細(xì)胞穿透肽、包含該肽的綴合物、及包含該綴合物的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及源自人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase ;hTERT)的細(xì)胞穿透肽、細(xì)胞穿透肽及活性成分的綴合物、以及包含該綴合 物的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 盡管低分子量物質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、納米粒子等在分子水平上具有作為治療物質(zhì)的 極大可能性潛力，但低分子量物質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、粒子等的使用其應(yīng)用由于不能無(wú)能力穿 透組織及細(xì)胞膜而受限。輸送此類物質(zhì)至細(xì)胞內(nèi)的的系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)展已成為過(guò)去二十年來(lái)活 躍的研宄領(lǐng)域。細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)輸物質(zhì)已成為分子處理治療方法中的的話題。低分子量物質(zhì)、 核酸或納米粒子通過(guò)系通過(guò)多種若干試劑、電穿孔或熱休克而運(yùn)送到運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。然而， 難以找到一種適當(dāng)方法在不破壞蛋白質(zhì)的活性及完整性的情況下將蛋白質(zhì)輸送到在細(xì)胞 內(nèi)部輸送蛋白質(zhì)。在20世紀(jì)80年代，在對(duì)人類人免疫缺乏病毒（human immunodeficiency virus ;HIV)的細(xì)胞穿透能力進(jìn)行的研宄中，已發(fā)現(xiàn)，由特定的11種個(gè)氨基酸構(gòu)組成的的 HIV-TAT蛋白質(zhì)在于在向細(xì)胞內(nèi)部的運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中起重要作用。因此，在20世紀(jì)90年代， 探索運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)將蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的恰當(dāng)方法的研宄成為重點(diǎn)研宄領(lǐng)域。
[0003] 已知端粒是染色體末端發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)重復(fù)序列，端粒防止染色體損傷或防止合 并至其它染色體上。端粒的長(zhǎng)度在每次細(xì)胞分裂時(shí)縮短，且在一定次數(shù)的細(xì)胞分裂的后，端 粒長(zhǎng)度極度縮短至細(xì)胞停止分裂且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸可延長(zhǎng)細(xì)胞的 壽命。作為實(shí)例，癌細(xì)胞分泌稱為端粒酶的酶，該酶防止端?？s短，因此導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖。
[0004] 本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種新型肽。
[0005] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供編碼該新型肽的多核苷酸。
[0006] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供細(xì)胞穿透肽。
[0007] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供作為細(xì)胞內(nèi)活性成分的載體的有用的肽。
[0008] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供作為細(xì)胞內(nèi)活性成分的載體的有用的肽，尤其是將活 性成分局部地輸送至粒線體的有用的肽。
[0009] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供用于輸送活性成分至粒線體以改善、預(yù)防或治療粒線 體相關(guān)疾病或病癥的有用的肽。
[0010] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供活性成分與細(xì)胞穿透肽綴合成的綴合物。
[0011] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供包含活性成分與細(xì)胞穿透肽的綴合物的組合物。
[0012] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供包含活性成分與細(xì)胞穿透肽的綴合物的藥物組合物。
[0013] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供包含活性成分與細(xì)胞穿透肽的綴合物的功能性化妝 組合物。
[0014] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供包含活性成分與細(xì)胞穿透肽的綴合物的健康食品組 合物。
[0015] 本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供包含活性成分與細(xì)胞穿透肽的綴合物的對(duì)比造影劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的綴合物可為細(xì)胞穿透載體肽與活性成分的綴合物， 其中所述載體肽為包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO: 178中至少一個(gè)氨基酸序列的肽、與上 述序列具有至少80%同源性的肽、或上述肽的片段，且其中具有至少80%同源性的所述肽 和所述片段保留SEQ ID NO:2至SEQ ID NO: 178中的任一氨基酸序列的細(xì)胞穿透能力。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明中的綴合物的另一實(shí)施方式，所述片段可由3個(gè)或更多氨基酸構(gòu)成。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明中的綴合物的另一實(shí)施方式，所述載體肽可由30個(gè)或更少氨基酸構(gòu) 成。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明中的綴合物的另一實(shí)施方式，所述載體肽可為由SEQ ID N0:2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列構(gòu)成的肽或與上述序列具有至少80%同源性的肽。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的對(duì)比造影劑可包含上述的任一種綴合物。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的對(duì)比造影劑可用于細(xì)胞對(duì)比造影。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的對(duì)比造影劑的另一實(shí)施方式，所述細(xì)胞可為干細(xì)胞。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的組合物可包含上述的任一種綴合物。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的組合物的另一實(shí)施方式，所述活性成分可用于治療或預(yù)防疾病，且 所述組合物可為藥物組合物。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的組合物的另一實(shí)施方式，所述活性成分可為用于功能性化妝品的活 性成分，且所述組合物可為化妝品組合物。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的組合物的另一實(shí)施方式，所述活性成分可為用于功能健康食品的活 性成分，且所述組合物可為健康食品組合物。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式為用于輸送活性成分至細(xì)胞內(nèi)的方法，其中該方 法包括對(duì)有需要的對(duì)象施用權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的綴合物，且其中載體肽為將活 性成分輸送至細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞穿透肽，且其中具有至少80%同源性的所述肽及上述肽的片段 保留由SEQ ID N0:2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列構(gòu)成的肽的細(xì)胞穿透能力。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的方法的另一實(shí)施方式，所述方法可用于將所述活性成分局部地輸送 至細(xì)胞內(nèi)部的粒線體內(nèi)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明細(xì)胞穿透肽的另一實(shí)施方式，上述載體肽可以為具有SEQ ID NO:2至 SEQ ID NO: 178中任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的肽。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可編碼上述細(xì)胞穿透肽。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的載體可包含上述多核苷酸。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可包含上述載體。
[0033] 產(chǎn)業(yè)利用性
[0034] 難以運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的活性成分可通過(guò)使用本發(fā)明所公開(kāi)的肽或肽及活性成分的 綴合物而易于運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。這意味著可增加活性成分的功效且因此可減少活性成分的劑 量。因此，可最小化由于藥物施用造成的副作用且可增加治療的有效性。特別地，當(dāng)將藥物 局部地輸送至粒線體內(nèi)時(shí)，可改善粒線體相關(guān)的疾病或病癥，且可增加疾病預(yù)防及治療疾 病的有效性。在化妝品的情況中，通過(guò)少量活性成分可產(chǎn)生顯著效果。通過(guò)使肽與對(duì)比造 影物質(zhì)綴合，可將該肽用作對(duì)比造影物質(zhì)以監(jiān)測(cè)細(xì)胞移植的過(guò)程或在細(xì)胞治療中的移植細(xì) 胞。特別地，該肽可實(shí)際上用作用于注入身體內(nèi)的干細(xì)胞的對(duì)比造影物質(zhì)。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1描繪通過(guò)FACS分析的在FITC與SEQ ID No: 1的肽P印1融合后治療的HeLa 細(xì)胞中細(xì)胞攝入的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照細(xì)胞僅以FITC處理。
[0036] 圖2至圖29描繪通過(guò)FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的HeLa細(xì)胞中細(xì)胞攝入的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照細(xì)胞僅以FITC處理。
[0037] 圖30至圖51描繪通過(guò)FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的Huh7細(xì)胞中細(xì)胞攝入的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照細(xì)胞僅以FITC處理。
[0038] 圖52至圖69描繪通過(guò)FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的人T淋巴球細(xì)胞系（Jurkat細(xì)胞）中細(xì)胞攝入的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照細(xì)胞僅以 FITC處理。
[0039] 圖70描繪通過(guò)FACS (流式細(xì)胞術(shù)）分析的在FITC與SEQ ID No: 1的肽P印1融 合后治療的HeLa細(xì)胞的毒性及細(xì)胞活性的結(jié)果。對(duì)照細(xì)胞僅以FITC處理。
[0040] 圖71至圖86描繪通過(guò)FACS (流式細(xì)胞術(shù)）分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的肽融合后治療的HeLa細(xì)胞的毒性及細(xì)胞活性的結(jié)果。對(duì)照細(xì)胞僅以FITC處 理。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 盡管蛋白質(zhì)、核酸、肽或病毒等具有作為治療物質(zhì)的極大可能性潛力，但蛋白質(zhì)、 核酸、肽或病毒等的使用由于無(wú)能力不能穿透組織及細(xì)胞膜而受限。即使分子大小很小， 但該等這種分子由于分子的結(jié)構(gòu)或特性而無(wú)法穿透脂質(zhì)雙層。因此，試圖經(jīng)由通過(guò)使用 電穿孔、熱休克等將蛋白質(zhì)、核酸、肽或病毒運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)；難以在既不破壞細(xì)胞膜又保持 上述分子的活性狀態(tài)的情況下轉(zhuǎn)移彼等所述蛋白質(zhì)、核酸、肽或病毒。已進(jìn)行的許多研宄 顯示源自人免疫缺乏病毒（Human Immuno-deficiency Virus ;HIV)的反式轉(zhuǎn)錄活化因子 (Trans-Activating Transcriptional activator ;TAT activator)蛋白質(zhì)可用作細(xì)胞穿 透肽，該細(xì)胞穿透肽可將巨極大的活性物質(zhì)到運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)。具體地，已進(jìn)行了關(guān)于下列物質(zhì) 的研宄，與在細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生毒性的TAT蛋白質(zhì)不同，該等該物質(zhì)可在不產(chǎn)生任何毒性的情 況下運(yùn)輸諸如蛋白質(zhì)、核酸、肽或病毒的極巨大分子到細(xì)胞內(nèi)。因此，本發(fā)明是通過(guò)本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)源自端粒酶的肽具有作為細(xì)胞穿透肽的顯著功效而無(wú)顯著明顯毒性而完成的。
[0042] 肽在下表1至下表5中所示的SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 178公開(kāi)。SEQ ID NO: 179是人端粒酶蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列。SEQ ID NO: 1的肽源自端粒酶，由16個(gè)氨基酸序列 組成。SEQ ID NO:2 至 SEQ ID NO:77 的肽包括 SEQ ID NO: 1 的肽。SEQ ID NO:78 至 SEQ ID NO: 178的肽為SEQ ID NO: 1的肽的片段。下表1中的"名稱"系用于區(qū)別肽。在本發(fā)明 的不同特定實(shí)施方式中，在SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 178中超過(guò)一個(gè)肽包括"合成肽"， 即，端粒酶的選定區(qū)域的合成肽。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"pep"在本文系指具有SEQ ID N0:1 的序列、或SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178中任一氨基序列者的肽、包含與上述序列具有超 過(guò)80%同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段。
[0043] [表 1]
[0044]
[0045] [表 2]






[0053] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，一種多核苷酸編碼以下的肽：包含SEQ ID N0:2至 SEQ ID NO: 178中至少一個(gè)氨基酸序列的肽，與上述序列具有至少80%同源性的肽或作為 上述肽的片段的肽。如上所述的多核苷酸能夠使得所述肽大量地產(chǎn)生。舉例而言，培養(yǎng)包 括編碼肽的多核苷酸的載體使得肽大量產(chǎn)生。
[0054] 本文公開(kāi)的肽可包括包含同源性超過(guò)80 %、超過(guò)85 %、超過(guò)90 %、超過(guò)95 %、超過(guò) 96 %、超過(guò)97 %、超過(guò)98 %、超過(guò)99 %的氨基酸序列的肽。此外，本發(fā)明中所公開(kāi)的肽可包 括：包含SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列的肽或該肽的片段，及