專利名稱：用于分離和處理自身免疫性t細(xì)胞的擬肽配體的制作方法
用于分離和處理自身免疫性T細(xì)胞的擬肽配體本申請要求2009年5月四日提交的美國臨時專利申請編號61/182，368和2009 年11月12日提交的編號61/260，608的優(yōu)先權(quán)，以上每篇文獻以其整體作為參考并入本文。本發(fā)明是在國家心肺和血液研究所的資助號No. N01-HV28185以及國家健康研究所的資助號NO.DP10D00066301的政府支持下進行的。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，它涉及對被自身免疫性T細(xì)胞所識別的擬肽的鑒定。這些擬肽可用于鑒定患有自身免疫病或具有患自身免疫病風(fēng)險的對象，以及可用于靶向這些細(xì)胞以進行去除、抑制或破壞。2.相關(guān)技術(shù)的說明多種自身免疫病的分子基礎(chǔ)仍是未知的。部分地由于此分子水平上認(rèn)識的缺乏， 開發(fā)自身免疫病診斷試劑和有效治療的現(xiàn)有技術(shù)遠(yuǎn)未達到最佳。例如，尚沒有用于診斷大部分自身免疫病的高度可靠的血清蛋白標(biāo)志物。幾乎沒有例外，用于治療這些病況的藥物， 或者是抑制自身免疫反應(yīng)本身的下游事件(如炎癥)，或者是非選擇性地試圖調(diào)節(jié)或抑制整個免疫系統(tǒng)(Hemmer & Hartung，2007)，其具有顯著的不希望的副作用。對于診斷和治療應(yīng)用，理想地，希望具有下述分子直接靶向自身反應(yīng)性B細(xì)胞(和它們所產(chǎn)生的抗體)和 T細(xì)胞，但忽略識別外源抗原的B和T細(xì)胞。這些分子可用作診斷劑和研究工具，用以檢測和富集自身免疫抗體、B細(xì)胞和T細(xì)胞。另外，這些分子可用作新藥物開發(fā)項目的基礎(chǔ)，其目的在于消除這些自身反應(yīng)性細(xì)胞而不影響免疫系統(tǒng)的正常功能。因此，對于這些疾病來說，仍需要(i)準(zhǔn)確并且客觀，(ii)簡單并且可重復(fù)，和 (iii)在早期和晚期事件中均有用的診斷過程。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了使用合成分子的方法，所述合成分子即作為特定生理狀態(tài)之生物標(biāo)志物的與配體結(jié)合部分(如復(fù)雜生物混合物中所存在的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或非粘附細(xì)胞)相結(jié)合的配體。在某些方面，所述配體為擬肽。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了鑒定被自身免疫性T細(xì)胞所特異性識別的配體或擬肽的方法，其包括(a)提供來自健康對象的第一 T細(xì)胞群，其中所述群由第一可檢測標(biāo)記物所標(biāo)記；(b)提供來自患自身免疫病對象的第二 T細(xì)胞群，其中所述群由第二可檢測標(biāo)記物所標(biāo)記；(c)將所述第一和第二 T細(xì)胞群與多個所述候選擬肽相接觸；和(d)評價所述第一和第二 T細(xì)胞群與所述候選擬肽的結(jié)合，其中如果所述擬肽與所述第二 T細(xì)胞群結(jié)合但是不與所述第一 T細(xì)胞群結(jié)合，則自身免疫細(xì)胞識別所述擬肽，而健康T細(xì)胞不識別。所述自身免疫病可以是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所述配體或擬肽可以是3 聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8聚體、9聚體或10聚體。所述第一和第二標(biāo)記物可以是發(fā)熒光的或化學(xué)發(fā)光的，或量子點。所述擬肽可以與支持物結(jié)合，如珠、芯片、濾器、蘸棒(dipstick)、膜、聚合物基質(zhì)或孔。所述接觸步驟可包括使所述支持物與所述第一和第二 T 細(xì)胞群同時接觸。所述T細(xì)胞群可包括CD4+T細(xì)胞。所述對象可以是人或鼠。在另一個實施方案中，提供了從患有自身免疫病的對象中除去自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異性結(jié)合的配體或擬肽，其中所述配體或擬肽與支持物結(jié)合；(b)將來自所述對象的含有T細(xì)胞的樣品與所述結(jié)合支持物的擬肽接觸足夠的時間以允許自身免疫性T細(xì)胞與所述結(jié)合支持物的配體或擬肽結(jié)合；和(c)將所述支持物與所述樣品分離。該方法還可以包含將步驟(c)的樣品返回到所述對象。自身免疫病可以是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。配體或擬肽可以是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8聚體、9聚體或10聚體。 支持物可以是珠、芯片、濾器、蘸棒、膜、聚合物基質(zhì)或孔。所述樣品可以是血液、腦脊液或精液。在樣品為血液時，它可得自所述對象、經(jīng)離體處理并返回到所述對象，以及另外，可在閉合回路中將血液灌注通過所述結(jié)合支持物的配體或擬肽并返回至所述對象。所述方法還可包括從所述對象獲得所述樣品。對象可以是人或鼠。在另一個實施方案中，提供了殺死從患自身免疫病對象中獲得的自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異性結(jié)合的配體或擬肽，其中所述配體或擬肽與毒素綴合；和(b)將來自所述對象的含有T細(xì)胞的樣品與所述綴合物接觸足夠的時間以允許至少一種自身免疫性T細(xì)胞與所述綴合物相結(jié)合，其中所述綴合物導(dǎo)致所述自身免疫性T細(xì)胞死亡?？梢詫悠愤M行離體處理，并且所述方法還可包括將所述樣品返回到所述對象。所述自身免疫病可以是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所述配體或擬肽可以是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8聚體、9聚體或10 聚體。所述毒素可以是蓖麻毒素、白喉毒素或霍亂毒素。作為另外一種選擇，所述毒素可以是光活化毒素，如三聯(lián)吡啶基釕(II)，并且步驟(b)還可包括將所述樣品暴露于可見光。所述樣品可以是血液、腦脊液或精液。所述方法還可包括從所述對象獲得所述樣品。所述對象可以是人或鼠。在另一個實施方案中，提供了殺死從患自身免疫病對象獲得的或其中的自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異地結(jié)合的配體或擬肽，其中所述配體或擬肽與含有IgG Fc的分子相綴合；和(b)將自身免疫性T細(xì)胞群與所述綴合物接觸足夠的時間以允許至少一個自身免疫性T細(xì)胞與所述綴合物結(jié)合，其中所述綴合物將免疫效應(yīng)物募集至所述自身免疫性T細(xì)胞，從而導(dǎo)致其死亡?？梢詫ψ陨砻庖咝訲細(xì)胞群進行離體處理，并且所述方法還可包括將步驟(b)的樣品返回到所述對象。所述自身免疫病可以是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所述配體或擬肽可以是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8聚體、9聚體或10 聚體。含有IgG Fc的分子可以是抗體、單鏈抗體或Fc片段，例如抗體或單鏈抗體，以及所述配體或擬肽與所述抗體的抗原結(jié)合位點或者缺少IgG可變區(qū)的Fc片段相連接，以及所述配體或擬肽與所述Fc片段的羧基端相連接。所述樣品可以是血液、腦脊液或精液。所述方法還可以包括從所述對象獲得所述樣品。所述對象可以是人或鼠。在某些實施方案，本發(fā)明的化合物具有下式，包括其可藥用鹽化學(xué)式II
權(quán)利要求
1.鑒定被自身免疫性T細(xì)胞特異性識別的配體的方法，其包括(a)提供來自健康對象的第一T細(xì)胞群，其中所述群由第一可檢測標(biāo)記物所標(biāo)記；(b)提供來自患自身免疫病對象的第二T細(xì)胞群，其中所述群由第二可檢測標(biāo)記物所標(biāo)記；(c)將所述第一和第二T細(xì)胞群與多個候選配體相接觸；和(d)評價所述第一和第二T細(xì)胞群與所述候選配體的結(jié)合，其中如果所述配體與所述第二 T細(xì)胞群結(jié)合但是不與所述第一 T細(xì)胞群結(jié)合，則自身免疫性T細(xì)胞識別所述配體而健康T細(xì)胞不識別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述配體是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8聚體、9聚體或10聚體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二標(biāo)記物是發(fā)熒光的或化學(xué)發(fā)光的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二標(biāo)記物是量子點。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述配體與支持物結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述支持物是珠、芯片、濾器、蘸棒、膜、聚合物基質(zhì)或孔。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中接觸包括使所述支持物與所述第一和第二T細(xì)胞群同時接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞群包括CD4+T細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述對象是人或鼠。
11.從患有自身免疫病的對象中除去自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異性結(jié)合的配體，其中所述配體與支持物結(jié)合；(b)將來自所述對象的含有T細(xì)胞的樣品與所述結(jié)合支持物的配體接觸足夠的時間以允許自身免疫性T細(xì)胞與所述結(jié)合支持物的配體相結(jié)合；和(c)將所述支持物與所述樣品分離。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其還包括將步驟(c)的樣品返回到所述對象。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述配體是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8 聚體、9聚體或10聚體。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述支持物是珠、芯片、濾器、蘸棒、膜、聚合物基質(zhì)或孑L。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述樣品是血液、腦脊液或精液。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述樣品是血液，所述血液獲得自所述對象，經(jīng)離體處理并返回到所述對象。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中在閉合回路中將所述血液灌注通過所述結(jié)合支持物的配體并返回到所述對象。
19.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其還包括從所述對象獲得所述樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述對象是人或鼠。
21.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述配體是如權(quán)利要求44-63中所述的擬肽。
22.殺死從患自身免疫病對象中獲得的自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異性結(jié)合的配體，其中所述配體與毒素相綴合；和(b)將來自所述對象的含T細(xì)胞的樣品與所述綴合物接觸足夠的時間以允許至少一種自身免疫性T細(xì)胞與所述綴合物結(jié)合；和其中所述綴合物導(dǎo)致所述自身免疫性T細(xì)胞死亡。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中對所述樣品進行離體處理，并且所述方法還包括將所述樣品返回到所述對象。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述配體是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8 聚體、9聚體或10聚體。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述毒素是蓖麻毒素、白喉毒素或霍亂毒素。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述毒素是光活化毒素。
28.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述光活化毒素是三-聯(lián)吡啶基釕(II)，并且步驟 (b)還包括將所述樣品暴露于可見光。
29.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述樣品是血液、腦脊液或精液。
30.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其還包括從所述對象獲得所述樣品。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述對象是人或鼠。
32.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述配體是如權(quán)利要求44-63中所述的擬肽。
33.殺死從患自身免疫病對象中獲得的或者其中的自身免疫性T細(xì)胞的方法，其包括(a)提供與自身免疫性T細(xì)胞特異性結(jié)合的配體，其中所述配體與含有IgGFc的分子綴合；和(b)將自身免疫性T細(xì)胞群與所述綴合物接觸足夠的時間以允許至少一種自身免疫性 T細(xì)胞與所述綴合物結(jié)合；和其中所述綴合物將免疫效應(yīng)物募集至所述自身免疫性T細(xì)胞，導(dǎo)致其死亡。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中對所述自身免疫性T細(xì)胞群進行離體處理，并且所述方法還包括將步驟(b)的樣品返回到所述對象中。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述配體是3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體、8 聚體、9聚體或10聚體。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述含有IgGFc的分子是抗體、單鏈抗體或Fc片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述含有IgGFc的分子是抗體或單鏈抗體，并且所述配體與所述抗體的抗原結(jié)合位點相連接。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述含有IgGFc的分子是缺少IgG可變區(qū)的Fc片段，并且所述擬肽與所述Fc片段的羧基端相連接。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述樣品是血液、腦脊液或精液。
41.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其還包括從所述對象獲得所述樣品。
42.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述對象是人或鼠。
43.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述配體是如權(quán)利要求44-63中的擬肽。
44.擬肽，其具有下式
45.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中η為5。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中Rl是未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、 0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C1-C6烷基；未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6炔基；未取代的或NH2、0H、SH、N(C1_C6 燒基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6烯基。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中Rl是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的擬肽，其中Rl是4氨基丁烷。
49.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R2是未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、 0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C1-C6烷基；未取代的或NH2、OH、SH、N(C1_C6烷基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6炔基；未取代的或NH2、0H、SH、N(C1_C6 燒基)2、0(C1-C6烷基)或S(C1-C6烷基)取代的C2-C6烯基。
50.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R2是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的擬肽，其中Rl是4氨基丁烷。
52.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R3是C1-C6烷基、C2-C6炔基或C2-C6烯基。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的擬肽，其中R3為異丁基。
54.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R4是末端被NH2基團取代的C1-C6烷基。
55.根據(jù)權(quán)利要求M的擬肽，其中R4是4氨基丁烷基團。
56.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R5是㈨-甲基苯甲基基團。
57.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R6是呋喃基基團。
58.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R7是末端被NH2取代的C1-C6烷基。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的擬肽，其中R7是4氨基丁烷基團。
60.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R8是C1-C6烷基。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的擬肽，其中R8是異丁基基團。
62.根據(jù)權(quán)利要求44的擬肽，其中R1、R2、R4和R7是4-氨基丁烷基團；R3和R8是異丁基基團；R5是(R)-甲基苯甲基基團；并且R6是呋喃基基團。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的擬肽，其中R8包括末端賴氨?；?、羥基或羧基。
全文摘要
本發(fā)明提供了對來自患自身免疫病(如多發(fā)性硬化和EAE)個體的自身反應(yīng)性T細(xì)胞群的鑒定。自身反應(yīng)性T細(xì)胞所識別的擬肽可用于鑒定鑒定多種類型的自身免疫病，并且還可以用于對這些群進行靶向治療。
文檔編號G01N33/50GK102449481SQ201080023677
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日
發(fā)明者D·戈米卡·烏杜加馬蘇里亞, 安妮·R·格克, 托馬斯·科達德克 申請人:奧普科健康公司, 德克薩斯大學(xué)系統(tǒng)董事會