；所述的植物細(xì)胞選自有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物細(xì)胞等。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果
現(xiàn)在有貼壁習(xí)性的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中都釆用微載體、微囊或 中空纖維作培養(yǎng)細(xì)胞的貼粘支架，以上物質(zhì)在培養(yǎng)過(guò)程中有兩個(gè)關(guān)鍵性要 素對(duì)生產(chǎn)成本產(chǎn)生負(fù)面影響微載體在培養(yǎng)完成后，要丟棄并更新，增加 了生產(chǎn)成本；在生產(chǎn)過(guò)程先要洗脫微載體，使細(xì)胞與微載體分離，再純化， 生產(chǎn)過(guò)程更復(fù)雜，成本更高。其它如微囊和中空纖維，也存在類同的問(wèn)題。 采用本發(fā)明的技術(shù)，生產(chǎn)過(guò)程更簡(jiǎn)單，不需要洗脫、分離和純化，生產(chǎn)使 用的設(shè)備更簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本更低。
采用本發(fā)明技術(shù)可以解決現(xiàn)有大規(guī)模培養(yǎng)中許多技術(shù)難題1.動(dòng)物 293HEK (解除從貼壁馴化到懸浮過(guò)程中)；2.細(xì)胞結(jié)團(tuán)問(wèn)題；3.延長(zhǎng)細(xì) 胞的生長(zhǎng)時(shí)間，增加生長(zhǎng)的密度，細(xì)胞產(chǎn)量大量增加，制品的表達(dá)量大量 增加，產(chǎn)品的活性增強(qiáng)，可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。


圖1 (1)是Alanine (丙氨酸)；
圖1 (2)是Arginine (精氨酸)；
圖1 (3)是Asparagine (天門冬酰胺);
圖1 (4)是Aspartic acid (天門冬氨酸)；
圖1 (5)是Cysteine (半胱氨酸)；
圖1 (6 )是Glutamine (谷氨酰胺)；
圖1 (7)是Glutamic acid (谷氨酸)；
圖1 (8)是Glycine (甘氨酸)；
圖1 (9)是Isoleucine (異亮氨酸)；
圖1 (10)是Leucine (亮氨酸)；
圖1 (11)是Lysine (賴氨酸)；
圖1 (12)是Methionine (蛋氨酸)；
圖1 (13)是Phenylalanine (苯丙氨酸)；
圖1 (14)是Proline (脯氨酸)；圖1 (15)是Serine (絲氨酸)；
圖1 (16)是Threonine (蘇氨酸)；
圖1 (17)是Tryptophan (色氨酸)；
圖1 (18)是Tyrosine (酪氨酸)；
圖1 (19)是Valine (纈氨酸)；
圖1 (20)是Histidine (組氨酸)。
圖2 (a)和圖2 (b)是本發(fā)明實(shí)施例中的干細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)圖片。
圖3 (a)和圖3 (b)是本發(fā)明實(shí)施例中的干細(xì)胞染色狀態(tài)的圖片。
具體實(shí)施例方式
下面參照實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，下面的實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，而非限定本發(fā)明的內(nèi)容，任何形式上的變動(dòng)和/ 或變通，將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1
自組裝氨基酸多肽按培養(yǎng)器具的面積大小的比例(20: 1)，加在培養(yǎng) 液中，做為細(xì)胞培養(yǎng)的支架物用于細(xì)胞規(guī)模。HEK-293細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中有 大部分細(xì)胞貼在支架物上，也有部分貼在培養(yǎng)瓶玻璃壁(如轉(zhuǎn)瓶)上，觀 察細(xì)胞生長(zhǎng)在倒置顯微鏡下，同普通的貼壁細(xì)胞相同，等細(xì)胞長(zhǎng)到需求的 量，再做轉(zhuǎn)染，然后收集細(xì)胞。干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和染色狀態(tài)見圖2 (a)、 圖2 (b)和圖3 (a)、圖3 (b)。可見，采用本方法所培養(yǎng)的細(xì)胞與本領(lǐng) 域常用方法所培養(yǎng)的細(xì)胞其形態(tài)基本相同。
權(quán)利要求
1、一種人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的多肽是一種合成的 人體氨基酸多肽。
3、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的多肽是丙氨酸、精 氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及組氨酸中的一種或幾種。
4、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的多肽具有多層次螺 旋狀結(jié)構(gòu)，且所述的多肽是微小蛋白片段，是現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)支架物微 載體的1/1000。
5、 如權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的細(xì)胞包 括動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
6、 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的動(dòng)物細(xì)胞選自人或 其它哺乳動(dòng)物的各類干細(xì)胞、祖細(xì)胞、293HEK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤 人細(xì)胞；所述的植物細(xì)胞選自有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人工合成多肽在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中作為支架物的應(yīng)用，所述的多肽是人工合成的氨基酸多肽，具有多層次螺旋狀結(jié)構(gòu)。采用本發(fā)明的技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，生產(chǎn)過(guò)程更簡(jiǎn)單，支架物不需要洗脫、分離和純化，生產(chǎn)使用的設(shè)備更簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本更低。
文檔編號(hào)C12N5/12GK101434933SQ200810177468
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司