專利名稱：在曲霉屬突變細胞中產(chǎn)生多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在毒素缺乏型曲霉屬突變細胞中產(chǎn)生目的多肽的方法。本發(fā)明也涉及曲霉屬細胞的突變株和獲得上述突變細胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來，使用重組宿主細胞表達異源多肽極大地簡化了一些具有經(jīng)濟價值的多肽的大量生產(chǎn)，例如工業(yè)中使用的關(guān)鍵酶和二級代謝物，而使用其他方法會面臨諸多困難，例如多肽的產(chǎn)量較低或者只能從其天然來源純化獲得。現(xiàn)在，已有多種表達系統(tǒng)可供選擇，從中選擇產(chǎn)生任何給定的多肽，這些表達系統(tǒng)包括真細菌和真核生物宿主。選擇一種合適的表達系統(tǒng)經(jīng)常不但取決于宿主細胞在產(chǎn)生足夠量的具有預(yù)期組成和構(gòu)造的多肽方面的能力，而且在很大程度上也取決于目的蛋白的預(yù)期用途。
使用某些宿主系統(tǒng)時遇到的一個問題是真菌毒素的產(chǎn)生。一些真菌可用作宿主細胞來產(chǎn)生目的多肽的一些真菌具有編碼參與多種毒素生物合成的酶的基因。例如，環(huán)匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸和黃曲霉毒素都是已知的毒素，這些毒素可以在例如黃曲霉中生成。同樣，多種真菌中可以產(chǎn)生單端孢菌毒素，例如鐮孢霉屬的一些種如Fusarium venenatum和木霉菌屬。有關(guān)不同真菌中毒素生成的較詳盡的綜述可參見《有毒真菌代謝物手冊》(RichardJ Cole和Richard H.Cox著，Academic Press，1981)。
在目的多肽的發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生此類毒素是很不合乎要求的，因為這些毒素會對操作人員、客戶和環(huán)境帶來健康方面的危害。
其結(jié)果是，人們投入了大量的努力以確保在相關(guān)生產(chǎn)所使用的條件下，產(chǎn)生的毒素的量不會達到被認為會影響健康的水平。這主要是通過使用龐大的分析程序?qū)Χ舅刂苯舆M行分析，并且通過生物檢測和/或投放飼養(yǎng)方面的研究進行。在許多種情況下，每一次批量生產(chǎn)均需進行這些龐大的分析，從而影響了產(chǎn)品造價和產(chǎn)品投放市場的時間。
環(huán)匹阿尼酸(此后也稱為“CPA”)是一種弱酸(pKa3.5)并且在酸性環(huán)境下沉淀。其形成的金屬螯合物可以被稀酸解離。CPA是一種劇毒物質(zhì)，它可以選擇性抑制Ca2+-ATP酶并且比其他毒素更易導致多種器官的退行性改變和壞死。CPA有α和β兩種存在形式，其中β型是α型的前體。CPA產(chǎn)生于曲霉菌，但也可由其他真菌，例如青霉菌產(chǎn)生。
曲酸(此后也稱為“KA”)產(chǎn)生于多種曲霉菌，但也可由其他真菌如青霉菌產(chǎn)生，甚至也產(chǎn)生于一些細菌中。它是一種弱堿(pKa7.9；酚基)，并與多種金屬離子形成復(fù)合物。KA具有抗微生物活性并對動物有微弱毒性。KA是多種合成化合物例如殺蟲劑、染料等的前體。
3-硝基丙酸(此后也稱為“3-NPA”)是一種天然硝基化合物。它產(chǎn)生于多種真菌，特別是曲霉菌(黃曲霉、溫特氏曲霉)和青霉菌(P.Atroventum)。有報道稱在一些細菌中有3-NPA存在。還有報道稱在一些植物中發(fā)現(xiàn)了3-NPA及其酯。3-NPA本身是一種有相當毒性的物質(zhì)，可以導致例如貧血癥的發(fā)生。而且，在胃腸道內(nèi)，3-NPA可以部分地轉(zhuǎn)化為另一有毒的亞硝酸鹽化合物。3-硝基丙酸不可逆地抑制琥珀酸脫氫酶、異檸檬酸鹽裂解酶、延胡索酸酶和天門冬氨酸酶，從而影響三羧酸循環(huán)。
黃曲霉毒素是一種生物活性非常高的二級代謝物，由真菌A.flavus Linkex.Fries和Aspergillus parasiticus Speare產(chǎn)生；參見R.W.Detroy等“黃曲霉毒素及相關(guān)化合物”，《微生物毒素》一書，第6卷(A.Ciegler，S.Kadis和S.J.Ajl編輯)，Academic，New York，1971，3-178頁。主要的黃曲霉毒素包括B1、B2、G1和G2。這些代謝物，特別是黃曲霉毒素B1，不但對動物和人有毒性，而且也是所有已知的天然化合物中最具致癌性的物質(zhì)。
畸形素和赭曲霉素由黑曲霉產(chǎn)生。
通過去除或削弱宿主生物產(chǎn)生毒素的能力，不但可以大大簡化受規(guī)章限制的批準程序，同時也可以節(jié)省消耗在生產(chǎn)階段的時間和金錢，因為可以減少分析程序。
現(xiàn)在，亟需毒素缺乏型曲霉屬突變細胞(也就是優(yōu)選分類為GRAS(一般認為安全)的安全生物)，這種曲霉屬突變細胞適于高效、經(jīng)濟地產(chǎn)生目的多肽。本發(fā)明通過使用毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞產(chǎn)生目的多肽，并且提供了一種構(gòu)建這類突變宿主細胞的方法滿足了該需要。同樣，現(xiàn)在亟需提供曲霉屬突變細胞，其在親代形式中含有一種或多種毒素基因，這些毒素基因不被表達，即沉默基因。
發(fā)明概述依照本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種使用曲霉屬突變宿主細胞產(chǎn)生目的多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)親代曲霉屬細胞的突變株，其中(i)突變株包含第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼所述多肽，第二核酸序列包含對負責至少一種毒素之生物合成或分泌的基因中至少一個基因的修飾，和(ii)所述突變株與親代曲霉屬細胞相比，在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生較少量的所述毒素；和(b)從所述培養(yǎng)物中分離所述多肽。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，突變曲霉屬細胞在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的毒素比親代細胞至少少90％。更優(yōu)選地，突變曲霉屬細胞在相同的培養(yǎng)條件下比親代曲霉屬細胞細胞產(chǎn)生的以下毒素中的一種或幾種少環(huán)匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸和黃曲霉毒素。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了可供產(chǎn)生異源目的多肽的毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞，該宿主細胞經(jīng)過遺傳學修飾使其在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的至少一種毒素少于曲霉屬親代細胞。
本發(fā)明中的曲霉屬突變細胞選自米曲霉、棘孢曲霉、構(gòu)巢曲霉、無花果曲霉、黃曲霉、臭曲霉、醬油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、日本曲霉、寄生曲霉和海棗曲霉。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了一種獲得毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞的方法，該方法包括(a)將編碼目的多肽的第一核酸序列和含有修飾后的至少一種負責至少一種毒素的生物合成或分泌的基因的第二核酸序列引入曲霉屬親代宿主細胞；和(b)從步驟(a)中鑒別出含有核酸序列的突變株。
本發(fā)明另一方面涉及曲霉屬突變細胞，所述曲霉屬突變細胞適于表達異源多肽，其中一個或多個沉默毒素基因已經(jīng)被去除。
在下文的說明書中的詳細描述中概述了這些和其它的一些實施方案。
附圖簡述

圖1顯示了米曲霉DCAT-S基因的基因組限制性酶切圖譜，其中所用的限制性酶為EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用了1kb32P標記的來自含有DCAT-S基因的pJaL499的BglII片段作為探針。
圖2顯示了破壞質(zhì)粒p(DCAT-s-pyrG)的構(gòu)建。
發(fā)明詳述定義對了本申請目的，為了更好的理解本發(fā)明而對以下術(shù)語進行定義。
術(shù)語“載體”表示質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或允許插入、增殖和表達某基因或編碼目的多肽的DNA序列包括其前體形式的其他任何介質(zhì)。
術(shù)語“宿主”表示任何允許表達目的多肽包括其前體形式的任何細胞。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”表示使得異源DNA序列由細胞表達的融入方式。
術(shù)語“突變”宿主(或菌株)表示經(jīng)遺傳學修飾的菌株，其中既包括轉(zhuǎn)化體也包括野生型菌株的突變株。
術(shù)語“毒素”表示有植物毒性、動物毒性和抗生素活性的真菌代謝物。術(shù)語“真菌毒素”一般定義為在暴露水平下對人類和動物的健康造成潛在負面影響的二級真菌代謝物。在本文中，術(shù)語“毒素”和“真菌毒素”可以互換使用。
用以描述本發(fā)明的突變細胞的術(shù)語“毒素缺乏型”表示突變細胞與其親代菌株比較有不完整的毒素產(chǎn)生情況，即突變細胞比其親代細胞產(chǎn)生的至少一種，優(yōu)選一種以上毒素的少。
本發(fā)明方法的步驟(a)中使用的術(shù)語“相同條件”將突變株的毒素產(chǎn)生情況和親代細胞的毒素產(chǎn)生情況相關(guān)聯(lián)，并且意在指出在突變株和親代菌株的發(fā)酵生產(chǎn)過程中使用類似的條件，例如pH值、溫度、氧氣等?？梢栽谟欣诋a(chǎn)生目的多肽的條件下或在有利于產(chǎn)生毒素的條件下，將親代和突變細胞產(chǎn)生所研究毒素的情況進行比較。
宿主細胞本發(fā)明提供了可用以表達目的多肽的曲霉屬宿主細胞的變體，其中細胞經(jīng)過遺傳學修飾使其與親代細胞相比，表達的一種或幾種毒素的水平顯著降低。宿主細胞可源于親代細胞，該細胞可以為野生型細胞。
宿主菌株可以是傳統(tǒng)上用以表達目的多肽的任何曲霉屬宿主細胞。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，用以表達目的多肽的曲霉屬宿主細胞選自下列曲霉屬亞組Eurotium亞組(例如，以局限曲霉為代表)，Chaetosartorya(例如，以淡黃曲霉為代表)，Scleroleista(例如，以華麗曲霉為代表)，Satoia(例如，以黑曲霉為代表)，Neosartorya(例如，以煙曲霉、鹿色曲霉為代表)，Hemicarpenteles(例如，以棒曲霉為代表)，Petromyces(例如，以黃曲霉、白曲霉、稀疏曲霉為代表)，Emericella(例如，以構(gòu)巢曲霉、雜色曲霉、赤褐曲霉為代表)和Fenellia(例如，以土生曲霉為代表)。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，曲霉屬宿主細胞選自米曲霉、棘孢曲霉、無花果曲霉、黃曲霉、臭曲霉、醬油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉和日本曲霉。其中又以米曲霉、黑曲霉、寄生曲霉和海棗曲霉最為優(yōu)選。
本發(fā)明的宿主細胞的上述實例均依照現(xiàn)在公認的分類法命名。
毒素毒素，即根據(jù)本發(fā)明其生產(chǎn)將被減弱或去除，可以是曲霉菌產(chǎn)生的任何毒素或者是那些由存在于曲霉菌中的基因編碼但并不必表達的任何毒素。例如，已知黃曲霉毒素基因亦存在于米曲霉中，但在此種曲霉中并不表達。雖然并不表達，但去除黃曲霉毒素通路基因中的基因仍然是有利的。這將在下文中進一步描述，并在實施例6中詳述。
特別地，將被減弱或去除的毒素選自以下物質(zhì)環(huán)匹阿尼酸(CPA)，例如其α或β形式，曲酸(KA)，3-硝基丙酸(NPA)，大黃素，畸形素(例如畸形素A或B)，黃曲霉毒素，赭曲霉毒素，淺黃霉素，和黑麥酮酸(例如，黑麥酮酸D)。有關(guān)這些毒素的進一步的描述請參閱發(fā)明背景中的相應(yīng)部分，以及此部分所涉及的《有毒真菌代謝物手冊》一書。
本發(fā)明中的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶(DCAT-S)本發(fā)明也涉及由絲狀真菌分離獲得的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶，這種酶選自(a)氨基酸序列為SEQ ID NO2的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶；(b)(a)中所述酶的等位基因變體；和(c)(a)或(b)的酶的片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶活性。
優(yōu)選地，本發(fā)明的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶含有如SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者是其等位基因變體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶含有SEQ ID NO2的氨基酸序列或者其片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶活性。SEQ ID NO2的片段是指在此氨基酸序列的氨基端和/或羧基端缺失了一個或更多氨基酸的多肽。在一個最優(yōu)選的實施方案中，二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
優(yōu)選地，SEQ ID NO2的片段至少有320個氨基酸殘基，而最優(yōu)選至少有350個氨基酸殘基。
等位基因變體是指占據(jù)相同的染色體位點的任何兩個或更多的可以相互替代的基因形式。通過突變可自然產(chǎn)生等位基因變體，并可導致種群中的表型多樣性?；蛲蛔兛梢允浅聊缘?編碼的多肽無變化)或者編碼改變了氨基酸序列的多肽。術(shù)語“多肽的等位基因變體”是指某基因的等位基因變體編碼的多肽。
SEQ ID NO2的氨基酸序列或其部分序列可以用來設(shè)計寡聚核苷酸探針，或編碼本發(fā)明中的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的核酸序列，例如SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列可依照本領(lǐng)域已熟知的方法從其它絲狀真菌菌株中識別和克隆編碼二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的DNA。特別是，依照標準的Southern印記操作法，這類探針可以用來與有關(guān)種屬的基因組或cDNA雜交，從而識別并分離相關(guān)種屬中的相應(yīng)基因。這類探針可比全序列短許多，但至少應(yīng)有15個核苷酸，優(yōu)選至少25個，最優(yōu)選至少40個核苷酸的長度。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針均可使用。為檢測相應(yīng)基因，一般對探針進行標記(例如，使用32P、3H、35S、生物素或親和素標記)。
依照標準的Southern印記操作法，在從低到高的嚴緊度的條件下進行(例如，預(yù)雜交和雜交反應(yīng)條件為42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml變形變性鮭魚精DNA，低、中、高嚴緊度分別在25、35或50％的甲酰胺中進行)的雜交表明，核酸序列與相應(yīng)于SEQ ID NO1所示的核酸序列或pJaL499中所含的多肽編碼部分的寡核苷酸探針雜交。
因此，可以從其他絲狀真菌菌株制備的基因組、cDNA或重組化學文庫中篩選出與上述探針雜交的編碼二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的DNA。來自其他絲狀真菌菌株的基因組或其他DNA可由瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)制備。文庫DNA或分離的DNA可以轉(zhuǎn)移并固定在硝基纖維素或其他合適的載體物質(zhì)上。為了識別克隆或與SEQ IDNO1同源的DNA，在Southern印記中應(yīng)使用載體物質(zhì)，其中所述載體物質(zhì)最終在2×SSC，0.2％SDS中洗3次，每次30分鐘，優(yōu)選溫度至少為50℃，更優(yōu)選至少為55℃，更加優(yōu)選至少為60℃，甚至更優(yōu)選至少為65℃，甚至更加優(yōu)選至少為70℃，和最優(yōu)選至少為75℃。在這些反應(yīng)條件下，使用X-射線膠片檢測與寡聚核苷酸探針雜交的分子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶來源于曲霉屬菌株，更優(yōu)選地來源于米曲霉，例如具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
本文所定義的“分離的”二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶是基本上不含有其他多肽的多肽，例如經(jīng)SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測至少純度達約20％，優(yōu)選至少純度達約40％，更優(yōu)選純度達約60％，甚至更優(yōu)選至少純度達約80％，最優(yōu)選至少純度達約90％，甚至更加最優(yōu)選至少純度達約95％。
本發(fā)明也涉及由絲狀真菌分離獲得的編碼二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的核酸序列，并且在一個優(yōu)選的實施方案中，此核酸序列來源于曲霉屬例如米曲霉，尤其是SEQ ID NO1所述的核酸序列。并且在另一個更為優(yōu)選的實施方案中，核酸序列為質(zhì)粒pJaL499中包含的序列。本發(fā)明也包括由于基因密碼簡并而引起的不同于SEQ ID NO1的核酸序列。本發(fā)明也涉及SEQ ID NO1的亞序列或pJaL499中的多肽編碼部分，此序列編碼的多肽片段有二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶活性。SEQID NO1的亞序列或pJaL499中的多肽編碼部分，是除了在5’末端和/或3’末端缺失了一個或多個核苷酸之外，SEQ ID NO1所包括的核素序列或pJaL499中的多肽編碼部分。優(yōu)選地，SEQ ID NO1的亞序列含有至少870個核苷酸，更優(yōu)選地至少960個核苷酸，而最優(yōu)選地至少含有1050個核苷酸。
核酸序列可由在分類學上與米曲霉相等同的微生物中獲得。
這里描述了用于分離或克隆所述核酸序列的技術(shù)。這里使用的術(shù)語“分離的核酸序列”是指其基本上不含有其他核酸序列的核酸序列，例如經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測至少純度達約20％，優(yōu)選至少純度達約40％，更優(yōu)選純度達約60％，甚至更加優(yōu)選至少純度達約80％，最優(yōu)選至少純度達約90％。核酸序列可以來自于基因組、cDNA、RNA、半合成、合成或以上來源的組合。
對編碼本發(fā)明的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的核酸序列進行修飾對合成與多肽基本類似的酶來說可能是必要的。這里的與二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶“基本類似的”酶是指此酶的非天然形式。這些二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶在乙酰改造方法方面可以不同于由其天然來源所分離出的酶。例如，使用諸如定點誘變的方法，合成此酶的變體可能是有意義的，其中所述變體在特異活性、熱穩(wěn)定性、最適pH值或類似性質(zhì)方面不同?？梢栽谥T如SEQ ID NO1多肽編碼部分給出的核酸序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建同源序列，這些序列包括例如上述序列的亞序列，和/或引入了核苷酸取代的序列，所述取代不會造成核酸序列所編碼的多肽的另一氨基酸序列，而是符合用于生產(chǎn)多肽的宿主生物的密碼子用途，或那些引入了核苷酸取代的序列，該取代不會產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的一般性描述，請參見例如Ford等1991年《蛋白質(zhì)表達和純化》第2期95-107頁。
對于熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，顯然可以在對分子功能至關(guān)重要的區(qū)域外進行上述替換而仍然得到有生物活性的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶。使用本領(lǐng)域已知的操作方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見，例如Cunningham和Wells，1989年《科學》第224期1081-1085頁)可以識別出對二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基(其中二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶是由本發(fā)明中分離的核酸序列編碼的)，因此這些氨基酸殘基優(yōu)選不被取代。在后一種誘變技術(shù)中，在分子中的每一個帶正電荷的殘基上引入突變，對得到的突變分子進行二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶活性的測試，以識別出對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。使用諸如核磁共振分析、結(jié)晶學或光親和性標記技術(shù)對三維結(jié)構(gòu)進行分析，還可以測定底物和酶之間相互作用的位點(參見，例如de Vos等，1992年《科學》第255期306-312頁；Smith等，1992年《分子生物學雜志》第224期899-904頁；Wlodaver等，1992年《FEBS通信》第309期59-64頁)。
本發(fā)明的核酸序列，或其同源序列或其片段的優(yōu)選用途，是去除或減少給定宿主細胞中特別是在米曲霉屬細胞中二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的活性，因而可以去除或降低上述細胞中CPA的產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及用以表達上述序列的含有SEQ ID NO1的核酸序列或pJaL499中多肽編碼部分、其亞序列或或同源序列的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和宿主細胞。構(gòu)建體和載體可以按照本文的描述構(gòu)建。宿主細胞可以是適于表達核苷酸序列的任何細胞，可以是諸如從本文中所述的親代或突變細胞中進行選擇。
宿主細胞的基因修飾為了表達顯著降低了水平的一種或多種毒素，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標準技術(shù)對本發(fā)明中的宿主細胞進行了基因修飾。將負責產(chǎn)生毒素活性的基因序列失活或者部分或完全地去除。因此，本發(fā)明的曲霉屬突變宿主細胞表達一種或多種毒素的水平降低或檢測不到。
在一個特定的實施方案中，對與所選的毒素的形成和分泌有關(guān)的各結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)區(qū)(例如基因)進行修飾，從而達到將其失活目的。已知有效的技術(shù)包括但并不局限于以下技術(shù)特異性或隨機誘變，PCR引發(fā)的誘變，位點特異性DNA缺失、插入和/或取代，基因破壞或基因替換，反義技術(shù)，或以上技術(shù)的組合。
可以使用合適的物理或化學誘變因子達到誘變的效果。適宜于本目的的物理或化學誘變因子包括但并不局限于紫外輻射，電離輻射(例如γ輻射)，羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸(EMS)、亞硫酸氫鈉和核苷酸類似物。但使用上述因子時，一般通過在所選的誘變因子存在下孵育待誘變的細胞，選擇那些目標毒素的產(chǎn)生明顯減少的細胞。
通過修飾與給定毒素的產(chǎn)生或分泌過程有關(guān)或必需的核苷酸序列，同樣可以減少或去除該毒素在宿主細胞中的產(chǎn)生。例如，核苷酸序列可以編碼的基因產(chǎn)物對于導致毒素產(chǎn)生的通路內(nèi)具有必要的功能。例如，這樣的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或pJaL499中的編碼多肽部分。修飾可以通過在核苷酸序列中引入、取代或去除一個或多個核苷酸或通過序列轉(zhuǎn)錄、翻譯中必需的調(diào)控元件而完成。例如，可以插入或去除核苷酸以引入終止密碼子、去除起始密碼子或改變核苷酸序列的開放讀碼框?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的定點或隨機誘變或PCR引發(fā)誘變的方法實現(xiàn)對序列或其調(diào)控元件的修飾或失活。雖然從原則上來說，可以在體內(nèi)條件下即直接在表達毒素基因的細胞中完成上述修飾，但目前優(yōu)選的是如下文描述的那樣在體外進行修飾。
使所選的絲狀真菌細胞中目的毒素如CPA失活或減少的方便方法的實例是基于基因替換、基因缺失或基因破壞技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，相應(yīng)于目的內(nèi)源型基因或基因片段的核酸序列(例如本發(fā)明中的DCAT-3基因)在體外被誘變產(chǎn)生缺陷型核酸序列，并將此缺陷型核酸序列轉(zhuǎn)化入親代細胞中從而產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組，缺陷型核酸序列取代了內(nèi)源型基因或基因片段。一般來說希望缺陷型基因或基因片段同樣編碼一個標記物，該標記物可以用于對核酸序列已被修飾或被破壞的轉(zhuǎn)化體進行篩選。
做為另一種選擇，可以使用與基因的核酸序列互補的核苷酸序列通過已確立的反義技術(shù)進行基因的修飾或失活。更確切地，可以引入與基因的核酸序列互補的核苷酸序列減少或去除絲狀真菌細胞中此基因的表達，互補核苷酸序列可以在細胞中轉(zhuǎn)錄并能夠與細胞中產(chǎn)生的mRNA相雜交。在允許互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯產(chǎn)生的蛋白的量因此減少或消除。
在誘變或其他修飾毒素通路的基因后，篩選毒素產(chǎn)生減弱或去除的突變株。如何對毒素進行篩選的方法在以下實施例中給出。另一方面，合適的篩選分析方法在《有毒真菌代謝物手冊》中有述，或者從經(jīng)常檢測諸如食品中真菌毒素含量的機構(gòu)處獲得。
因此，由于基因修飾，本發(fā)明曲霉屬突變宿主細胞中毒素的表達水平顯著降低。在一個優(yōu)選實施方案中，突變宿主細胞中這些毒素的表達水平分別降低了大于約50％，優(yōu)選大于約85％，更優(yōu)選大于約90％，最優(yōu)選大于約95％，或甚至更優(yōu)選大于99％。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明曲霉屬突變宿主細胞中的這些毒素在任何組合下均有降低。在一個進一步的具體實施例中，宿主細胞所表達的產(chǎn)物基本上不含下列毒素的至少一種環(huán)匹阿尼酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黃素，畸形素，黃曲霉毒素，赭曲霉素和黑麥酮酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞所表達的產(chǎn)物基本上不含下列毒素的至少一種環(huán)匹阿尼酸，更特別地至少不含環(huán)匹阿尼酸和曲酸或黃曲霉毒素，而最優(yōu)選地至少不含環(huán)匹阿尼酸、曲酸和3-硝基丙酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是減少或去除了NPA、CPA、曲酸(KA)或麥芽米曲霉素中的至少一種毒素的產(chǎn)生的米曲霉菌株，優(yōu)選地為這些毒素中的至少兩種，例如NPA和CPA；NPA和KA；CPA和KA；或NPA、CPA和KA。而且，除了減少或去除了至少一種所述毒素的產(chǎn)生之外，優(yōu)選地，所選的黃曲霉毒素通路的基因也被失活，從而使得所得的突變菌株不能產(chǎn)生黃曲霉毒素。黃曲霉中的黃曲霉毒素基因已經(jīng)被充分認識，并可以用來識別米曲霉中的相應(yīng)基因，此后可用本領(lǐng)域已知的方法將其失活。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是減少或去除了一種或幾種畸形素(例如，畸形素A1或B)，一種赭曲霉素(例如，赭曲霉素A)和淺黃霉素生產(chǎn)的黑曲霉或無花果曲霉，優(yōu)選地為所述毒素的至少兩種，例如畸形素和赭曲霉素；畸形素和淺黃霉素；赭曲霉素和淺黃霉素；以及畸形素、赭曲霉素和淺黃霉素的菌株。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是減少或去除了一種或多種黑麥酮酸(例如，黑麥酮酸D)或者大黃素(黑麥酮酸D的前體)的產(chǎn)生，優(yōu)選地為所述類型毒素的兩種的生產(chǎn)同時被減少或去除的棘孢曲霉菌株。
產(chǎn)生多肽的方法根據(jù)本發(fā)明的方法，某些目標毒素的量顯著減少，然而突變宿主細胞的特性，即在經(jīng)遺傳修飾的編碼目的多肽的基因在細胞中的穩(wěn)定保持性，細胞的生產(chǎn)能力和目的細胞的產(chǎn)量基本上被保持。更具體地說，根據(jù)本發(fā)明的方法，宿主細胞在產(chǎn)生或分泌一種或多種目的毒素所必需的結(jié)構(gòu)和/或調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)經(jīng)過了遺傳修飾，因此去除或減少了所述毒素的產(chǎn)生或分泌。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種在本發(fā)明所述的曲霉屬突變宿主細胞中產(chǎn)生多肽或蛋白的方法，其中包括異源型多肽或蛋白，該方法包括將編碼目的多肽的核酸序列引入上述突變宿主細胞中，在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變宿主細胞，以及回收上述目的多肽。
因此，根據(jù)本發(fā)明的突變宿主細胞必須含有表達目的多肽所必需的結(jié)構(gòu)和/或調(diào)節(jié)基因區(qū)。這類必需結(jié)構(gòu)和/或調(diào)節(jié)基因區(qū)的本質(zhì)在很大程度取決于目的產(chǎn)物和獨特的曲霉屬宿主菌株。為了對宿主細胞進行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用標準的重組DNA技術(shù)完成本發(fā)明的宿主細胞的遺傳設(shè)計(參見，例如Sambrook等的文章)。
優(yōu)選地，應(yīng)通過本領(lǐng)域已知的方法對宿主細胞進行修飾，以便引入合適的克隆媒介(即質(zhì)?；蜉d體)，克隆媒介中含有編碼所需目的多肽的DNA片段?？寺∶浇榧瓤梢宰鳛樽灾鲝?fù)制質(zhì)粒被引入宿主細胞，也可以整合入染色體內(nèi)。更優(yōu)選地，克隆媒介含有與一個或多個合適的調(diào)節(jié)區(qū)域可操作相連的一個或多個結(jié)構(gòu)區(qū)域。
結(jié)構(gòu)區(qū)域是編碼目的多肽的核苷酸序列。調(diào)節(jié)區(qū)域包括含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的啟動子區(qū)域，含有終止信號的終止子區(qū)域，以及多聚腺苷酸區(qū)域。啟動子即在所選宿主細胞中表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列，可以來源于編碼胞外或胞內(nèi)蛋白的基因，優(yōu)選是來源于編碼酶的基因，所述酶例如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、木聚糖酶、氧化還原酶、果膠酶、角質(zhì)酶或糖酵解酶。在本發(fā)明的方法中，用于引導核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的實例是得自編碼下列酶的基因的啟動子，所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖孢鐮孢菌胰島素樣蛋白酶(美國專利第4,288,627)，以及上述啟動子的突變株、截斷體和雜合啟動子。特別優(yōu)選的啟動子是NA2-tpi啟動子(是源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶基因的啟動子和源于編碼米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)、葡糖淀粉酶啟動子和TAKA淀粉酶啟動子。
克隆媒介也可以含有選擇性標記。選擇性標記是一個基因，該基因的產(chǎn)物提供抗生素或病毒抗性，重金屬抗性，微生物由原養(yǎng)型向營養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)變以及類似的特性。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記可以選自但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸鹽腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)和trpC(氨基苯甲酸鹽合成酶)，以及來源于其他物種的上述選擇性標記的等價物。優(yōu)選用于曲霉屬細胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉中的amdS和pyrG基因，和吸水鏈霉菌中的bar基因。
而且，可以通過共轉(zhuǎn)化實現(xiàn)選擇目的，其中以兩種載體的混合物轉(zhuǎn)化宿主細胞而只對一種載體進行選擇。
用于分別連接本發(fā)明中的DNA構(gòu)建體、啟動子、終止子和其他元件的操作法，以及將它們插入到合適的含有復(fù)制必需信息的克隆媒介的操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如Sambrook等，1989年；同前)。
使用本領(lǐng)域已知的方法，將突變絲狀真菌細胞在適合產(chǎn)生目的多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，細胞可以在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中使用搖動燒瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)(包括連續(xù)、批量、分批加料或固相發(fā)酵)的方式培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件應(yīng)使異源多肽可被表達和/或被分離。培養(yǎng)應(yīng)在含有碳源、氮源和無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行，使用的方法為本領(lǐng)域已知的操作方法。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)途徑獲得，也可以依照已經(jīng)公開的配方制備而成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的配方)。分泌的多肽可以直接從培養(yǎng)基中回收獲得。
多肽可以使用本領(lǐng)域已知的多肽特異性的方法進行檢測。這些檢測方法可包括使用特異性抗體，酶產(chǎn)物的形成，酶底物的消失，或SDS-PAGE。例如，可以使用酶學分析的方法檢測多肽的活性。對于多種酶來說，確定酶活性的操作法是本領(lǐng)域已知的。
產(chǎn)生的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法進行分離。例如，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離多肽的傳統(tǒng)操作包括，但并不局限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、揮發(fā)或沉淀。分離得到的多肽可以再通過各種本領(lǐng)域已知的操作方法進一步純化，這些方法包括，但并不局限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)，電泳操作(例如，制備型等電聚焦電泳)，差示溶解性(例如，硫酸銨沉淀法)或抽提法(參見，例如《蛋白質(zhì)純化》J.-C.Janson和Lars Ryden，編輯，VCH出版商，紐約，1989)。
產(chǎn)物所需的最終產(chǎn)物，即由曲霉屬突變宿主細胞表達的目的多肽，可以是任何同源或異源性的蛋白或多肽。
多肽可以是變異絲狀真菌細胞的任何異源性多肽。這里的術(shù)語“多肽”并不指某一特定長度的編碼產(chǎn)物，而是包含多種多肽、寡肽和蛋白。異源性多肽也可以是某多肽經(jīng)工程改造后的突變株。這里術(shù)語“異源性多肽”是指那些并不來源于絲狀真菌細胞的多肽。突變絲狀真菌細胞可以含有一個或多個拷貝的編碼這種異源性多肽的核酸序列。
在本發(fā)明的方法中，突變絲狀真菌細胞也可以用來重組產(chǎn)生與細胞天然存在的多肽。該天然存在的多肽可以通過以下重組的方式得到例如，將編碼多肽的基因置于不同啟動子的控制之下，以增強多肽的表達，通過使用信號序列而促進目的天然多肽分泌到細胞外，以及增加編碼通常由細胞所產(chǎn)生的多肽的基因的拷貝數(shù)而增加肽的產(chǎn)量。在術(shù)語“異源性多肽”涉及的范圍內(nèi)，本發(fā)明也包括上述經(jīng)重組方式產(chǎn)生的同源性多肽，所述范圍應(yīng)使得這類表達包括使用細胞異源性遺傳元件，或使用同源元件但該同源元件經(jīng)過改造從而與其在宿主細胞內(nèi)通常行使的功能有所不同。
在一個更具體的實施方案中，產(chǎn)物是有治療活性的多肽或蛋白，例如激素，特別是胰島素、生長激素、胰高血糖素或促生長素抑制素；白細胞介素，特別是干擾素；造血生長因子，特別是PDGF(血小板源性生長因子)，EPO(促紅細胞生成素)或TPO(血栓生成素)；蛋白酶，特別是因子VII、因子VIII、尿激酶、凝乳酶或TPA(組織纖溶酶原激活物)；或者血清白蛋白。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)物是真菌或細菌源性的酶。優(yōu)選地，此酶是一種糖苷酶，例如淀粉酶，特別是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶；葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶；氨基肽酶；糖酶；羧肽酶；過氧化氫酶；纖維素酶，特別是內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶或內(nèi)-1，3(4)-β-葡聚糖酶；纖維素-1，4-β-纖維二糖苷酶；殼多糖酶；角質(zhì)酶；環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；脫氧核糖核酸酶；半乳糖酶；半乳糖苷酶，特別是α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶；內(nèi)葡聚糖酶，特別是內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶、內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶或內(nèi)-1，6-β-葡聚糖酶；葡糖苷酶，特別是α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶；轉(zhuǎn)化酶；蟲漆酶；分解脂肪酶，特別是脂肪酶、酯酶、磷脂酶或溶血磷脂酶；裂解酶或果膠酸酯分解酶；甘露聚糖酶；甘露糖苷酶；多聚半乳糖醛酸酶；(鏈球菌)齒斑葡聚糖酶；氧化酶或氧化還原酶，例如過氧化物酶或多酚氧化酶；加氧酶；膠質(zhì)酶，肽鏈內(nèi)切酶或肽鏈外切酶；肌醇六磷酸酶；多聚半乳糖醛酸酶；蛋白酶；核糖核酸酶；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；以及木聚糖酶，特別是內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶或木聚糖-內(nèi)-1，3-β-木聚糖苷酶。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)物是一種雜合多肽，例如凝乳酶原和原胰島素樣蛋白酶。在諸如缺乏顯著的蛋白酶活性這樣的合適條件下，由宿主細胞表達的異源性蛋白也可以是一種前體蛋白，例如酶原、雜合蛋白、作為原序列或前-原序列得到的蛋白，或者任何其他未成熟的形式。
參照以下實施例進一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)以任何方式將這些實施例解釋為對所附權(quán)利要求書所限定的范圍的限制。
去除了沉默毒素基因的曲霉屬突變株在產(chǎn)生黃曲霉毒素的兩個種黃曲霉和寄生曲霉中，對黃曲霉毒素的生物合成途徑已經(jīng)進行了多年的研究。在這兩個物種中識別出了許多基因，這些基因顯示出其圖譜在一個大的簇內(nèi)(參見Woloshuk，C.P和Prieto，R，《FEMS微生物學通信》(1998)160169-176中的綜述)。其中的一些基因已被克隆和測序，其中包括編碼調(diào)控通路基因中其他基因表達的aflR基因，以及編碼O-甲基轉(zhuǎn)移酶的omtA基因。
黃曲霉毒素基因存在于米曲霉的基因組中，但在這個物種中并不表達。雖然黃曲霉毒素并不被表達，但去除一個或更多這樣的沉默黃曲霉毒素通路基因仍然是有利的。去除了黃曲霉毒素基因如aflR和/或omtA的曲霉屬突變株例如米曲霉突變株是有利的，因為這樣就不必檢測新的突變株中所述黃曲霉毒素的產(chǎn)生情況。
因此，本發(fā)明的一方面涉及適宜表達異源性多肽并且去除了一個或更多沉默毒素基因的曲霉屬突變細胞。
沉默毒素基因已經(jīng)被“去除”是指正在討論的基因已被改變或刪除，例如通過本領(lǐng)域已熟知的基因替代或基因破壞技術(shù)(參見，例如Miller等，1985年《分子和細胞生物學》第1714-1721頁)，所采用的方式應(yīng)使得突變細胞中不含有上述沉默基因。
術(shù)語“沉默”毒素基因是指毒素基因不被表達。
可以使用不可逆轉(zhuǎn)的缺失或破壞全部或部分毒素基因的方法去除毒素基因。
術(shù)語“不可逆轉(zhuǎn)的缺失或破壞全部或部分毒素基因”是指所討論的毒素基因或者已經(jīng)被去除，或者已經(jīng)一定的方式加以改變從而使得上述基因不能編碼毒素且不能自然地回復(fù)突變，例如在產(chǎn)生編碼毒素的基因期間。
所討論的曲霉屬細胞可以是上文已提及的任何一種，可以選自以下曲霉屬亞組Eurotium，Chaetosartorya，Sclerocleista，Satoia，Neosartorya，Hemicarpenteles，Petromyces，Emericella和Fenellia。
所討論的編碼一個或更多毒素的毒素基因包括選自以下毒素的毒素環(huán)匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸、大黃素、畸形素、黃曲霉毒素、赭曲霉素和黑麥酮酸。
具體考慮的是編碼黃曲霉毒素的毒素基因，特別是源于米曲霉黃曲霉毒素簇的毒素基因，特別是選自以下基因omtA、aflR、pksA、Nor-1、fas-beta、fas-alpha、vber-1、avnA、ord-2。
親代曲霉屬細胞可以是米曲霉細胞，特別是米曲霉A1560(IFO 0417)。
實驗材料和方法1.菌株米曲霉A1560與IFO 04177一致(見下)。
米曲霉A1560 IFO 4177來自Institute for Fermentation，Osaka；17-25Juso Hammachi 2-Chome Yodogawaku，Osaka，Japan；還參見WO 98/12300。
JaL228米曲霉菌株，其中用于中性金屬蛋白酶—NpI的基因被破壞；在WO 98/12300中有關(guān)于該菌株構(gòu)建的描述。
BECh 1在實施例1中有關(guān)于該CPA陰性的米曲霉菌株構(gòu)建的描述。
BECh 2在實施例1中有關(guān)于該CPA陰性和KA陰性的米曲霉菌株構(gòu)建的描述。
BECh 3在實施例1中有關(guān)于該CPA陰性和KA陰性的米曲霉菌株構(gòu)建的描述。
BZ14在WO 92/17573中有關(guān)于與ToC90和phD450進行共轉(zhuǎn)化的米曲霉A1560菌株的描述。
JaL250在實施例6中有關(guān)于該米曲霉菌株構(gòu)建的描述。
保藏含有pJaL499質(zhì)粒的大腸桿菌菌株于1999年1月13日保藏在德國微生物保藏中心，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，保藏號為DSM12622。
2.基因DMAT-S該基因編碼二甲基烯丙基-L-色氨酸合成酶，該酶參與麥角生物堿的生物合成。
DCAT-S該基因編碼二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶，該酶參與環(huán)匹阿尼酸(CPA)的生物合成。
pyrG該基因編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶，該酶參與尿嘧啶核苷的生物合成。
3.質(zhì)粒pAHL在WO 97/07202中有該質(zhì)粒的描述。
PCaHj483在WO 98/00529中有該質(zhì)粒的描述。
pCaHj493在實施例2中有該質(zhì)粒的描述。
pJaL335在WO 98/12300中有該質(zhì)粒的描述。
pJaL499在實施例4中有該質(zhì)粒的描述。
4.培養(yǎng)基和溶液用作緩沖液和底物的化學藥品均為至少為試劑級的商品。
篩選培養(yǎng)基1(每升)甘露醇 30g葡萄糖 10g琥珀酸 10g酪蛋白氨基酸 3gKH2PO41gMgSO4*7H2O 0.3gFeSO4*7H2O 0.2g2，6-二氯-4-苯胺 2ppm瓊脂 20g以14％NH4OH調(diào)節(jié)最終pH值到5.6。
CoveNCove鹽溶液 50ml山梨糖醇 218g右旋葡萄糖 10g硝酸鉀 2.02g瓊脂 35g去離子水 1000mlCOVE鹽溶液(每升)KCl26gMgSO426gKH2PO476g痕量金屬溶液50mlCHCl32ml痕量金屬溶液(每1升)Na2B4O7*10H2O 40mgCuSO4*5H2O 400mgFeSO4*7H2O 800mg
MnSO4*2H2O 800mgNa2MoO4*2H2O 800mgZnSO4*7H2O 8000mgGl-gly酵母提取物 18g87％甘油 24mlPluronic PE61001ml以自來水補至1000ml1/5 MDU-2BP麥芽糖 9gMgSO4*7H2O 0.2gNaCl 0.2gK2SO40.4gKH2PO42.4g酵母提取物 1.4gAMG痕量金屬0.1mlPluronic PE61000.02ml去離子水補至 1000ml最終pH值為5.0；接種前加入1.0ml 50％尿素。
MDU-IB(每1升)麥芽糖糊精MD0l 45.0gMgSO4*7H2O 1.0gNaCl 1.0gK2SO42.0gKH2PO412.0g酵母提取物 7.0gAMG痕量金屬0.5mlPluronic PE61001ml最終調(diào)節(jié)pH值到5.0；接種前加入1.3ml 50％尿素/100ml培養(yǎng)基。
AMG痕量金屬溶液(每1升)FeSO4*7H2O13.9gMnSO4*2H2O8.45gZnCl26.8gCuSO4*5H2O2.5gNiCl2*6H2O2.5g檸檬酸 ＞＝3.0g痕量金屬溶液 1mlKM2培養(yǎng)基(每1升)酵母提取物25gK2HPO410gMgSO4*7H2O0.5gKCl 0.5gFeSO40.01g葡萄糖 100g檸檬酸 ＞＝3.0g最終調(diào)節(jié)pH值到6.0；若用于固體培養(yǎng)板，則用20g/L瓊脂固化KMZ培養(yǎng)基。
加入300μl/L Triton X-100作為克隆生長限制制劑。
Nakamura培養(yǎng)基(每1升)蔗糖 50g蛋白胨 20gKH2PO45gCaHPO42.5gMgSO42.5g最終調(diào)節(jié)pH值到6.4。
5.檢測分析A.使用HP毛細管電泳法檢測CPA的操作為進行毛細管電泳(CE)分析，首先通過固相提取法在一個SupelcleanLC-18 SPE管(預(yù)裝3ml來自Supelco的柱，目錄號為5-7012，用2ml甲醇和2ml Milli-Q水進行調(diào)節(jié))中制備1ml等分試樣。使用抽吸多支管(suctionmanifold)迫使液體通過柱子。使用3ml Milli-Q水沖洗后，用3ml甲醇洗脫樣品。洗脫物不需進一步處理可直接用于CE分析。偶爾會出現(xiàn)沉淀，但通過離心法去除。
使用惠普光電二極管陣列CE-儀器(3D-CE)進行CE分析。以34mbar的靜水壓用10秒的時間將樣品注入。使用30℃下的50mm的毛細管(有效長度為56cm)，該毛細管用0.1M NaOH處理1分鐘，接著用100mM硼酸鹽/NaOH pH9.1處理5分鐘。將電壓設(shè)定為17KV。始終收集紫外光譜以確定峰值，但同樣過程在280nm下進行。以商購的環(huán)匹阿尼酸作為標準物(SigmaCo.出產(chǎn)，St.Louis MO，USA，目錄號C1530，最低純度98％)。此方法的靈敏度下限約為1ppm。
B.使用薄層層析法(TLC)檢測CPA的操作1.平板培養(yǎng)的分析在Filtenborg O.，F(xiàn)risvad J.C.和Svendsen JA.所著的“純凈培養(yǎng)基中對產(chǎn)生霉菌的細胞內(nèi)真菌毒素的簡易篩選方法”(參見《應(yīng)用和環(huán)境微生物學》一書1983年45581-585頁)中，對瓊脂平板的分析作了描述。
2.液體培養(yǎng)物的分析在TLC平板(Merck Silica Gel 60)兩對邊各上上清液樣品10μl。等分試樣的環(huán)匹阿尼酸(Sigma，C1530)用體積比為1∶2的甲醇∶氯仿混合液稀釋成50ppm、25ppm、5ppm和2.5ppm的標準溶液。首先，平板在CAP溶液(體積比為氯仿∶丙酮∶丙-2-醇＝85∶15∶20)中展開15分鐘，干燥，翻轉(zhuǎn)，另一半在TEF(體積比為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶4∶1)中繼續(xù)展開15分鐘。
另一種方法是將平板在EMA溶液(體積比為乙酸乙酯∶甲醇∶25％氫氧化銨＝16∶8∶2)中和TEF溶液中按上述方法各展開15分鐘。
將平板在通風櫥中徹底干燥(1小時)，然后噴灑上Ehrlich試劑(將2g 4-二甲氨基苯甲醛溶解在85ml 96％乙醇中，隨后再加入15ml 37％的鹽酸)。
在CAP體系(一種中性體系)中，CPA看上去是藍紫色的蘑菇形小斑點，有典型的低遷移率；而酸性TEF體系在上樣點和展開劑前沿之間產(chǎn)生典型的延長形污跡。在EMA體系中(堿/堿體系)，環(huán)匹阿尼酸聚集成為密集的小斑點。
對平板直接的視覺觀察，濃度大于等于2.5ppm的CPA看上去為紫色區(qū)域形涂污或斑點(依賴于展開體系的不同)。在臺式平臺掃描儀上對TLC平板進行掃描，然后在合適的圖像加工程序中增強電子圖像(在這種情況下使用的是Paint Shop Pro 4)，可以使靈敏度增加5倍到10倍。
該分析的總靈敏度(不提取)約為0.5-1ppm CPA；使用提取物增加靈敏度至少10倍。
C.使用毛細管電泳法檢測曲酸的操作制備1-3ml等分試樣用于在一個Supelclean LC-18 SPE管(預(yù)裝3mlSupelco柱，目錄號為5-7012)通過固相提取法進行毛細管電泳(CE)分析，用甲醇、10mM硼酸鹽/NaOH、4M KCl pH9.1進行調(diào)理。使用抽吸多支管迫使流體通過柱子。使用3ml 10mM硼酸鹽/NaOH、4M KCl pH9.1和0.3ml 10mM硼酸鹽/NaOHpH9.1沖洗后，用7.5ml 10mM硼酸鹽/NaOH pH9.1洗脫樣品。洗脫物不需進一步處理可直接用于CE分析，根據(jù)上述對于環(huán)匹阿尼酸的操作進行。偶爾會出現(xiàn)沉淀，但可以通過離心法去除。此方法的靈敏度下限約為6ppm。
D.使用薄層層析法檢測曲酸的操作按上述對于CPA的方法，在TLC平板兩對邊上各上等分試樣，并使用與CPA相同的溶液體系展開。干燥后的平板噴灑上1％FeCl3的0.1M HCl溶液。樣品中的曲酸的存在通過紅色斑點顯示出來，且與作為對照而施用的純曲酸產(chǎn)生的紅色斑點的強度相比較。該檢測的靈敏度下限約為50ppm。
E.使用毛細管電泳法檢測3-硝基丙酸(3-NPA)的操作用于毛細管電泳(CE)分析的樣品是否需要經(jīng)過純化取決于樣品的傳導性。如果傳導性低于10mS，樣品通過在Varian SAX陰離子交換器(VarianInstruments，Palo Alto CA)進行離子交換并使用0.1M KCl作為洗脫緩沖液純化。如果傳導性高于100mS，樣品需使用2-丁醇提取液提取，其中用酸化/高鹽處理樣品使其沉淀，并再溶于pH 7.0 10mM Tris/HCl中，用6毫升丁醇提取2ml樣品。
使用HP-CE儀器的二極管陣列檢測，于30℃使用未包被二氧化硅的50微米毛細柱(有效長度為56cm)，調(diào)節(jié)緩沖液為25mM硼酸鹽/磷酸鹽pH7.6。以靜態(tài)水壓用20秒的時間將樣品注入。設(shè)定電壓為30KV。該方法的靈敏度下限為6ppm。
F.使用薄層層析法檢測3-硝基丙酸(3-NPA)的操作在TLC平板上用發(fā)酵液點樣，并使用用于CPA相同的方法展開。按照W.Maiak和R.J.Bose在“分離米瑟毒苷和檢測脂肪族硝基化合物的層析方法”(《植物化學》1974年131005-1010頁)中所述的方法，在其上噴灑上重氮化的對-硝基苯胺。斑點相對于對照物的強度和位置是3-NPA濃度的量度。TLC平板上的檢測水平為25-50ppm。
另一種方法是，在100μl樣品中加入50μl 1M NaOH和70μl重氮化的對-硝基苯胺，通過分光光度法對3-NPA進行分析。檢測水平為5-10ppm。
實施例1A.米曲霉Bz 14的CPA陰性菌株的構(gòu)建凍干的米曲霉Bz 14菌株芽孢經(jīng)過最適劑量的γ-射線的照射，劑量范圍在1000Gy到1250Gy，然后將這些芽孢以25-50個菌落/9cm平板的密度鋪板在篩選培養(yǎng)基1的平板上。產(chǎn)生環(huán)匹阿尼酸的菌落由于有紅色不溶性CPA-Fe復(fù)合物存在而在篩選培養(yǎng)基1上形成紅色反面(菌落的底面)。
從照射后的芽孢中篩選出了大約50,000個菌落并且分離出了154個CPA缺陷型菌落，這些菌落的特點是有奶油色/白色的外觀。在再次分離后，64個菌株在篩選培養(yǎng)基1的平板上仍然保持非紅色外觀。使用TLC-plug(平板)分析法，在52個菌株中未檢測到CPA。然后將這些菌株在MDU-1B培養(yǎng)基中在毒素誘導(34℃，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)5天)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。使用TLC進行檢測，36個菌株的上清液中不存在可檢測水平的CPA。
B.來自米曲霉JaL228的CPA陰性菌株-BECh 1的構(gòu)建凍干的JaL228芽孢經(jīng)過γ-射線照射，并且以上述方法篩選。待確定的無CPA的分離株在毒素誘導條件下(34℃，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)5天)在搖瓶中的MDU-1B培養(yǎng)基上生長，使用TLC方法檢測上清液中的CPA。檢測可以在上清液中直接進行或在上清液提取物中進行。
若使用提取方法，用10ml 0.1M的HCl酸化50ml總樣品。然后將該混合物與70ml甲醇/氯仿(1∶2)混合后劇烈振搖3-5分鐘。分相后(約3小時)，將底層相(大約25ml)轉(zhuǎn)移到一個300ml的燒杯中使氯仿?lián)]發(fā)。剩余物再溶于5ml氯仿中并轉(zhuǎn)移到一個25ml的燒杯中使氯仿?lián)]發(fā)。殘余物溶于100μl氯仿中。
在TLC平板(20cm×20cm)兩對邊上各上10μl樣品上清液或氯仿提取物，并按前一章所述的分析方法進行處理。
包括BECh在內(nèi)的3個分離株不產(chǎn)生CPA。
C.CPA陰性和KA陰性菌株，BECh2和BECh3的構(gòu)建將BECh1生長在CoveN的斜面培養(yǎng)基中。在0.01％的Tween中懸起芽孢至密度為3-5×106，并進行短波紫外輻射(254nm，殺菌燈)。在下面的篩選中使用紫外劑量輻射的芽孢，該劑量使得1-5％存活。
輻射后的芽孢在KM2培養(yǎng)基中稀釋到約0.7個芽孢/100μl，取100μl接種到96孔微量滴定板的每一個孔中。在34℃的濕箱中靜止培養(yǎng)培養(yǎng)物5-7天。向每孔中加入40μl溶于0.1M HCl中的1％FeCl3作為生長指示劑。
出現(xiàn)強烈的紅色代表產(chǎn)生了曲酸(KA)；沒有顏色代表菌落不能產(chǎn)生曲酸。
作為可供選擇的另一方法，芽孢鋪板于固化的KM2培養(yǎng)基上(在有Triton x-100下限制性生長)并在成熟菌落出現(xiàn)時將平板用0.1M HCl中的1％FeCl3浸沒。在菌落周圍沒有紅色區(qū)域代表推定的不產(chǎn)生曲酸。
從約7000個微量滴定培養(yǎng)板培養(yǎng)物中分離了132個推定不含KA的菌落，即與FeCl3不發(fā)生顏色反應(yīng)的菌落。然而當在初級KM2篩選瓊脂板上測試時，沒有一個菌落被確定為KA陰性。
隨后，對固態(tài)培養(yǎng)基上和靜止液態(tài)KM2培養(yǎng)基(30℃)中的陰性菌落再在KA誘導條件下在液體培養(yǎng)基中進行檢測，KA陰性突變株的數(shù)目降到11個。當在搖瓶中檢測這些菌株的時候，其中的8個菌株產(chǎn)生KA。剩余的3個菌株在其上清液上直接進行的分析中不產(chǎn)生顏色反應(yīng)且用TLC檢測時也沒有鹽酸反應(yīng)。正如所料想的一樣，當生長在同時平行培養(yǎng)基中時，對照菌株BECh1會產(chǎn)生KA。分離株中的一個表現(xiàn)出異常的形態(tài)。剩余的兩個分離株在MDU-1B中延長培養(yǎng)后對CPA和KA產(chǎn)生情況進行再測試。結(jié)果是CPA和KA均未檢測得到。這兩個菌株命名為BECh2和BECh3。
D.已為CPA陰性和KA陰性的3-NPA陰性米曲霉菌株的構(gòu)建BECh2和BECh3菌株各自按上述方法進行紫外誘變。輻射后的芽孢在96孔微量滴定板中稀釋到約0.7個活芽孢/100μl Nakamura培養(yǎng)基。在30℃的濕箱中培養(yǎng)5-7天。
孔中生長的發(fā)酵肉湯樣品或者轉(zhuǎn)移到新的微孔板中并使用分光光度法分析，或者應(yīng)用于TLC平板中。3-NPA陰性的菌株在搖瓶中用Nakanura培養(yǎng)基再培養(yǎng)并對3-NPA產(chǎn)生情況進行分析。仍為3-NPA陰性的菌株依照實施例2中的方法用pCaHj493進行轉(zhuǎn)化，如實施例3所述對轉(zhuǎn)化體進行處理。
實施例2
米曲霉菌株JAL228和BECh1中脂肪酶的表達A.質(zhì)粒pCaHj493的構(gòu)建用BamHI和SalI消化脂肪酶質(zhì)粒pAHL(WO 97/07202)，分離獲得916bp的編碼脂肪酶的片段。
按WO 98/00529中所述，pCaHj 483用BamHI和XhoI進行消化，將6757bp的載體片段與脂肪酶片段相連。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞，分離得到含有所需質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。此質(zhì)粒命名為pCaHj493。
B.將pCaHj493轉(zhuǎn)化入JaL228和BECh-1菌株中按EP-A-0531372中所述，用在乙酰胺進行篩選的方法將pCaHj493轉(zhuǎn)化入米曲霉菌株JaL228和BECh1。轉(zhuǎn)化體經(jīng)過兩次芽孢再分離。在搖瓶和微量滴定板培養(yǎng)物中栓測每個轉(zhuǎn)化體第二次再分離的芽孢的脂肪酶產(chǎn)生情況。
實施例3A.CPA陰性和CPA陽性米曲霉菌株中脂肪酶的產(chǎn)生檢測搖瓶培養(yǎng)物中按實施例2所述方法制備的18個JaL228轉(zhuǎn)化體和30個BECh1轉(zhuǎn)化體的脂肪酶的產(chǎn)生情況。
用10ml 0.1％的Tween溶液收獲轉(zhuǎn)化體的Cove N斜面培養(yǎng)物，芽孢懸液用作100mlGl-Gly培養(yǎng)基中的接種物并置于500ml的雙擋板搖瓶中。將培養(yǎng)基在旋轉(zhuǎn)搖動器上在250轉(zhuǎn)/分，34℃下培養(yǎng)24小時。然后將10ml Gl-Gly培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到500ml搖瓶中的100ml1/5MDU-2BP中并在34℃，250轉(zhuǎn)/分下繼續(xù)培養(yǎng)。
50小時后取出樣品，通過Miracloth過濾并在4000×g下離心。用簡單放射免疫擴散的方法(見Scand.J.Immuno.Vol.17，suppl.10，41-56頁，(1983)“免疫沉淀凝膠技術(shù)技術(shù)手冊”，N.HAxelsen編輯，Blackwell ScientificPublications，1983)檢測上清液中脂肪酶的濃度(以LU/ml表示)。
30個CPA陰性BECh1轉(zhuǎn)化體的脂肪酶產(chǎn)量等于或高于18個JaL228CPA陽性轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)量。下表2給出了分布的概況圖。
B.CPA陰性和CPA陽性米曲霉菌株中木聚糖酶的產(chǎn)生使用不可檢測到CPA產(chǎn)生的10個菌株(實施例1A中制備)和3個可檢測到CPA的菌株進行有關(guān)木聚糖酶產(chǎn)生的評價。結(jié)果總結(jié)在下表1中。第2列表示以真菌木聚糖酶單位(FXU)的形式表示的搖瓶培養(yǎng)物中木聚糖酶含量，檢測方法是通過簡單放射免疫擴散的方法(見Scand.J.Immuno.Vol.17，suppl.10，41-56頁，(1983)“免疫沉淀凝膠技術(shù)手冊”，N.H.Axelsen編輯，Blackwell Scientific Publications)。
結(jié)果顯示CPA陰性的菌株可以產(chǎn)生與CPA陽性菌株可比的木聚糖酶量。
表1
＜2＝低于檢測限C.CPA陰性和KA陰性菌株中脂肪酶的產(chǎn)生按照實施例2所述的方法用質(zhì)粒pCaHj493對兩個無CPA和KA的米曲霉菌株BECh2和BECh3進行轉(zhuǎn)化。分離轉(zhuǎn)化體的芽孢兩次。按照實施例2所述，檢測來自每個菌株的第二次再分離得到的芽孢的脂肪酶產(chǎn)生情況。
表2顯示了來自這兩個菌株的脂肪酶產(chǎn)量的概率分布情況。與米曲霉菌株BECh1和JaL228的產(chǎn)量相比，結(jié)果表明并沒有潛在的表達退化現(xiàn)象發(fā)生。
從與用于脂肪酶生產(chǎn)培養(yǎng)物相同的芽孢懸液中，對用于CPA生產(chǎn)的MDU1B搖瓶進行接種，并按上述方法培養(yǎng)5天。依照5B2部分進行DPA分析。BECh1菌株無一產(chǎn)生CPA而18株JaL228菌株中的17株產(chǎn)生高于25ppm的CPA，大多數(shù)菌株的CPA產(chǎn)量在100ppm以上。
表2
實施例4米曲霉DCAT-S基因的識別和基因組克隆A.米曲霉二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶(DCAT-S)基因的識別cDNA克隆(pJaL499)含有SEQ ID NO1中所示的DNA序列，由于該序列與麥角菌的二甲基烯丙基色氨酸合成酶(DMAT-S)同源而被認為參與了CPA的生物合成。米曲霉cDNA克隆的測序顯示其長度為1393個堿基對(SEQID NO1)并編碼含473個氨基酸的多肽(SEQ ID NO2)，該多肽與麥角菌的DMAT-S有42.1％相同。
米曲霉DCAT-S多肽參與了由環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸和二甲基烯丙基焦磷酸鹽合成β-CPA的過程(見Nethling D.C.和R.M.McGrath，《Can.J.Microbiol.》(1977)23856-872頁)。
制備了JaL228和BECh1菌株的染色體DNA。該DNA經(jīng)過BglII、NcoI、XhoI和SpeI的消化并通過Southern印記法進行分析，使用1kb的32P標記的來源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作為探針。Southern印記分析表明產(chǎn)生CPA的JaL228菌株有1個DCAT-S基因，而在BEChl中DCAT-S基因已經(jīng)從染色體中缺失。
B.DCAT-S基因的基因組克隆使用以下限制酶作出米曲霉DCAT-S基因的基因組限制酶圖譜EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用1kb的32P標記的來源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作為探針(圖1)。此圖表明其只有一個拷貝的DCAT-S基因。
JaL228的基因組DNA或者用Tsp509I進行部分消化，或者在0.7％的瓊脂糖凝膠上進行。純化大小在7到10kb之間的片段。
按照生產(chǎn)商(Stragtagene)提供的操作手冊將純化的DNA克隆入Lambda ZAP II中。體內(nèi)切下并再環(huán)化Lambda載體中所含的任何克隆插入體，并按照生產(chǎn)商提供的指南構(gòu)建含有插入克隆的用作DNA文庫的嗜菌粒。采用菌落雜交的方法，使用1kb的32P標記的來源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作為探針來篩選編碼DCAT-S基因的克隆，此方法在標準的方法教科書中有概述(例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis編輯(1989)“分子克隆實驗室手冊”，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。
實施例5通過基因破壞方法破壞米曲霉二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶(DCAT-S)產(chǎn)生米曲霉CPA陰性菌株使用米曲霉pyrG基因作為篩選標記，在米曲霉pyrG-菌株中用一步基因替換方法破壞DCAT-S基因(B.L.Miller等，《分子和細胞生物學》(1985)51714-1721頁，和G.May，《絲狀真菌應(yīng)用分子遺傳學》，1-25頁；J.R.Kinghorn和G.Turner編輯；Blakie Academic and Professional，1992)。
A.DCAT-S基因破壞質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL499經(jīng)過SacII消化并用Klenow多聚酶進行處理形成鈍端，按生產(chǎn)商(Boehringer Mannheim)提供的指南用細菌堿性磷酸酶去除5’磷酸酯基，然后用苯酚提取并沉淀。
按WO 98/12300所述，質(zhì)粒pJaL335經(jīng)過HindIII消化以獲得含有米曲霉pyrG基因的3.5kb片段，用Klenow多聚酶片段處理以形成鈍端，通過凝膠電泳進行分離并純化。在轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，用mini-plasmid preparation的限制酶消化，鑒定含有合適質(zhì)粒的菌落。圖2總結(jié)了DCAT-S破壞質(zhì)粒(pDCAT-S-pyrG)的構(gòu)建過程。
B.PyrG-米曲霉菌株JaL250的分離篩選對5-氟-乳清酸有抗性的米曲霉菌株JaL228以識別自然產(chǎn)生的pyrG突變株。一個命名為JaL250的菌株被鑒定為PyrG-。該突變株為尿嘧啶核苷依賴性的，因此其可以用野生型的pyrG基因進行轉(zhuǎn)化并通過在缺乏尿嘧啶核苷下生長的能力來篩選轉(zhuǎn)化體。
C.米曲霉DCAT-S-菌株的構(gòu)建按照Christensen等在《生物技術(shù)》(1988)61419-1422所述方法，將質(zhì)粒pDCAT-S-pyrG的4.9kb的NotI-EcoRI片段經(jīng)過凝膠純化，并用于轉(zhuǎn)化米曲霉菌株JaL250。然后通過其在缺乏尿嘧啶核苷下的生長能力來篩選轉(zhuǎn)化體。再分離兩次后，按照實施例1所述的方法依其產(chǎn)生CPA的能力篩選轉(zhuǎn)化體。
為了確定DCAT-S基因已經(jīng)被破壞，從不產(chǎn)生CPA的轉(zhuǎn)化體制備染色體DNA。制得的DNA經(jīng)過EcoRI的消化并用于Southern印記分析，使用1kb的32P標記的來源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作為探針。通過基于6.3kb的野生型EcoRI帶遷移到基于9.8kb的EcoRI帶，識別出帶有DCAT-S基因破壞的轉(zhuǎn)化體。
實施例6BECh1和BECh2缺少黃曲霉毒素生物合成通路簇中的兩個基因的確定找到了米曲霉IFO4177和其許多衍生物中的黃曲霉毒素生物合成通路簇中存在的aflR和omtA黃曲霉毒素基因。通過PCR的方法從基因組DNA中分離得到米曲霉IFO4177中aflR的同源序列，引物為5956(5’-GGATCCAGGGCTCCCTGGAG-3’)(SEQ ID NO3)和5955(5’-CCTGACCAGCCAGATCTCCT-3’)(SEQ ID NO4)。獲得了一種0.9kb的PCR片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2載體中。使用M13正向(-40)和反向引物對所得質(zhì)粒pToC280進行測序，從而確定克隆的該片段的同一性。omtA的同源序列也通過PCR的方法從基因組IFO4177 DNA中分離得到，引物為6120(5’-AGTGAGAGAACTCCCTCCTC-3’)(SEQ ID NO5)和6121(5’-CCATATCTTCTCAGTCTCCA-3’)(SEQ ID NO6)。獲得了一種1.2kb的片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2載體中，對所得的質(zhì)粒pToC276進行測序，使用M13正向(-40)和反向引物以確認所克隆的片段的同一性。
aflR和omtA的克隆片段作為32P標記的探針用于雜交試驗中。IFO4177、pJaL228、BECh1和BECh2的基因組DNA均經(jīng)過限制酶EcoRI消化，產(chǎn)生的片段在0.7％的瓊脂糖凝膠中分離。將DNA印記到膜上并在嚴緊的條件下與兩個32P標記的探針分別雜交(方法見J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis編輯(1989)“分子克隆實驗室手冊”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。印記表明對來自IFO4177和JaL228的兩種探針均為陽性雜交信號，而含有BECh1和BECh2 DNA的泳道沒有可見的條帶。使用omtA探針可見IFO4177和JaL228泳道上有約3.8kb的片段，使用aflR探針可見約為0.5和4.3kb的兩個帶。
結(jié)果為，米曲霉IFO4177中含有至少兩個來自黃曲霉毒素生物合成通路的基因，即aflR和omtA基因。在黃曲霉和寄生曲霉中分離得到的基因約為32kb(Woloshuk，C.P.和Prieto，R，《FEMS微生物學通信》(1998)160169-176頁)。在IFO4177的衍生物BECh1和BECh2中均不存在這些基因。
這里所述并要求保護的本發(fā)明并不局限于這里公開的特定實施方案的范圍，因為這些實施方案是用來對本發(fā)明的幾個方面進行說明。任何相當?shù)膶嵤┓桨敢矐?yīng)包括在本專利所涉及的范圍內(nèi)。事實上，通過前述描述，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在本文所示出并描述之外的本發(fā)明的各種修飾是顯而易見的。這些修飾也落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
這里引用了各類參考文獻，將其公開內(nèi)容的全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生目的多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)親代曲霉屬細胞的突變株，其中(i)該突變株含有編碼多肽的第一核酸序列，和(ii)在相同的培養(yǎng)條件下，突變株比親代曲霉屬細胞產(chǎn)生更少的至少一種相關(guān)毒素；和(b)從培養(yǎng)基中分離多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中突變株產(chǎn)生較少的毒素的原因是修飾了至少一種負責毒素生物合成或分泌的基因。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中突變株在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的所述毒素至少比親代細胞少90％。
4.權(quán)利要求1-3中的任一方法，其中毒素選自環(huán)匹阿尼酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黃素，畸形素，黃曲霉毒素，赭曲霉毒素和黑麥酮酸。
5.以上權(quán)利要求中的任一方法，其中突變株在相同的培養(yǎng)條件下與親代曲霉屬細胞相比，產(chǎn)生較少的環(huán)匹阿尼酸和至少一種第二類毒素。
6.權(quán)利要求5的方法，其中第二類毒素為曲酸或黃曲霉毒素。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中突變株在相同的培養(yǎng)條件下比親代曲霉屬細胞相比，產(chǎn)生較少的3-硝基丙酸。
8.以上權(quán)利要求中的任一方法，其中曲霉屬細胞選自以下曲霉屬亞組Eurotium亞組，Chaetosartorya亞組，Sclerocleista亞組，Satoia亞組，Neosartorya亞組，Hemicarpenteles亞組，Petromyces亞組，Emericella亞組和Fenellia亞組。
9.以上權(quán)利要求中的任一方法，其中目的多肽源于曲霉屬宿主細胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在相同的培養(yǎng)條件下與由親代曲霉屬宿主細胞中表達情況相比，目的多肽被曲霉屬突變宿主細胞過表達。
11.權(quán)利要求1到8中的任一方法，其中目的多肽不源于曲霉屬宿主細胞。
12.以上權(quán)利要求中的任一方法，其中多肽選自激素或其前體形式、酶或其變體或前體形式、抗體或其功能性片段、受體或其功能性片段，以及報道體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中酶選自氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、蟲漆酶、脂肪酶、裂解酶、果膠酸酯分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、(鏈球菌)齒斑葡聚糖酶、氧化酶、加氧酶、果膠酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以及木聚糖酶。
14.一種用以生產(chǎn)目的異源多肽的毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞，該突變細胞經(jīng)過遺傳學改造使其在相同的培養(yǎng)條件下與親代曲霉屬細胞相比產(chǎn)生較少的至少一種毒素。
15.權(quán)利要求14的突變細胞，其包含編碼目的多肽的第一核酸序列和含有包含對負責毒素之生物合成或分泌的基因中至少一個基因的修飾的第二核酸序列。
16.權(quán)利要求14或15的突變細胞，其中細胞含有至少兩個拷貝的第一核酸序列。
17.權(quán)利要求14到16中的任一突變細胞，其中目的多肽源于突變細胞。
18.權(quán)利要求14到16中的任一突變細胞，其中目的多肽不源于突變細胞。
19.權(quán)利要求13到18中的任一突變細胞，其中毒素選自環(huán)匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸、大黃素、畸形素、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和黑麥酮酸。
20.權(quán)利要求13到19中的任一突變細胞，其中毒素包括第一類毒素，即環(huán)匹阿尼酸和選自曲酸、3-硝基丙酸和黃曲霉毒素的第二類毒素。
21.獲得權(quán)利要求13到20中任一項所定義的毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞的方法，該細胞在至少一種目的毒素的產(chǎn)生過程中有缺陷，所述方法包括(a)誘變親代細胞，和(b)篩選減少或去除了目的毒素產(chǎn)生的突變細胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中誘變?yōu)殡S機誘變。
23.權(quán)利要求22的方法，其中誘變是特異的，其目的是修飾參與或在目的毒素的產(chǎn)生或分泌中所必需的核苷酸序列。
24.權(quán)利要求22的方法，該方法包含將含有修飾后的至少一種負責毒素生物的合成或分泌的基因的核酸序列引入曲霉屬宿主細胞，以便在介導與相應(yīng)的宿主細胞的天然基因同源重組的條件下使所述基因失活，從而用無活性的改造基因替換天然基因。
25.權(quán)利要求21到24中的任一方法，進一步包括將編碼目的多肽的核酸序列引入親代曲霉屬宿主細胞中。
26.權(quán)利要求25的方法，其中目的多肽源于曲霉屬細胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中目的多肽不源于曲霉屬細胞。
28.獲得權(quán)利要求13到20中任一項所定義的毒素缺乏型曲霉屬突變宿主細胞的方法，該方法包含(a)將編碼目的多肽的第一核酸序列和含有修飾后的至少一種負責至少一種毒素的生物合成或分泌的基因的第二核酸序列引入曲霉屬親代宿主細胞；和(b)從步驟(a)中鑒別出含有核酸序列的突變株。
29.權(quán)利要求28的方法，進一步包括在引入第一和第二核酸序列之前或之后誘變曲霉屬親代宿主細胞。
30.權(quán)利要求29的方法，其中誘變通過一步或多步完成，所述步驟選自特異性或隨機誘變，PCR引發(fā)的誘變，位點特異性DNA缺失、插入和/或取代，基因破壞或基因替換技術(shù)和反義技術(shù)。
31.編碼二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶的核酸序列，基本如SEQ ID NO1所示。
32.權(quán)利要求31的核酸序列或其活性片段在破壞絲狀真菌宿主菌株中類似基因中的用途。
33.權(quán)利要求32的用途，其中絲狀真菌宿主菌株選自曲霉屬、木霉屬、青霉屬和鐮孢霉屬。
34.由米曲霉菌株獲得的分離的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶，選自(a)氨基酸序列基本為SEQ ID NO2的二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶；(b)(a)的等位基因變體；和(c)具有二甲基烯丙基-環(huán)乙酰乙?；?L-色氨酸合成酶活性的(a)或(b)的片段。
35.適宜表達異源多肽的曲霉屬突變細胞，其中去除了一個或多個沉默毒素基因。
36.權(quán)利要求35的突變細胞，其中通過不可逆缺失或破壞全部或部分毒素基因的方法去除了一個或多個毒素基因。
37.權(quán)利要求35或36中的任一突變細胞，其中曲霉屬細胞選自下列曲霉屬亞組中的一種Eurotium亞組，Chaetosartorya亞組，Sclerocleista亞組，Satoia亞組，Neosartorya亞組，Hemicarpenteles亞組，Petromyces亞組，Emericella亞組和Fenellia亞組。
38.權(quán)利要求35-37中的任一突變細胞，其中的毒素基因編碼一種或多種毒素，所述毒素選自環(huán)匹阿尼酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黃素，畸形素，黃曲霉毒素，赭曲霉毒素和黑麥酮酸。
39.權(quán)利要求35-38中的任一突變細胞，其中所述毒素基因編碼黃曲霉毒素。
40.權(quán)利要求35-39中的任一突變細胞，其中毒素基因源于米曲霉黃曲霉毒素簇的毒素基因，特別是選自omtA、aflR、pksA、Nor-1、fas-beta、fas-alpha、vber-1、avnA、ord-2。
41.權(quán)利要求40的突變細胞，其中親代曲霉屬細胞是一種米曲霉，特別是米曲霉A1560(IFO0417)。
42.權(quán)利要求41的突變細胞，其中黃曲霉毒素基因選自omtA和aflR。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的多肽的方法,其包括(a)培養(yǎng)親代曲霉屬細胞的突變株,其中(ⅰ)所述突變株包含第一核酸序列和第二核酸序列,其中第一核酸序列編碼所述多肽,第二核酸序列包含對負責至少一種毒素之生物合成或分泌的基因中至少一個基因的修飾,(ⅱ)所述突變株與親代曲霉屬細胞相比,在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生較少量的所述毒素;(b)從所述培養(yǎng)物中分離所述多肽。本發(fā)明還提供了曲霉屬細胞的突變株,以及獲得這些突變細胞的方法。
文檔編號C12N9/42GK1333837SQ99815766
公開日2002年1月30日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者比約恩·E·克里斯坦森, 亨里克·莫爾加爾德, 斯文德·卡斯加爾德, 簡·萊姆貝克 申請人:諾維信公司